Name: vitrification of in vitro matured oocytes collected from adult and prepubertal ovaries in sheep
Uploaded: 2021-07-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Vitrification of In Vitro Matured Oocytes Collected from Adult and Prepubertal Ovaries in Sheep at JoVE.com

ولم يتلق المؤلفان أي تمويل محدد لهذا العمل. البروفسورة ماريا غرازيا كاباي والدكتورة فاليريا باسيو معترف بامتنان لصوت الفيديو ولإعداد المختبر أثناء صنع الفيديو.

10- يتفق البروتوكول المتعلق بالحيوانات والإجراءات المنفذة المبينة أدناه مع المبادئ التوجيهية الأخلاقية السارية في جامعة ساساري، امتثالا لتوجيه الاتحاد الأوروبي 86/609/EC وتوصية لجنة الجماعات الأوروبية 2007/526/EC.
1. إعداد وسائل الإعلام للتلاعب البويضات
<ol><li>إعداد المتوسطة لنقل ا...

<ol>
	<li>Arav, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+oocytes+and+embryos.">Cryopreservation of oocytes and embryos.</a> Theriogenology. 81 (1), 96-102 (2014).</li><li>Mullen, S. F., Fahy, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chronologic+review+of+mature+oocyte+vitrification+research+in+cattle,+pigs,+and+sheep.">A chronologic review of mature oocyte vitrification research in cattle, pigs, and sheep.</a> Theriogenology. 78 (8), 1709-1719 (2012).</li><li>Hwang, I. S., Hochi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+cryopreservation+of+bovine+oocytes.">Recent progress in cryopreservation of bovine oocytes.</a> BioMed Research International. 2014, (2014).</li><li>Berlinguer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+trehalose+co-incubation+on+in+vitro+matured+prepubertal+ovine+oocyte+vitrification.">Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification.</a> Cryobiology. 55 (1), (2007).</li><li>Quan, G., Wu, G., Hong, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+Cryopreservation+Based+in+Sheep:+The+Current+Status+and+Future+Perspective.">Oocyte Cryopreservation Based in Sheep: The Current Status and Future Perspective.</a> Biopreservation and Biobanking. 15 (6), 535-547 (2017).</li><li>Succu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recovery+time+after+warming+restores+mitochondrial+function+and+improves+developmental+competence+of+vitrified+ovine+oocytes.">A recovery time after warming restores mitochondrial function and improves developmental competence of vitrified ovine oocytes.</a> Theriogenology. 110, (2018).</li><li>Succu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+in+vitro+matured+ovine+oocytes+affects+in+vitro+pre-implantation+development+and+mRNA+abundance.">Vitrification of in vitro matured ovine oocytes affects in vitro pre-implantation development and mRNA abundance.</a> Molecular Reproduction and Development. 75 (3), (2008).</li><li>Succu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+Devices+Affect+Structural+and+Molecular+Status+of+In+Vitro+Matured+Ovine+Oocytes.">Vitrification Devices Affect Structural and Molecular Status of In Vitro Matured Ovine Oocytes.</a> Molecular Reproduction and Development. 74, 1337-1344 (2007).</li><li>Hosseini, S. M., Asgari, V., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic,+rather+than+nuclear-DNA,+insufficiencies+as+the+major+cause+of+poor+competence+of+vitrified+oocytes.">Cytoplasmic, rather than nuclear-DNA, insufficiencies as the major cause of poor competence of vitrified oocytes.</a> Reproductive BioMedicine Online. , (2015).</li><li>Succu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+concentration+in+vitrification+medium+affects+the+developmental+competence+of+in+vitro+matured+ovine+oocytes.">Calcium concentration in vitrification medium affects the developmental competence of in vitro matured ovine oocytes.</a> Theriogenology. 75 (4), (2011).</li><li>Sanaei, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+vitrification+of+in+vitro+matured+ovine+oocytes;+beneficial+effects+of+Ethylene+Glycol+Tetraacetic+acid,+an+intracellular+calcium+chelator.">An improved method for vitrification of in vitro matured ovine oocytes; beneficial effects of Ethylene Glycol Tetraacetic acid, an intracellular calcium chelator.</a> Cryobiology. 84, 82-90 (2018).</li><li>Quan, G. B., Wu, G. Q., Wang, Y. J., Ma, Y., Lv, C. R., Hong, Q. