Name: toxicity screens in human retinal organoids for pharmaceutical discovery
Uploaded: 2021-03-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Toxicity Screens in Human Retinal Organoids for Pharmaceutical Discovery at JoVE.com

Med stöd av Lowy Medical Research Institute. Vi vill tacka familjen Lowy för deras stöd till MacTel-projektet. Vi vill tacka Mari Gantner, Mike Dorrell och Lea Scheppke för deras intellektuella bidrag och hjälp med att förbereda manuskriptet.

1. Upptining, passering och utvidgning av iPSC/ESC
OBS: För alla cellodlingssteg, använd bästa praxis för att upprätthålla en steril cellkultur.
<ol><li>Belägg en 6-brunns cellodlingsplatta med basalmembranmatrismedium.<ol><li>För att förbereda 1x av detta medium, följ produktspecifikationerna eller späd 75 μL kallt matrismedium med 9 ml DMEM / F12. Tillsätt 1,5 ml nyberedd 1x medium per brunn i en 6-brunnsplatta. Inkubera vid 37 °C i 30 minuter.</li>
		<li>Aspirera från basal...

<ol>
	<li>Waring, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+attrition+of+drug+candidates+from+four+major+pharmaceutical+companies.">An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies.</a> Nature Review Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).</li><li>Khalil, A. S., Jaenisch, R., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+tissues+and+strategies+to+overcome+challenges+in+drug+development.">Engineered tissues and strategies to overcome challenges in drug development.</a> Advances in Drug Delivery Reviews. 158, 116-139 (2020).</li><li>Demetrius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+men.+When+it+comes+to+studying+ageing+and+the+means+to+slow+it+down,+mice+are+not+just+small+humans.">Of mice and men. When it comes to studying ageing and the means to slow it down, mice are not just small humans.</a> EMBO Reports. , 39-44 (2005).</li><li>Lindsay, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyruvate+kinase+and+aspartate-glutamate+carrier+distributions+reveal+key+metabolic+links+between+neurons+and+glia+in+retina.">Pyruvate kinase and aspartate-glutamate carrier distributions reveal key metabolic links between neurons and glia in retina.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111 (43), 15579-15584 (2014).</li><li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+types+of+the+human+retina+and+its+organoids+at+single-cell+resolution.">Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).</li><li>Kruczek, K., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids+for+disease+modeling+and+development+of+therapies.">Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies.</a> Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).</li><li>Sinha, D., Phillips, J., Phillips, M. J., Gamm, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+retinal+development+and+disease+with+human+pluripotent+stem+cells.">Mimicking retinal development and disease with human pluripotent stem cells.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (5), 1-9 (2016).</li><li>Gan, L., Cookson, M. R., Petrucelli, L., La Spada, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Converging+pathways+in+neurodegeneration,+from+genetics+to+mechanisms.">Converging pathways in neurodegeneration, from genetics to mechanisms.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1300-1309 (2018).</li><li>Aung, K. Z., Wickremasinghe, S. S., Makeyeva, G., Robman, L., Guymer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+estimates+of+macular+telangiectasia+type+2:+the+Melbourne+collaborative+cohort+study.">The prevalence estimates of macular telangiectasia type 2: the Melbourne collaborative cohort study.</a> Retina. 30 (3), 473-478 (2010).</li><li>Chew, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ciliary+neurotrophic+factor+on+retinal+neurodegeneration+in+patients+with+macular+telangiectasia+type+2:+A+randomized+clinical+trial.">Effect of ciliary neurotrophic factor on retinal neurodegeneration in patients with macular telangiectasia type 2: A randomized clinical trial.</a> Ophthalmology. 126 (4), 540-549 (2019).