Name: toxicity screens in human retinal organoids for pharmaceutical discovery
Uploaded: 2021-03-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Toxicity Screens in Human Retinal Organoids for Pharmaceutical Discovery at JoVE.com

Lowy Tıbbi Araştırma Enstitüsü tarafından desteklenmektedir. MacTel projesine verdikleri destek için Lowy ailesine teşekkür ederiz. Mari Gantner, Mike Dorrell ve Lea Scheppke'ye entelektüel katkıları ve makalenin hazırlanmasındaki yardımları için teşekkür ederiz.

1. iPSC'leri/ESC'leri çözme, geçirme ve genişletme
NOT: Tüm hücre kültürü adımlarında, steril bir hücre kültürünü korumak için en iyi uygulamaları kullanın.
<ol><li>6 delikli bir hücre kültürü plakasını bazal membran matris ortamı ile kaplayın.<ol><li>Bu ortamın 1x'ini hazırlamak için ürün spesifikasyonlarını takip edin veya 75 μL soğuk matris ortamını 9 mL DMEM/F12 ile seyreltin. 6 delikli bir plakaya kuyucuk başına 1,5 mL taze hazırlanmış 1x ortam...

<ol>
	<li>Waring, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+attrition+of+drug+candidates+from+four+major+pharmaceutical+companies.">An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies.</a> Nature Review Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).</li><li>Khalil, A. S., Jaenisch, R., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+tissues+and+strategies+to+overcome+challenges+in+drug+development.">Engineered tissues and strategies to overcome challenges in drug development.</a> Advances in Drug Delivery Reviews. 158, 116-139 (2020).</li><li>Demetrius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+men.+When+it+comes+to+studying+ageing+and+the+means+to+slow+it+down,+mice+are+not+just+small+humans.">Of mice and men. When it comes to studying ageing and the means to slow it down, mice are not just small humans.</a> EMBO Reports. , 39-44 (2005).</li><li>Lindsay, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyruvate+kinase+and+aspartate-glutamate+carrier+distributions+reveal+key+metabolic+links+between+neurons+and+glia+in+retina.">Pyruvate kinase and aspartate-glutamate carrier distributions reveal key metabolic links between neurons and glia in retina.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111 (43), 15579-15584 (2014).</li><li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+types+of+the+human+retina+and+its+organoids+at+single-cell+resolution.">Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).</li><li>Kruczek, K., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids+for+disease+modeling+and+development+of+therapies.">Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies.</a> Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).</li><li>Sinha, D., Phillips, J., Phillips, M. J., Gamm, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+retinal+development+and+disease+with+human+pluripotent+stem+cells.">Mimicking retinal development and disease with human pluripotent stem cells.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (5), 1-9 (2016).</li><li>Gan, L., Cookson, M. R., Petrucelli, L., La Spada, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Converging+pathways+in+neurodegeneration,+from+genetics+to+mechanisms.">Converging pathways in neurodegeneration, from genetics to mechanisms.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1300-1309 (2018).</li><li>Aung, K. Z., Wickremasinghe, S. S., Makeyeva, G., Robman, L., Guymer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+estimates+of+macular+telangiectasia+type+2:+the+Melbourne+collaborative+cohort+study.">The prevalence estimates of macular telangiectasia type 2: the Melbourne collaborative cohort study.</a> Retina. 30 (3), 473-478 (2010).</li><li>Chew, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ciliary+neurotrophic+factor+on+retinal+neurodegeneration+in+patients+with+macular+telangiectasia+type+2:+A+randomized+clinical+trial.">Effect of ciliary neurotrophic factor on retinal neurodegeneration in patients with macular telangiectasia type 2: A randomized clinical trial.</a> Ophthalmology. 126 (4), 540-549 (2019).</li><li>Gass, J. D., Blodi, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Idiopathic+juxtafoveolar+retinal+telangiectasis.+Update+of+classification+and+follow-up+study.">Idiopathic juxtafoveolar retinal telangiectasis. Update of classification and follow-up study.</a> Ophthalmology. 100 (10), 1536-1546 (1993).</li><li>Klein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+macular+telangiectasia+type+2+in+the+Beaver+Dam+eye+study.">The prevalence of macular telangiectasia type 2 in the Beaver Dam eye study.</a> American Journal of Ophthalmology. 150 (1), 55-62 (2010).</li><li>Powner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Muller's+cells+and+photoreceptors+in+macular+telangiectasia+type+2.">Loss of Muller's cells and photoreceptors in macular telangiectasia type 2.</a> Ophthalmology. 120 (11), 2344-2352 (2013).</li><li>Gantner, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine+and+lipid+metabolism+in+macular+disease+and+peripheral+neuropathy.">Serine and lipid metabolism in macular disease and peripheral neuropathy.</a> New England Journal of Medicine. 381 (15), 1422-1433 (2019).</li><li>Scerri, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analyses+identify+common+variants+associated+with+macular+telangiectasia+type+2.">Genome-wide analyses identify common variants associated with macular telangiectasia type 2.</a> Nature Genetics. 49 (4), 559-567 (2017).</li><li>Alecu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+1-deoxysphingolipids+are+metabolized+by+a+cytochrome+P450-dependent+pathway.">Cytotoxic 1-deoxysphingolipids are metabolized by a cytochrome P450-dependent pathway.</a> Journal of Lipid Research. 58 (1), 60-71 (2017).</li><li>Othman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fenofibrate+lowers+atypical+sphingolipids+in+plasma+of+dyslipidemic+patients:+A+novel+approach+for+treating+diabetic+neuropathy.">Fenofibrate lowers atypical sphingolipids in plasma of dyslipidemic patients: A novel approach for treating diabetic neuropathy.</a> Journal of Clinical Lipidology. 9 (4), 568-575 (2015).</li><li>Ohlemacher, S. K., Iglesias, C. L., Sridhar, A., Gamm, D. M., Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+highly+enriched+populations+of+optic+vesicle-like+retinal+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of highly enriched populations of optic vesicle-like retinal cells from human pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 32, 1-20 (2015).</li><li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+three-dimensional+retinal+tissue+with+functional+photoreceptors+from+human+iPSCs.">Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs.</a> Nature Communication. 5, 4047 (2014).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li><li>Wahlin, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+outer+segment-like+structures+in+long-term+3D+retinas+from+human+pluripotent+stem+cells.">Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells.</a> Science Reports. 7 (1), 766 (2017).</li><li>Capowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+and+staging+of+3D+human+retinal+organoids+across+multiple+pluripotent+stem+cell+lines.">Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines.</a> Development. 146 (1), (2019).</li><li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+system+for+effective+derivation+of+three-dimensional+retinal+tissue+via+Wnt+signaling+regulation.">An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation.</a> Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).</li><li>Ovando-Roche, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+bioreactors+for+culturing+human+retinal+organoids+improves+photoreceptor+yields.">Use of bioreactors for culturing human retinal organoids improves photoreceptor yields.</a> Stem Cell Research Therapy. 9 (1), 156 (2018).</li></ol>