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+maturation+and+developmental+capability+of+ovine+oocytes+at+germinal+vesicle+stage+following+vitrification+using+different+cryodevices.">Meiotic maturation and developmental capability of ovine oocytes at germinal vesicle stage following vitrification using different cryodevices.</a> Cryobiology. 72 (1), 33-40 (2016).</li><li>Fern&#225;ndez-Reyez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=maturation+and+embryo+development+in+vitro+of+immature+porcine+and+ovine+oocytes+vitrified+in+different+devices.">maturation and embryo development in vitro of immature porcine and ovine oocytes vitrified in different devices.</a> Cryobiology. 64 (3), 261-266 (2012).</li><li>Ahmadi, E., Shirazi, A., Shams-Esfandabadi, N., Nazari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidants+and+glycine+can+improve+the+developmental+competence+of+vitrified/warmed+ovine+immature+oocytes.">Antioxidants and glycine can improve the developmental competence of vitrified/warmed ovine immature oocytes.</a> Reproduction in Domestic Animals. 54 (3), 595-603 (2019).</li><li>Barrera, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+delipidated+estrous+sheep+serum+supplementation+on+in+vitro+maturation,+cryotolerance+and+endoplasmic+reticulum+stress+gene+expression+of+sheep+oocytes.">Impact of delipidated estrous sheep serum supplementation on in vitro maturation, cryotolerance and endoplasmic reticulum stress gene expression of sheep oocytes.</a> PLoS ONE. 13 (6), (2018).</li><li>Walker, S. K., Hill, J. L., Kleemann, D. O., Nancarrow, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Ovine+Embryos+in+Synthetic+Oviductal+Fluid+Containing+Amino+Acids+at+Oviductal+Fluid+Concentrations.">Development of Ovine Embryos in Synthetic Oviductal Fluid Containing Amino Acids at Oviductal Fluid Concentrations.</a> Biology of Reproduction. 55 (3), 703-708 (1996).</li><li>Kuwayama, M., Vajta, G., Kato, O., Leibo, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+vitrification+method+for+cryopreservation+of+human+oocytes.">Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes.</a> Reproductive BioMedicine Online. 11 (3), 300-308 (2005).</li><li>Wu, X., Jin, X., Wang, Y., Mei, Q., Li, J., Shi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+spectral+properties+of+novel+chlorinated+pH+fluorescent+probes.">Synthesis and spectral properties of novel chlorinated pH fluorescent probes.</a> Journal of Luminescence. 131 (4), 776-780 (2011).</li><li>Dell'Aquila, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prooxidant+effects+of+verbascoside,+a+bioactive+compound+from+olive+oil+mill+wastewater,+on+in+vitro+developmental+potential+of+ovine+prepubertal+oocytes+and+bioenergetic/oxidative+stress+parameters+of+fresh+and+vitrified+oocytes.">Prooxidant effects of verbascoside, a bioactive compound from olive oil mill wastewater, on in vitro developmental potential of ovine prepubertal oocytes and bioenergetic/oxidative stress parameters of fresh and vitrified oocytes.</a> BioMed Research International. 2014, (2014).</li><li>Gadau, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+quantitative+analysis+on+&#945;-tubulin+modifications+in+glioblastoma+cells.">Morphological and quantitative analysis on &#945;-tubulin modifications in glioblastoma cells.</a> Neuroscience Letters. 687, 111-118 (2018).</li><li>los Reyes, M. D., Palomino, J., Parraguez, V. H., Hidalgo, M., Saffie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+distribution+and+meiotic+progression+in+canine+oocytes+during+in+vivo+and+in+vitro+maturation.">Mitochondrial distribution and meiotic progression in canine oocytes during in vivo and in vitro maturation.</a> Theriogenology. , (2011).</li><li>Leoni, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+the+kinetic+of+the+first+meiotic+division+and+in+active+mitochondrial+distribution+between+prepubertal+and+adult+oocytes+mirror+differences+in+their+developmental+competence+in+a+sheep+model.">Differences in the kinetic of the first meiotic division and in active mitochondrial distribution between prepubertal and adult oocytes mirror differences in their developmental competence in a sheep model.</a> PLoS ONE. 10 (4), (2015).