</li><li>Gass, J. D., Blodi, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Idiopathic+juxtafoveolar+retinal+telangiectasis.+Update+of+classification+and+follow-up+study.">Idiopathic juxtafoveolar retinal telangiectasis. Update of classification and follow-up study.</a> Ophthalmology. 100 (10), 1536-1546 (1993).</li><li>Klein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+macular+telangiectasia+type+2+in+the+Beaver+Dam+eye+study.">The prevalence of macular telangiectasia type 2 in the Beaver Dam eye study.</a> American Journal of Ophthalmology. 150 (1), 55-62 (2010).</li><li>Powner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Muller's+cells+and+photoreceptors+in+macular+telangiectasia+type+2.">Loss of Muller's cells and photoreceptors in macular telangiectasia type 2.</a> Ophthalmology. 120 (11), 2344-2352 (2013).</li><li>Gantner, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine+and+lipid+metabolism+in+macular+disease+and+peripheral+neuropathy.">Serine and lipid metabolism in macular disease and peripheral neuropathy.</a> New England Journal of Medicine. 381 (15), 1422-1433 (2019).</li><li>Scerri, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analyses+identify+common+variants+associated+with+macular+telangiectasia+type+2.">Genome-wide analyses identify common variants associated with macular telangiectasia type 2.</a> Nature Genetics. 49 (4), 559-567 (2017).</li><li>Alecu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+1-deoxysphingolipids+are+metabolized+by+a+cytochrome+P450-dependent+pathway.">Cytotoxic 1-deoxysphingolipids are metabolized by a cytochrome P450-dependent pathway.</a> Journal of Lipid Research. 58 (1), 60-71 (2017).</li><li>Othman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fenofibrate+lowers+atypical+sphingolipids+in+plasma+of+dyslipidemic+patients:+A+novel+approach+for+treating+diabetic+neuropathy.">Fenofibrate lowers atypical sphingolipids in plasma of dyslipidemic patients: A novel approach for treating diabetic neuropathy.</a> Journal of Clinical Lipidology. 9 (4), 568-575 (2015).</li><li>Ohlemacher, S. K., Iglesias, C. L., Sridhar, A., Gamm, D. M., Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+highly+enriched+populations+of+optic+vesicle-like+retinal+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of highly enriched populations of optic vesicle-like retinal cells from human pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 32, 1-20 (2015).</li><li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+three-dimensional+retinal+tissue+with+functional+photoreceptors+from+human+iPSCs.">Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs.</a> Nature Communication. 5, 4047 (2014).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li><li>Wahlin, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+outer+segment-like+structures+in+long-term+3D+retinas+from+human+pluripotent+stem+cells.">Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells.</a> Science Reports. 7 (1), 766 (2017).</li><li>Capowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+and+staging+of+3D+human+retinal+organoids+across+multiple+pluripotent+stem+cell+lines.">Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines.</a> Development. 146 (1), (2019).</li><li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+system+for+effective+derivation+of+three-dimensional+retinal+tissue+via+Wnt+signaling+regulation.">An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation.</a> Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).</li><li>Ovando-Roche, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+bioreactors+for+culturing+human+retinal+organoids+improves+photoreceptor+yields.">Use of bioreactors for culturing human retinal organoids improves photoreceptor yields.</a> Stem Cell Research Therapy. 9 (1), 156 (2018).</li></ol>

Variationer i differentieringsprotokoll Sedan uppfinningen av självbildande optiska koppar av Yoshiki Sasais grupp20 har många laboratorier utvecklat protokoll för att generera retinala organoider som kan variera vid nästan varje steg 5,18,19,21. En uttömmande förteckning över protokoll finns i Capowski m.fl.22. Differen...