Farklılaştırma protokolü varyasyonları Yoshiki Sasai'nin grup 20 tarafından kendi kendini oluşturan optik kapların icadından bu yana, birçok laboratuvar neredeyse her adımdadeğişebilen retinal organoidler üretmek için protokoller geliştirmiştir 5,18,19,21. Protokollerin ayrıntılı bir listesi Capowski ve ark.22'de<...

İnsan hastalığının hücre kültüründe ve hayvan modellerinde modellenmesi, farmakolojik terapötiklerin keşfi, modifikasyonu ve doğrulanması için paha biçilmez araçlar sağlamış ve aday ilaçtan onaylanmış tedaviye ilerlemelerini sağlamıştır. İn vitro ve insan dışı in vivo modellerin bir kombinasyonu uzun zamandır ilaç geliştirme boru hattının kritik bir bileşeni olmasına rağmen, yeni ilaç adaylarının klinik performansını tahmin etmekte sıklıkla başarısız olmaktadırlar1. Basit insan hücresel monokültürleri ile klinik çalışmalar arasındaki boşluğu dolduran teknolojilerin geliştirilmesine açık bir ihtiyaç vardır. Kendi kendini organize eden üç boyutlu doku kültürleri, organoidlerdeki son teknolojik gelişmeler, modelledikleri dokulara sadakatlerini geliştirmiş ve onları klinik öncesi ilaç geliştirme boru hattında umut verici araçlar haline getirmiştir2.
İnsan hücre kültürünün insan olmayan in vivo modellere göre en büyük avantajı, insanlar ve fareler gibi daha yüksek dereceli omurgalılar arasında bile önemli ölçüde değişebilen insan metabolizmasının spesifik karmaşıklıklarını çoğaltma yeteneğidir3. Bununla birlikte, bu özgüllük, doku karmaşıklığındaki bir kayıpla gölgelenebilir; Çoklu hücre tiplerinin karmaşık bir şekilde iç içe geçtiği ve bir monokültürde çoğaltılamayan hücresel alt tipler arasında benzersiz bir simbiyotik metabolik etkileşime sahip olduğu retina dokusu için de durum böyledir4. Hücre kültürünün erişilebilirliği ve ölçeklenebilirliği ile karmaşık insan dokularının bir faksını sağlayan insan organoidleri, bu hastalık modelleme platformlarının eksikliklerinin üstesinden gelme potansiyeline sahiptir.
Kök hücrelerden elde edilen retinal organoidlerin, insan nöral retinasının karmaşık dokusunun modellenmesinde özellikle sadık olduğu kanıtlanmıştır5. Bu, retinal organoid modelini retina hastalığının araştırılması ve tedavisi için umut verici bir teknoloji haline getirmiştir 6,7. Bugüne kadar retinal organoidlerdeki hastalık modellemesinin çoğu, retinal organoidlerin hastalığa neden olan genetik varyantlara sahip iPSC hatlarından türetildiği monogenik retinal hastalıklara odaklanmıştır7. Bunlar genellikle gelişimsel fenotipler olarak ortaya çıkan oldukça penetrant mutasyonlardır. Genetik mutasyonların ve çevresel stresörlerin normal olarak gelişen dokuyu etkilediği yaşlanan hastalıklar üzerinde etkili bir şekilde daha az çalışma yapılmıştır. Yaşlanmanın nörodejeneratif hastalıkları, karmaşık genetik mirasa ve kısa süreli hücre kültürleri kullanılarak modellenmesi doğal olarak zor olan çevresel stresörlerin katkılarına sahip olabilir. Bununla birlikte, birçok durumda, bu karmaşık hastalıklar, tamamen gelişmiş bir insan dokusu üzerinde test edildiğinde, 8 yaşın nörodejeneratif hastalıklarına güçlü bilgiler sağlayabilen ortak hücresel veya metabolik stresörler üzerinde birleşebilir.
Geç başlangıçlı maküler dejeneratif hastalık olan maküler telanjiektazi tip II (MacTel), yaygın bir metabolik defekt üzerinde birleşen genetik olarak karmaşık bir nörodejeneratif hastalığın harika bir örneğidir. MacTel, makulada fotoreseptör ve Müller glia kaybı ile sonuçlanan, merkezi görmedeilerleyici bir kayba yol açan nadir görülen retinal dejeneratif bir yaşlanma hastalığıdır 9,10,11,12,13. MacTel'de, belirlenmemiş, muhtemelen çok faktörlü, genetik bir kalıtım, hastalarda dolaşımdaki serinde ortak bir azalmaya neden olur ve bu da deoksisfengolipitler (deoksiSL) adı verilen nörotoksik bir lipit türünde artışa neden olur14,15. DeoksiSL birikiminin retina için toksik olduğunu kanıtlamak ve potansiyel farmasötik terapötikleri doğrulamak için, insan retinal organoidlerinde fotoreseptör toksisitesini test etmek için bu protokolü geliştirdik14.
Burada, insan retinal organoidlerini ayırt etmek, organoidleri kullanarak bir toksisite ve kurtarma testi oluşturmak ve sonuçları ölçmek için özel bir protokolün ana hatlarını çiziyoruz. Şüpheli bir hastalığa neden olan ajan olan deoksiSL'nin dokuya özgü toksisitesini belirlediğimiz ve deoksiSL kaynaklı retina toksisitesinin potansiyel tedavisi için güvenli bir jenerik ilaç olan fenofibratın kullanımını doğruladığımız başarılı bir örnek sunuyoruz. Önceki çalışmalar, fenofibratın hastalarda deoksiSL'nin bozulmasını artırabileceğini ve dolaşımdaki deoksiSL'yi azaltabileceğini göstermiştir, ancak deoksiSL'ye bağlı retina toksisitesini azaltmadaki etkinliği test edilmemiştir16,17. Her ne kadar spesifik bir örnek sunsak da, bu protokol herhangi bir sayıda metabolik/çevresel stresörün ve potansiyel terapötik ilaçların retina dokusu üzerindeki etkisini değerlendirmek için kullanılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125mL Erlenmeyer Flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89095-258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-deoxysphinganine</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>860493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement, minus vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaver 6900 Mini-Blade</td>
			<td>Beaver-Visitec</td>
			<td>BEAVER6900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo-fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit Ig-G, Alexa Fluor plus 555</td>
			<td>Thermo-fisher</td>
			<td>A32794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS, Heat Inactivated</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45001-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fenofibrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11684795910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, growth factor reduced</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR 1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 16% Formaldehyde</td>
			<td>Thermo-fisher</td>
			<td>28906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Recoverin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W302600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Plus- O.C.T. compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Cryomold</td>
			<td>EMS</td>
			<td>62534-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment 6 well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>29443-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment 75cm2 U-Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filtration System</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10040-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield-mounting medium</td>
			<td>vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wax pen-ImmEdge</td>
			<td>vector Labs</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 Dihydrochloride (Rock inhibitor)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