</li><li>Berlinguer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+trehalose+co-incubation+on+in+vitro+matured+prepubertal+ovine+oocyte+vitrification.">Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification.</a> Cryobiology. 55 (1), 27-34 (2007).</li><li>Serra, E., Gadau, S. D., Berlinguer, F., Naitana, S., Succu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+features+and+microtubular+changes+in+vitrified+ovine+oocytes.">Morphological features and microtubular changes in vitrified ovine oocytes.</a> Theriogenology. 148, 216-224 (2020).</li><li>Asgari, V., Hosseini, S. M., Ostadhosseini, S., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+dependent+effect+of+post+warming+interval+on+microtubule+organization,+meiotic+status,+and+parthenogenetic+activation+of+vitrified+in+vitro+matured+sheep+oocytes.">Time dependent effect of post warming interval on microtubule organization, meiotic status, and parthenogenetic activation of vitrified in vitro matured sheep oocytes.</a> Theriogenology. 75 (5), 904-910 (2011).</li><li>Ciotti, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+spindle+recovery+is+faster+in+vitrification+of+human+oocytes+compared+to+slow+freezing.">Meiotic spindle recovery is faster in vitrification of human oocytes compared to slow freezing.</a> Fertility and Sterility. 91 (6), 2399-2407 (2009).</li><li>Ledda, S., Bogliolo, L., Leoni, G., Naitana, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Coupling+and+Maturation-Promoting+Factor+Activity+in+In+Vitro-Matured+Prepubertal+and+Adult+Sheep+Oocytes1.">Cell Coupling and Maturation-Promoting Factor Activity in In Vitro-Matured Prepubertal and Adult Sheep Oocytes1.</a> Biology of Reproduction. 65 (1), 247-252 (2001).</li><li>Palmerini, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+maturation+is+slowed+in+prepubertal+lamb+oocytes:+ultrastructural+evidences.">In vitro maturation is slowed in prepubertal lamb oocytes: ultrastructural evidences.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 12, (2014).</li><li>Leoni, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relations+between+relative+mRNA+abundance+and+developmental+competence+of+ovine+oocytes.">Relations between relative mRNA abundance and developmental competence of ovine oocytes.</a> Molecular Reproduction and Development. 74 (2), 249-257 (2007).</li><li>Succu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+vitrification+solutions+and+cooling+upon+in+vitro+matured+prepubertal+ovine+oocytes.">Effect of vitrification solutions and cooling upon in vitro matured prepubertal ovine oocytes.</a> Theriogenology. 68 (1), 107-114 (2007).</li><li>Larman, M. G., Sheehan, C. B., Gardner, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-free+vitrification+reduces+cryoprotectant-induced+zona+pellucida+hardening+and+increases+fertilization+rates+in+mouse+oocytes.">Calcium-free vitrification reduces cryoprotectant-induced zona pellucida hardening and increases fertilization rates in mouse oocytes.</a> Reproduction. 131 (1), 53-61 (2006).</li><li>Yeste, M., Jones, C., Amdani, S. N., Patel, S., Coward, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+activation+deficiency:+a+role+for+an+oocyte+contribution.">Oocyte activation deficiency: a role for an oocyte contribution.</a> Human Reproduction Update. 22 (1), 23-47 (2016).</li><li>Rienzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte,+embryo+and+blastocyst+cryopreservation+in+ART:+systematic+review+and+meta-analysis+comparing+slow-freezing+versus+vitrification+to+produce+evidence+for+the+development+of+global+guidance.">Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance.</a> Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).</li><li>De Santis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+vitrification:+influence+of+operator+and+learning+time+on+survival+and+development+parameters.">Oocyte vitrification: influence of operator and learning time on survival and development parameters.</a> Placenta. 32, 280-281 (2011).</li><li>Zhang, X., Catalano, P. N., Gurkan, U. A., Khimji, I., Demirci, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+technologies+in+medical+applications+of+minimum+volume+vitrification.">Emerging technologies in medical applications of minimum volume vitrification.</a> Nanomedicine. 6 (6), 1115-1129 (2011).</li></ol>