Modellering av mänskliga sjukdomar i cellodling och djurmodeller har gett ovärderliga verktyg för upptäckt, modifiering och validering av farmakologiska terapier, vilket gör det möjligt för dem att gå vidare från läkemedelskandidat till godkänd terapi. Även om en kombination av in vitro- och icke-humana in vivo-modeller länge har varit en kritisk komponent i läkemedelsutvecklingspipelinen, misslyckas de ofta med att förutsäga den kliniska prestandan hos nya läkemedelskandidater1. Det finns ett tydligt behov av att utveckla teknik som överbryggar klyftan mellan förenklade humana cellulära monokulturer och kliniska prövningar. De senaste tekniska framstegen inom självorganiserade tredimensionella vävnadskulturer, organoider, har förbättrat deras trohet mot vävnaderna de modellerar vilket gör dem lovande verktyg i den prekliniska läkemedelsutvecklingspipeline2.
En stor fördel med human cellodling jämfört med icke-humana in vivo-modeller är förmågan att replikera de specifika komplikationerna i mänsklig metabolism som kan variera avsevärt även mellan ryggradsdjur av högre ordning som människor och möss3. Denna specificitet kan emellertid överskuggas av en förlust i vävnadskomplexitet; Så är fallet för retinal vävnad där flera celltyper är intrikat sammanvävda och har ett unikt symbiotiskt metaboliskt samspel mellan cellulära subtyper som inte kan replikeras i en monokultur4. Mänskliga organoider, som tillhandahåller en faksimil av komplexa mänskliga vävnader med tillgänglighet och skalbarhet för cellodling, har potential att övervinna bristerna i dessa sjukdomsmodelleringsplattformar.
Retinala organoider härrörande från stamceller har visat sig vara särskilt trogna när det gäller att modellera den komplexa vävnaden i den mänskliga neurala näthinnan5. Detta har gjort retinal organoidmodell till en lovande teknik för studier och behandling av retinal sjukdom 6,7. Hittills har mycket av sjukdomsmodelleringen i retinala organoider fokuserat på monogena retinala sjukdomar där retinala organoider härrör från iPSC-linjer med sjukdomsframkallande genetiska varianter7. Dessa är i allmänhet mycket penetrerande mutationer som manifesterar sig som utvecklingsfenotyper. Mindre arbete har effektivt gjorts på åldrande sjukdomar där genetiska mutationer och miljöstressorer påverkar vävnad som har utvecklats normalt. Neurodegenerativa åldrande sjukdomar kan ha komplexa genetiska arv och bidrag från miljöstressorer som i sig är svåra att modellera med hjälp av kortvariga cellkulturer. Men i många fall kan dessa komplexa sjukdomar sammanfalla på vanliga cellulära eller metaboliska stressfaktorer som, när de testas på en fullt utvecklad mänsklig vävnad, kan ge kraftfulla insikter i neurodegenerativa sjukdomar i åldrande8.
Den sena debuterande makuladegenerativa sjukdomen, makulat telangiektasi typ II (MacTel), är ett bra exempel på en genetiskt komplex neurodegenerativ sjukdom som sammanfaller på en gemensam metabolisk defekt. MacTel är en ovanlig retinal degenerativ åldringssjukdom som resulterar i fotoreceptor och Müller glia förlust i makula, vilket leder till en progressiv förlust i central vision 9,10,11,12,13. I MacTel driver ett obestämt, möjligen multifaktoriellt, genetiskt arv en vanlig minskning av cirkulerande serin hos patienter, vilket resulterar i en ökning av en neurotoxisk lipidart som kallas deoxisfingolipider (deoxySL) 14,15. För att bevisa att ackumulering av deoxySL är giftigt för näthinnan och för att validera potentiella farmaceutiska terapier utvecklade vi detta protokoll för att analysera fotoreceptortoxicitet i humana retinala organoider14.
Här skisserar vi ett specifikt protokoll för att differentiera humana retinala organoider, upprätta en toxicitets- och räddningsanalys med hjälp av organoider och kvantifiera resultat. Vi ger ett framgångsrikt exempel där vi bestämmer den vävnadsspecifika toxiciteten hos ett misstänkt sjukdomsframkallande medel, deoxySL, och validerar användningen av ett säkert generiskt läkemedel, fenofibrat, för potentiell behandling av deoxySL-inducerad retinal toxicitet. Tidigare arbete har visat att fenofibrat kan öka nedbrytningen av deoxySL och sänka cirkulerande deoxySL hos patienter, men dess effektivitet för att minska deoxySL-inducerad retinal toxicitet har inte testats16,17. Även om vi presenterar ett specifikt exempel kan detta protokoll användas för att utvärdera effekten av valfritt antal metabola / miljömässiga stressorer och potentiella terapeutiska läkemedel på retinal vävnad.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125mL Erlenmeyer Flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89095-258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-deoxysphinganine</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>860493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement, minus vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaver 6900 Mini-Blade</td>
			<td>Beaver-Visitec</td>
			<td>BEAVER6900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo-fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit Ig-G, Alexa Fluor plus 555</td>
			<td>Thermo-fisher</td>
			<td>A32794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS, Heat Inactivated</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45001-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fenofibrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11684795910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, growth factor reduced</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR 1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 16% Formaldehyde</td>
			<td>Thermo-fisher</td>
			<td>28906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Recoverin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W302600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Plus- O.C.T. compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Cryomold</td>
			<td>EMS</td>
			<td>62534-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment 6 well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>29443-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment 75cm2 U-Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filtration System</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10040-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield-mounting medium</td>
			<td>vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wax pen-ImmEdge</td>
			<td>vector Labs</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 Dihydrochloride (Rock inhibitor)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