toxicity screens in human retinal organoids for pharmaceutical discovery

Organoidler, hücre kültürünün çok yönlülüğü ve verimi ile doğrudan insan dokusu bağlamında hastalık mekanizmasını ve tedavilerini incelemek için umut verici bir platform sağlar. Olgun insan retinal organoidleri, yaşa bağlı retinal dejeneratif hastalık maküler telanjiektazi tip 2 (MacTel) için potansiyel farmasötik tedavileri taramak için kullanılır.
Son zamanlarda MacTel'in atipik bir lipit türü olan deoksisfingolipidlerin (deoksiSL'ler) yüksek seviyelerinden kaynaklanabileceğini gösterdik. Bu lipitler retina için toksiktir ve MacTel hastalarında meydana gelen fotoreseptör kaybına neden olabilir. İlaçları deoksiSL fotoreseptör toksisitesini önleme yetenekleri açısından taramak için, MacTel kaynaklı olmayan bir pluripotent kök hücre (iPSC) hattından insan retinal organoidleri ürettik ve bunları fonksiyonel olarak olgun fotoreseptörler de dahil olmak üzere retinanın tüm nöronal soy türevi hücrelerini geliştirdikleri mitotik bir yaşa olgunlaştırdık. Retinal organoidler deoksiSL metaboliti ile tedavi edildi ve immünohistokimya kullanılarak fotoreseptör tabaka içinde apoptoz ölçüldü. Bu toksisite modeli kullanılarak, deoksiSL kaynaklı fotoreseptör ölümünü önleyen farmakolojik bileşikler tarandı. Hedeflenen bir aday yaklaşım kullanarak, yüksek kolesterol ve trigliseritlerin tedavisi için yaygın olarak reçete edilen bir ilaç olan fenofibratın, retina hücrelerinde deoksiSL toksisitesini de önleyebileceğini belirledik.
Toksisite taraması, fotoreseptör ölümünü önleyebilen FDA onaylı bir ilacı başarıyla tanımladı. Bu, test edilen hastalıkla ilgili yüksek model nedeniyle doğrudan eyleme geçirilebilir bir bulgudur. Bu platform, retina hastalıklarında gelecekteki tedavi keşfi için herhangi bir sayıda metabolik stresörü ve potansiyel farmakolojik müdahaleleri test etmek için kolayca değiştirilebilir.

Retinal organoidler MacTel olmayan bir kontrol iPSC hattından üretildi. Organoidler kültürde 26 haftaya ulaştıktan sonra seçildi ve deney gruplarına ayrıldı. Organoidler, deoksiSA'nın fotoreseptörler için toksik olup olmadığını belirlemek için değişen konsantrasyonlarda deoksiSA ile muamele edildi. Dört deoksiSA konsantrasyonu, 0 ila 1 μM arasında test edildi (Şekil 2) ve organoidler her geçen gün medya değişiklikleri ile 8 gün boyunca tedavi edildi. DeoksiSA'ya ...

Watch this Scientific Journal Video about Toxicity Screens in Human Retinal Organoids for Pharmaceutical Discovery at JoVE.com

Toxicity Screens in Human Retinal Organoids for Pharmaceutical Discovery

Burada, olgun insan retinal organoidleri üretmek ve bunları yaşa bağlı retinal dejeneratif hastalık maküler telanjiektazi tip 2 (MacTel) için farmasötik adayları tanımlamak için bir fotoreseptör toksisite testinde kullanmak için adım adım bir protokol sunuyoruz.

Farmasötik Keşif için İnsan Retinal Organoidlerinde Toksisite Taramaları

Organoids provide a promising platform to study disease mechanism and treatments, directly in the context of human tissue with the versatility and ...