يمكن أن يسمح الحفاظ على البويضات في الحيوانات المنزلية ليس فقط بالحفاظ على الموارد الوراثية الأنثوية على المدى الطويل ، ولكن أيضا تطوير التكنولوجيات الحيوية الجنينية. وبالتالي، فإن وضع طريقة قياسية لتزجيج البويضات من شأنه أن يستفيد منه كل من الثروة الحيوانية وقطاع البحوث. في هذا البروتو...

يمكن أن يوفر التخزين طويل الأجل للجامات الأنثوية مجموعة واسعة من التطبيقات ، مثل تحسين تربية الحيوانات المنزلية من خلال برامج الاختيار الجيني ، والمساهمة في الحفاظ على التنوع البيولوجي من خلال برنامج الحفاظ على أنواع الحياة البرية في الموقع السابق ، وتعزيز أبحاث وتطبيقات التكنولوجيا الحيوية في المختبر بفضل توافر البويضات المخزنة التي سيتم دمجها في إنتاج الأجنة المختبرية أو برامج زرع الأعضاء النووية1و2و3. كما أن تزجيج البويضات الأحداث سيزيد من الكسب الوراثي عن طريق تقصير فترة التوليد في برامج التربية4. ويعتبر حاليا التزجيج عن طريق التبريد السريع للغاية والاحترار من البويضات نهجا قياسيا للبويضات الماشية cryopreservation5. في المجترات ، قبل التزجيج ، عادة ما تنضج البويضات في المختبر ، بعد استرجاعها من الجريبات التي تم الحصول عليها من المبيضين المشتقة من المسلخ2. الكبار، وخاصة المبيضين prepubertal4،6، يمكن أن توفر في الواقع عدد غير محدود تقريبا من البويضات لتكون cryopreserved.
في الماشية، بعد التزجيج البويضات والاحترار، وقد تم الإبلاغ عن غلة الكيسة الأريمية في >10٪ عادة من قبل العديد من المختبرات خلال العقد الماضي3. ومع ذلك ، في التزجيج البويضات المجترات الصغيرة لا يزال يعتبر جديدا نسبيا لكل من البويضات الأحداث والكبار ، ولا يزال يتعين إنشاء طريقة قياسية لتزجيج البويضاتالخرافية 2،5. على الرغم من التطورات الأخيرة ، فإن البويضات الزخيفة والدافئ تقدم بالفعل العديد من التعديلات الوظيفية والهيكلية التي تحد من إمكاناتها التنموية7و8و9. وهكذا، ذكرت مقالات قليلة تطوير الكيسة الأريمية في 10٪ أو أكثر في البويضات الأغنام vitrified / الدافئة2. وقد تم بحث عدة نهج للحد من التعديلات المذكورة أعلاه: تحسين تكوين حلول التزجيج والذوبان10،11؛ تجريب استخدام أجهزة التبريد المختلفة8،12،13؛ وتطبيق علاجات محددة أثناء نضوج المختبر (IVM)4و14و15 و / أو خلال فترة النقاهة بعد ارتفاع درجة الحرارة6.
هنا نحن نصف بروتوكولا لتزجيج البويضات الأغنام التي تم جمعها من المتبرعين الأحداث والبالغين ونضجت في المختبر قبل cryopreservation. يتضمن البروتوكول جميع الإجراءات من نضوج البويضات في المختبر إلى التزجيج والاحترار وفترة ثقافة ما بعد الاحترار.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#8242;,7&#8242;-Dichlorofluorescin diacetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-6883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin bovine fraction V, protease free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisbenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst 33342)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2 2H20)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH,Wetzlar</td>
			<td>TCS SP5 DMI 6000CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotop Kitazato</td>
			<td>Medical Biological Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D- (-) Fructose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)Trehalose dehydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg yolk</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol (EG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FSH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoutarine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Diaphot, Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cystine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Isoleucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L1512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L1137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O6503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Phenylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Serine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V6504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride heptahydrate (MgSO4.7H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Makler Counting Chamber</td>
			<td>Sefi-Medical Instruments ltd.Biosigma S.r.l.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Red CM-H2XRos</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New born calf serum heat inactivated (FCS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N4762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl alcohol (87-90% hydrolyzed, average mol wt 30,000-70,000)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dl-lactate solution syrup</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sperm Class Analyzer</td>
			<td>Microptic S.L.</td>
			<td>S.C.A. v 3.2.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical software Minitab 18.1</td>
			<td>2017 Minitab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Olimpus</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15,456-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

vitrification of in vitro matured oocytes collected from adult and prepubertal ovaries in sheep