toxicity screens in human retinal organoids for pharmaceutical discovery

Organoider ger en lovande plattform för att studera sjukdomsmekanism och behandlingar, direkt i samband med mänsklig vävnad med mångsidighet och genomströmning av cellodling. Mogna humana retinala organoider används för att screena potentiella farmaceutiska behandlingar för den åldersrelaterade retinala degenerativa sjukdomen makulat telangiektasi typ 2 (MacTel).
Vi har nyligen visat att MacTel kan orsakas av förhöjda nivåer av en atypisk lipidart, deoxisfingolipider (deoxySLs). Dessa lipider är giftiga för näthinnan och kan driva fotoreceptorförlusten som uppstår hos MacTel-patienter. För att screena läkemedel för deras förmåga att förhindra deoxySL-fotoreceptortoxicitet genererade vi humana retinala organoider från en icke-MacTel-inducerad pluripotent stamcellslinje (iPSC) och mognade dem till en postmitotisk ålder där de utvecklar alla neuronala härstamningshärledda celler i näthinnan, inklusive funktionellt mogna fotoreceptorer. De retinala organoiderna behandlades med en deoxySL-metabolit och apoptos mättes inom fotoreceptorskiktet med användning av immunhistokemi. Med hjälp av denna toxicitetsmodell screenades farmakologiska föreningar som förhindrar deoxySL-inducerad fotoreceptordöd. Med hjälp av en riktad kandidatmetod bestämde vi att fenofibrat, ett läkemedel som vanligtvis föreskrivs för behandling av högt kolesterol och triglycerider, också kan förhindra deoxySL-toxicitet i näthinnans celler.
Toxicitetsskärmen identifierade framgångsrikt ett FDA-godkänt läkemedel som kan förhindra fotoreceptordöd. Detta är ett direkt angripbart resultat på grund av den mycket sjukdomsrelevanta modellen som testats. Denna plattform kan enkelt modifieras för att testa valfritt antal metaboliska stressfaktorer och potentiella farmakologiska ingrepp för framtida behandlingsupptäckt i näthinnesjukdomar.

Retinala organoider genererades från en icke-MacTel-kontroll iPSC-linje. Efter att organoider nått 26 veckor i kultur valdes de ut och delades upp i experimentella grupper. Organoider behandlades med varierande koncentrationer av deoxySA för att avgöra om deoxySA är giftigt för fotoreceptorer. Fyra koncentrationer av deoxySA testades, från 0 till 1 μM (figur 2) och organoider behandlades i 8 dagar, med medieförändringar varannan dag. Celldöd som svar på deoxySA är koncentrations...