Bu protokol, metabolik retina hastalıkları için farmasötik tedavilerin doğrudan insan retina dokusu içinde keşfedilmesi ve doğrulanması için klinik öncesi bir yaklaşım sağlar. Bu teknik, insan dokularındaki metabolizmanın karmaşıklığını, hücre kültürünün çok yönlülüğü ve verimi ile birleştirir. Bu tahlili, retinal dejeneratif hastalık MacTel'in tedavisi için klinik öncesi verileri elde etmek için, şu anda klinik güvenlik denemelerinde olan yaygın ve güvenli bir lipit değiştirici ilaç olan fenofibrat kullanarak kullandık.Bu yaklaşım, besin eksikliği, hipoksi, ışık toksisitesi ve diğer toksik lipitler dahil olmak üzere hastalığa yol açan herhangi bir sayıda yaygın retinal stresöre uygulanabilir. Kültürün 24. haftasında, organoidlerin dışında ilkel segmentlerin oluşumu için organoidleri kontrol edin. 26 ila 28. haftalarda, dış segmentler kalın bir tabaka oluşturmuş olmalıdır.Kalınlaşmış bir şüpheci segment gözlendiğinde, bir milimolar deoksiSA stok çözeltisini 0.51'e seyreltin. Üç mililitre retina farklılaşma ortamında artı bir ve iki mikromolar konsantrasyon. Bir diseksiyon mikroskobu ve steril bir prob kullanarak, grup başına en az beş organoid ile yaklaşık olarak aynı boyut ve şekle sahip dört organoid grubu seçin ve grupları ultra düşük bir ataşman 6 delikli plakanın bireysel kuyucuklarına bölün.Tüm organoidler toplandığında, her bir kuyucuktan mümkün olduğunca fazla ortam çıkarın ve her bir kuyucuğa bir konsantrasyon deoksiSA çözeltisi ekleyin. Araç kontrolünü dördüncü organoid grubuna ekleyin. İki günlük kültürden sonra, kültür süpernatantlarını uygun taze deoksiSA ile değiştirin veya seyreltmeyi kontrol edin.Dört günlük kültürden sonra, kriyo kesiti yerleştirin ve her kültürdeki hücre ölümünün değerlendirilmesine izin vermek için organoidleri standart protokollere göre boyayın. Boyama işleminden sonra, dilimlenmiş organoid bölümün sağlam, iyi biçimlendirilmiş ve organoidin temsili bir kesitini örnekleyen bir düzlemde bulunan bir bölgesini bulmak için beş ila 10x büyütme kullanın. Bölüm, en az birkaç hücre kalınlığında ayrı bir dış nükleer fotoreseptör tabakasına ve iyileşme ve lekelenmeye sahip olmayan ayrı ve farklı bir çekirdek tabakasına sahip olmalıdır.Görüntüyü çerçeveleyin ve büyütmeyi 20x'e yükseltin. Ardından, görüntüyü fotoreseptör katmanının mümkün olduğunca fazlasıyla doldurmak için slaytı tekrar çerçeveleyin. Z düzlemini ayarlayın ve dilimin tüm derinliğini görüntülemek için Z aralığının üst uç alt sınırlarını ayarlayın.Ardından, üç florofor kanalını da bir Z-yığını ediniminde görüntüleyin ve görüntüyü piksel başına alan oranını koruyan bir dosya biçiminde kaydedin. Her örnekteki ölü hücrelerin sayısını ölçmek için Fiji'deki görüntü yığınlarını açın. Bio formatının içe aktarma seçenekleri penceresinde, ayrı pencerelere bölme bölümünün altındaki hiçbir kutunun işaretli olmadığını onaylayın ve niceleme için yeni