في الماشية، يمكن تطوير نظم إنتاج الأجنة في المختبر ومواصلة ذلك بفضل العدد الكبير من المبيضين والبويضات التي يمكن الحصول عليها بسهولة من المسلخ. يحمل المبيضان البالغان دائما العديد من بصيلات النمل ، بينما في المتبرعين قبل البلوغ ، تتوفر الأعداد القصوى من البويضات في عمر 4 أسابيع ، عندما يحمل المبيضان أعدادا كبيرة من بصيلات النمل. وهكذا، تعتبر الحملان 4 أسابيع من العمر المتبرعين جيدة، حتى لو كان الكفاءة التنموية للبويضات prepubertal أقل بالمقارنة مع نظيرتها الكبار. 
وستعزز البحوث الأساسية والتطبيقات التجارية بإمكانية نجاح حفظ البويضات الزفيرة التي تم الحصول عليها من المتبرعين البالغين والمتبرعين قبل الاختزال. كما أن تزجيج البويضات التي يتم جمعها من المتبرعين قبل التكاثر سيسمح بتقصير فترة التوليد وبالتالي زيادة المكاسب الوراثية في برامج التربية. ومع ذلك ، فإن فقدان إمكانات النمو بعد التبريد يجعل البويضات الثديية على الأرجح واحدة من أصعب أنواع الخلايا للحفاظ على التبريد. من بين تقنيات التبريد المتاحة ، يتم تطبيق التزجيج على نطاق واسع على البويضات الحيوانية والبشرية. على الرغم من التطورات الأخيرة في هذه التقنية ، فإن التعرض لتركيزات عالية من العوامل الصفية المبردة وكذلك الإصابة المخيفة والإجهاد التناضحي لا يزال يحفز العديد من التعديلات الهيكلية والجزيئية ويقلل من الإمكانات التنموية للبويضات الثديية. هنا، نقوم بوصف بروتوكول لتزجيج البويضات الخرافية التي تم جمعها من المتبرعين الأحداث والبالغين ونضجت في المختبر قبل التبريد. ويشمل البروتوكول جميع الإجراءات من البويضات في النضج في المختبر إلى التزجيج والاحترار وفترة الحضانة بعد الاحترار. يمكن بالفعل تخصيب البويضات المهزوسة في مرحلة MII بعد الاحترار ، ولكنها تحتاج إلى وقت إضافي قبل الإخصاب لاستعادة الضرر بسبب إجراءات التبريد وزيادة إمكاناتها التنموية. وبالتالي، فإن ظروف الثقافة والتوقيت بعد الاحترار هي خطوات حاسمة لاستعادة إمكانات نمو البويضات، خاصة عندما يتم جمع البويضات من المتبرعين الأحداث.

والتبريد من البويضات من المتبرعين الأحداث أقل بالمقارنة مع الكبار. التأثير الأول الملاحظ هو انخفاض معدل البقاء على قيد الحياة بعد الاحترار مقارنة بالبويضات البالغة(الشكل 1A؛ خي2 اختبار P<0.001). وأظهرت البويضات الأحداث سلامة الغشاء أقل بعد الاحترار (الشكل 1B</s...

Watch this Scientific Journal Video about Vitrification of In Vitro Matured Oocytes Collected from Adult and Prepubertal Ovaries in Sheep at JoVE.com

Vitrification of In Vitro Matured Oocytes Collected from Adult and Prepubertal Ovaries in Sheep

ويهدف البروتوكول إلى توفير طريقة قياسية لتزجيج البويضات الأغنام البالغة والحدث. وهو يشمل جميع الخطوات من إعداد وسائل الإعلام النضج في المختبر لثقافة ما بعد الاحترار. يتم تزجيج البويضات في مرحلة MII باستخدام Cryotop لضمان الحد الأدنى من الحجم الأساسي.

التزجيج في البويضات الناضجة في المختبر التي تم جمعها من المبيضين الكبار وprepubertal في الأغنام

In livestock, in vitro embryo production systems can be developed and sustained thanks to the large number of ovaries and oocytes that can be easily ...