Watch this Scientific Journal Video about Toxicity Screens in Human Retinal Organoids for Pharmaceutical Discovery at JoVE.com

Toxicity Screens in Human Retinal Organoids for Pharmaceutical Discovery

Här presenterar vi ett steg-för-steg-protokoll för att generera mogna humana retinala organoider och använda dem i en fotoreceptortoxicitetsanalys för att identifiera läkemedelskandidater för den åldersrelaterade retinala degenerativa sjukdomen makulär telangiektasi typ 2 (MacTel).

Toxicitetsskärmar i humana retinala organoider för farmaceutisk upptäckt

Organoids provide a promising platform to study disease mechanism and treatments, directly in the context of human tissue with the versatility and ...

Detta protokoll ger ett prekliniskt tillvägagångssätt för att upptäcka och validera farmaceutiska behandlingar för de metaboliska näthinnesjukdomarna direkt i mänsklig näthinnevävnad. Denna teknik kombinerar komplexiteten i ämnesomsättningen i mänskliga vävnader med mångsidigheten och genomströmningen av cellodling. Vi har använt denna analys för att erhålla prekliniska data för behandling av den retinala degenerativa sjukdomen, MacTel, med hjälp av ett vanligt och säkert lipidförändrande läkemedel, fenofibrat, som nu är i kliniska säkerhetsstudier.Detta tillvägagångssätt kan tillämpas på ett antal vanliga retinala stressfaktorer som leder till sjukdom inklusive näringsbrist, hypoxi, ljustoxicitet och andra giftiga lipider. Vid vecka 24 av kulturen, kontrollera organoiderna för bildandet av rudimentära segment på utsidan av organoiden. Vid vecka 26 till 28 borde de yttre segmenten ha bildat ett tjockt lager.När ett förtjockat tvivlarsegment kan observeras, späd en millimolär deoxySA-stamlösning till 0,51. En och två mikromolära koncentrationer i tre milliliter retinalt differentieringsmedium plus. Använd ett dissektionsmikroskop och en steril sond, välj fyra grupper av organoider av ungefär samma storlek och form med minst fem organoider per grupp och dela grupperna i enskilda brunnar med en ultralåg fästplatta med 6 brunnar.När alla organoider har samlats in, avlägsna så mycket medium från varje brunn som möjligt och tillsätt en koncentration av deoxySA-lösningen till varje brunn. Lägg till fordonskontrollen till den fjärde gruppen organoider. Efter två dagars kultur, ersätt odlingssupernatanterna med lämplig färsk deoxiSA eller kontrollutspädning.Efter fyra dagars odling, bädda in kryosektionen och fläcka organoiderna enligt standardprotokoll för att möjliggöra bedömning av celldöden inom varje kultur. Efter färgning, använd en fem till 10x förstoring för att lokalisera ett område av den skivade organoidsektionen som är intakt, välformad och i ett plan som samplar ett representativt tvärsnitt av organoiden. Sektionen bör ha ett distinkt yttre kärnskikt av fotoreceptorer som är åtminstone några celler tjockt och ett separat och distinkt lager av kärnor som inte har återhämtning och färgning.Rama in bilden och öka förstoringen till 20x. Rama sedan in bilden igen för att fylla bilden med så mycket av fotoreceptorskiktet som möjligt. Ställ in Z-planet och ställ in de övre nedre gränserna för Z-området för att avbilda hela segmentets djup.Avbilda sedan alla tre kanalerna av fluorofor i en Z-stack-förvärv och spara bilden i ett filformat som bevarar förhållandet mellan yta per pixel. För att kvantifiera antalet döda celler i varje prov, öppna bildstaplarna i Fiji. I bioformatets importalternativfönster bekräftar du att inga rutor under avsnittet Dela upp i separata fönster är markerade och väljer Bild, Staplar och Z-projekt för att skapa en ny bild för kvantifiering.Välj den bildkanal som visar återställning och färgning och använd polygonmarkeringsverktyget för att skissera ett kontinuerligt område av fotoreceptorer i bilden. Klicka på Analysera och ange mått och markera rutan Area. Klicka på Analysera och mät för att mäta fotoreceptorernas yta för att