bir görüntü oluşturmak üzere Görüntü, Yığınlar ve Z projesi'ni seçin.Kurtarma ve boyamayı gösteren görüntü kanalını seçin ve görüntüdeki fotoreseptörlerin sürekli bir bölgesini ana hatlarıyla belirtmek için çokgen seçim aracını kullanın. Analyze and Set Measurements (Ölçümleri Analiz Et ve Ayarla) seçeneğini tıklatın ve Area (Alan) kutusunu seçin. Fotoreseptörlerin alanını ölçmek, ölmekte olan hücreleri saymak için Analiz Et ve Ölç'e tıklayın.Ölçüm bir açılır pencerede görünür. Seçilen fotoreseptör bölgesindeki apoptoz pozitif çekirdekleri saymak için, çok noktalı aracı seçmek üzere nokta aracına sağ tıklayın ve bir DAPI pozitif çekirdeği ile örtüşen apoptoz pozitif boyamayı seçin ve toparlayın ve boyayın. Pozitif hücreleri doğrulamak için kanallar arasında geçiş yapın.Daha sonra, organoid başına fotoreseptörler içindeki hücre ölümü için normalleştirilmiş bir değer elde etmek için apoptoz pozitif hücrelerin sayısını bölgeye bölün. Hedef hücre ölümüne neden olan deoksiSA konsantrasyonunu belirledikten sonra, grup başına en az beş organoid ile yaklaşık olarak aynı boyut ve şekildeki üç organoid grubunu seçmek için steril bir prob kullanın. Ve grupları ultra düşük bir ataşman 6 delikli plakanın bireysel kuyucuklarına ekleyin.DeoksiSA'nın hedef hücre ölüm konsantrasyonunu, ilgilenilen ilaç veya kontrol ortamı ile desteklenmiş deoksiSA'nın hedef hücre ölüm konsantrasyonunu uygun kuyucuğa veya organoidlere ekleyin. İki gün sonra, her bir kuyucuktaki süpernatantı uygun konsantrasyonda taze tedavi veya kontrol ortamı ile değiştirin. Dört günlük kültürden sonra, kültürleri gösterildiği gibi hücre ölümü için değerlendirin.Bu temsili analizde, maküler olmayan telanjiektazi tip 2 kontrolüne bağlı pluripotent kök hücre hattından üretilen retinal organoidler dört konsantrasyonda deoksiSA ile tedavi edildi. DeoksiSA'ya yanıt olarak hücre ölümü konsantrasyona bağımlıydı ve 50 nanomolar deoksiSA kadar az bir sürede tespit edilebilirdi. Test edilen en yüksek konsantrasyon, retinal organoidin bütünlüğünü korurken sağlam bir hücre ölümüne neden oldu.20 mikromolar fenofibrat ile tedavi, retinal organoidlerin foto reseptörlerinde deoksiSA kaynaklı toksisiteyi önledi ve dört günlük tedaviden sonra hücre ölümünü yaklaşık% 80 oranında önemli ölçüde azalttı. Tahlilin retina hücrelerinde yapıldığından emin olmak için iyi biçimlendirilmiş ve sağlıklı organoidleri seçmeyi unutmayın. Organoidler, gen ekspresyonunu ölçmek için RNA toplanması için işlenebilir, bu da stres sinyallerinin değerlendirilmesine ve toksik etkilerin ve kurtarmaların doğrulanmasına izin verir.Bu tekniği kullanarak, organoidlerdeki birçok farklı lipitin aşağı akış metabolizmasını test edebildik ve insan retinalarında lipit metabolizması çalışmasını açtık.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Biyolojik Sistemleri İyon Konsantrasyon Ölçümü için Floresan Nanopartiküller