ويمثل الحفاظ على إمكانية بقاء البويضات بعد التخزين على المدى الطويل أداة لفرصة عظيمة، لأنه من شأنه أن يحسن تربية الحيوانات المنزلية من خلال برامج الانتقاء الجيني، ويساهم في الحفاظ على التنوع البيولوجي من خلال الحفاظ على أنواع الحياة البرية، ويزيد من البحوث في مجال التكنولوجيا الحيوية. كان تزجيج البويضات الأحداث أقصر بكثير في فترة الجيل في برامج التربية. يعتبر Vitrifaction عن طريق التبريد والاحترار ultrarapid نهجا قياسيا في الحفاظ على البويضات الماشية.ومع ذلك، في الأغنام هذا الإجراء لا يزال يعتبر جديدا نسبيا، وهناك نقص في طريقة قياسية. في هذا الفيديو، نقوم بوصف بروتوكول لتزجيج البويضات الخرافية، التي تم جمعها من المتبرعين الأحداث والبالغين على حد سواء، وفي المختبر نضجت إلى ما قبل التبريد. يتضمن البروتوكول جميع الإجراءات من النضج في المختبر ، والتزجيج ، والاحترار ، وثقافة ما بعد الاحترار.بعد استعادة مجمع البويضات الركامية ، حيث نضجت في المختبر لمدة 24 ساعة في حالة ثابتة تشمل البويضات الأحداث ، والتكميل مع مائة ميكرومولار من تريهالوز في وسط النضج. بعد النضج في المختبر ، تم تجني البويضات من خلايا Cumulus ميكانيكيا عن طريق الأنابيب بلطف وفحصها تحت المجهر ستيريو ، مع تكبير 60x. اختيار البويضات لتقديم في إجراءات التزجيج تمثل الخطوة الهامة الأولى لضمان التطبيق الناجح لهذا الإجراء.فقط تلك مع السيتوبلازم موحدة، مع توزيع متجانسة من قطرات الدهون، وسلامة كل إيما واسعة ومحورية مستمرة في الفضاء، زونا بيلوسيدا المدمجة القطر الخارجي من حوالي 19 ميكرومتر وإظهار البثق من الجسم القطبي الأول، وبالتالي في M2، يجب اختيار المرحلة. تم إجراء التزجيج باستخدام الحد الأدنى من طريقة الحجم الأساسية ، مع جهاز Cryotops. بعد الاختيار، تم تكييف مجموعة من خمس بويضات الأحداث في 38.5 درجة مئوية في الوسط الأساسي لمدة دقيقتين.ثم تم جفاف البويضات من قبل ثلاث دقائق التعرض لمحلول المعايرة. تحميل البويضات في جهاز التزجيج المستخدمة هو خطوة هامة وحاسمة. يستخدم Cryotop شريط البولي بروبلين المرفق بحامل.في هذه الطريقة ، يتم تحميل البويضات في محلول التزجيج ، أقل من 0 ملليلتر نقطة بسرعة مع شعرية زجاجية فوق شريط الفيلم. ثم يجب إزالة الحل، تاركا وراءه طبقة رقيقة بما يكفي لتغطية الخلايا لتكون cryopreserved. قبل تحميلها في جهاز Cryotop وسقطت مباشرة في النيتروجين السائل في غضون 30 ثانية.بالنسبة لدرجة الحرارة البيولوجية الداخلية الدافئة ، تم نقل محتوى كل جهاز تزجيج من النيتروجين السائل إلى 200 قطرة ميكرولتر من محلول تريهالوز المتناقص. تم نقل البويضات مجموعة، وسحب البويضات مع رقيقة، ماصة زجاجية، لتعزيز إزالة cryoprotectants داخل الساقين. وأخيرا، كانت البويضات تولد مسبقا في وسط أساسي في حاضنة بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.مباشرة بعد الاحترار، ولكل نقطة زمنية من ثقافة ما بعد الاحترار، تم تقييم البويضات بشكل مورفولوجي باستخدام مجهر مقلوب مع تكبير 100x. التسامح cryo من البويضات من المتبرعين الأحداث أقل بالمقارنة مع تلك المعدلة مع انخفاض سلامة الغشاء بعد الاحترار. استخدام تريهالوز في المتوسط النضج الناجم في البويضات الأحداث أعلى سلامة الغشاء، وزيادة معدلات البقاء على قيد الحياة بعد التزجيج.ومع ذلك لم يتم زيادة الانقسام والإخصاب ومعدلات النمو للخلايا البويضات الأحداث عن طريق مكملات تريهالوز. استخدام وسائل الإعلام مع تركيز الكالسيوم يساوي 2.2 ملليغرام ديسيلتر لتزجيج البويضات الأحداث، ينبغي أن معدلات الإخصاب أعلى مقارنة مع البويضات تهتز مع تركيز الكالسيوم، ولكن لم يتم العثور على اختلافات تمكين الإنتاج. من خلال مقارنة ثقافة ما بعد الاحترار على فترات مختلفة ، أظهرنا أنه بعد أربع ساعات من البويضات الثقافية التي تم جمعها من اثنين أكبر سنا قادرون على استعادة الروابط النشطة والإعداد المجهري ، واستعادة الكفاءة التنموية مع ارتفاع الانقسام ونفايات الخلايا الانفجارية.كان نشاط الميتوكوندريا أعلى في البويضات الدافئة الزخورة بعد أربع ساعات من ثقافة ما بعد الاحترار ، مقارنة بالنقاط الزمنية الأخرى. كما تغير فراق توزيع الميتوكوندريا خلال ست ساعات من ثقافة ما بعد الاحترار. وعلاوة على ذلك، كانت مستويات الأكسجين التفاعلي داخل الخلايا أقل بكثير في البويضات الأحداث في ساعتين من ثقافة ما بعد الاحترار مقارنة مع 0 و 4 و 6 ساعات.ومع ذلك ، وعلى النقيض مما وجد في البويضات الأخرى ، زادت معدلات التنشيط الذاتي البارثينوجيني خلال ثقافة ما بعد الاحترار في البويضات الأحداث. واحدة من المزايا الرئيسية للطريقة المقترحة هي أنها تشمل جميع الخطوات من جمع البويضات إلى النضج في المختبر ، والتزجيج ، والاحترار. وعلاوة على ذلك فإنه يتضمن فترة ثقافة ما بعد الاحترار للسماح باستعادة البويضات من الأضرار التي لحقت أثناء إجراء التزجيج.اختيار الوقت الأمثل للإخصاب أمر صعب، وقد يؤثر على نتيجة برنامج التزجيج. وينبغي أيضا اعتبار أن التزجيج، خلافا لبطء التجميد، تقنية يدوية، وبالتالي فهو يعتمد على المشغل. ولهذا السبب، يتمثل أحد التحديات الرئيسية في الحاجة إلى فنيين وباحثين مهرة يأخذون في الاعتبار تأثير المشغل في تقييم نتائج برنامج التزجيج.المزيد من الدراسات من مختبرنا سوف تسمح في محاولة لتوحيد إجراء التزجيج البويضات والاختيار، وفي تحسين تصميم وسائل الإعلام التكوين لاحتياجات البويضات الأحداث. تجاهل حول استخدام الثقافة والشخصية ومضادات الأكسدة نقدم فرصا واعدة.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