räkna de döende cellerna.Måttet visas i ett popup-fönster. För att räkna apoptospositiva kärnor i det valda fotoreceptorområdet, högerklicka på punktverktyget för att välja flerpunktsverktyget och välj apoptospositiv färgning som överlappar med DAPI-positiva kärnor och återhämta sig och färgning. Växla mellan kanalerna för att validera de positiva cellerna.Dela sedan antalet apoptospositiva celler med området för att erhålla ett normaliserat värde för celldöden inom fotoreceptorerna per organoid. Efter bestämning av deoxySA-koncentrationen som inducerar målcelldöd, använd en steril sond för att välja tre grupper av organoider av ungefär samma storlek och form med minst fem organoider per grupp. Och lägg till grupperna i enskilda brunnar med en ultralåg fästplatta med 6 brunnar.Tillsätt målcelldödskoncentrationen för deoxySA, målcelldödskoncentrationen för deoxySA kompletterad med läkemedlet av intresse eller kontrollmediet till lämplig brunn eller organoider. Efter två dagar, ersätt supernatanten i varje brunn med lämplig koncentration av färskt behandlings- eller kontrollmedium. Efter fyra dagars odling, bedöma kulturerna för celldöd som visats.I denna representativa analys behandlades retinala organoider genererade från en icke-makulär telangiektasi typ 2 kontrollinducerad pluripotent stamcellslinje med fyra koncentrationer av deoxySA. Celldöd som svar på deoxySA var koncentrationsberoende och detekterbar i så lite som 50 nanomolar deoxySA. Den högsta koncentrationen som testades inducerade en robust celldöd samtidigt som näthinnans organoids integritet bibehölls.Behandling med 20 mikromolära fenofibrat förhindrade deoxySA-inducerad toxicitet i fotoreceptorerna hos retinala organoider, vilket signifikant minskade celldöden med cirka 80% efter fyra dagars behandling. Kom ihåg att välja välformade och friska organoider för att säkerställa att analysen utförs i retinala celler. Organoiderna kan bearbetas för RNA-insamling för att kvantifiera genuttryck, vilket möjliggör utvärdering av stresssignaler och validering av toxiska effekter och räddningar.Med hjälp av denna teknik har vi kunnat analysera nedströms metabolismen av flera olika lipider i organoider, vilket öppnar studien av lipidmetabolism i mänskliga näthinnor.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Lysrör Nanopartiklar för mätning av jonkoncentration i biologiska system

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization

GENPLAT: en automatiserad plattform för biomassa Enzyme Discovery och Cocktail optimering

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid ...

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

Gene Delivery och Transfektion i mänskliga celler bukspottkörtelcancer med Epidermal Growth Factor Receptor-riktade Gelatin-Based Engineered Nanovectors

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Polymer Microarrays för hög genomströmning Upptäckt av Biomaterial

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

Låg molekylvikt protein Anrikning av mesoporösa kvarts tunna filmer för biomarkörer

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Ögonirritationstest (EIT) för Hazard Identifiering av Eye irriterande kemikalier med hjälp av rekonstruerad Human Cornea liknande Epithelial (RHCE) Tissue Modell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Isolering av primära murin retinala Ganglion-celler (RGC) genom flödescytometri

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Simuleras Bioprinting för Engineering vaskulariserad vävnad och Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Ompressning gentranskription genom att omdirigera cellulära maskineriet med kemiska epigenetiska modifierare

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

Lucifer Yellow-en robust Paracellulär permeabilitet markör i en cell modell av den mänskliga blod-hjärnbarriären

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...