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization

GENPLAT: Biyokütle Enzim Discovery ve Kokteyl Optimizasyonu Otomatik Platform

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid ...

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

İnsan Pankreas Kanseri Hücrelerinde Epidermal Büyüme Faktörü kullanarak Gen Teslimat ve Transfeksiyon Jelatin Tabanlı Engineered Nanovectors Reseptör-hedefli

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Biyomalzemelerin Yüksek Verimli Discovery için Polimer Mikroarray&#39;ler

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

Biyomarker Discovery için Mezogözenekli Silika İnce Filmler üzerine düşük molekül ağırlıklı Protein Zenginleştirme

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Yeniden İnşa İnsan Kornea gibi Epitelyal (RHCE) Doku Modeli kullanılarak Göz tahriş Kimyasalların Tehlike Tanımlaması Göz tahrişi Testi (EIT)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Akış Sitometresi ile Primer Sıçan Retinalı Ganglion Hücrelerinin (RGC) İzolasyonu

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Mikrosıvısal Bioprinting mühendisliği için doku ve Organoids skarların

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Kimyasal epigenetik değiştiriciler ile hücresel makine yeniden yönlendirerek Gen transkripsiyonu bastırmak

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

Lucifer Sarı - İnsan Kan-beyin Bariyerbir Hücre Modeli sağlam bir Parasellüler Geçirgenlik Marker

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...