التلاعب و<em&gt; في المختبر</em&gt; نضوج<em&gt; القيطم المورق</em&gt; البويضات، تلاه سهم داخل الهيولى حقن الحيوانات المنوية، لدراسة التطور الجنيني

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

في المختبر مستعمرة فحوصات للتميز الخلايا السلف ثلاثي قوية المعزولة من الفئران البنكرياس الكبار

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

وجه التفريق بين فروعه المكونة للدم البدائي والنهائي من الخلايا الجذعية Pluripotent البشرية

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

تشريح وتلطيخ إيممونوفلوريسسينت للفطر الجسم وعلم الخلايا العصبية في أدمغة البالغين melanogaster المورفولوجية

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

جيل بانكريتويدس التعبير عن الأنسولين خالية من السقالة، ثلاثي الأبعاد من الماوس المتكفل البنكرياس في المختبر

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Human Blastocyst Biopsy and Vitrification

خزعة الكيسة الكيسية البشرية والتزجيج

Blastocyst biopsy is performed to obtain a reliable genetic diagnosis during IVF cycles with preimplantation genetic testing. Then, the ideal workflow ...

Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

الحد الأدنى من حجم الحساسية من البويضات غير ناضجة القطط

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

في استراتيجية ثقافة فيترو لبويضات من أوائل الجريب الأنترال في الماشية

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...

Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

تعداد دقيق للجريب في مبايض الفئران للبالغين

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial ...

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

فصل الخلايا الجريبية والبويضات في بصيلات المبيض من حمار وحشي

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...