Name: vitrification of in vitro matured oocytes collected from adult and prepubertal ovaries in sheep
Uploaded: 2021-07-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Vitrification of In Vitro Matured Oocytes Collected from Adult and Prepubertal Ovaries in Sheep at JoVE.com

著者たちはこの作品に対する具体的な資金を受け取っていなかった。マリア・グラツィア・カッパイ教授とヴァレリア・パシウ博士は、ビデオナレーションとビデオ制作中にラボを設置したことで感謝しています。

動物の議定書および実施された手順は、欧州連合指令86/609/ECおよび欧州共同体委員会の勧告2007/526/ECに従って、サッサリ大学で施行されている倫理指針に従っています。
1. 卵母細胞操作用メディアの準備
<ol><li>0.1 g/L ペニシリンおよび 0.1 g/L ストレプトマイシン (PBS) で Dulbecco のリン酸緩衝生理食塩を補って、採取した卵巣の輸送のための培地を準備します。</li>
	<li>ペ?...

<ol>
	<li>Arav, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+oocytes+and+embryos.">Cryopreservation of oocytes and embryos.</a> Theriogenology. 81 (1), 96-102 (2014).</li><li>Mullen, S. F., Fahy, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chronologic+review+of+mature+oocyte+vitrification+research+in+cattle,+pigs,+and+sheep.">A chronologic review of mature oocyte vitrification research in cattle, pigs, and sheep.</a> Theriogenology. 78 (8), 1709-1719 (2012).</li><li>Hwang, I. S., Hochi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+cryopreservation+of+bovine+oocytes.">Recent progress in cryopreservation of bovine oocytes.</a> BioMed Research International. 2014, (2014).</li><li>Berlinguer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+trehalose+co-incubation+on+in+vitro+matured+prepubertal+ovine+oocyte+vitrification.">Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification.</a> Cryobiology. 55 (1), (2007).</li><li>Quan, G., Wu, G., Hong, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+Cryopreservation+Based+in+Sheep:+The+Current+Status+and+Future+Perspective.">Oocyte Cryopreservation Based in Sheep: The Current Status and Future Perspective.</a> Biopreservation and Biobanking. 15 (6), 535-547 (2017).</li><li>Succu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recovery+time+after+warming+restores+mitochondrial+function+and+improves+developmental+competence+of+vitrified+ovine+oocytes.">A recovery time after warming restores mitochondrial function and improves developmental competence of vitrified ovine oocytes.</a> Theriogenology. 110, (2018).</li><li>Succu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+in+vitro+matured+ovine+oocytes+affects+in+vitro+pre-implantation+development+and+mRNA+abundance.">Vitrification of in vitro matured ovine oocytes affects in vitro pre-implantation development and mRNA abundance.</a> Molecular Reproduction and Development. 75 (3), (2008).</li><li>Succu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+Devices+Affect+Structural+and+Molecular+Status+of+In+Vitro+Matured+Ovine+Oocytes.">Vitrification Devices Affect Structural and Molecular Status of In Vitro Matured Ovine Oocytes.</a> Molecular Reproduction and Development. 74, 1337-1344 (2007).</li><li>Hosseini, S. M., Asgari, V., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic,+rather+than+nuclear-DNA,+insufficiencies+as+the+major+cause+of+poor+competence+of+vitrified+oocytes.">Cytoplasmic, rather than nuclear-DNA, insufficiencies as the major cause of poor competence of vitrified oocytes.</a> Reproductive BioMedicine Online. , (2015).</li><li>Succu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+concentration+in+vitrification+medium+affects+the+developmental+competence+of+in+vitro+matured+ovine+oocytes.">Calcium concentration in vitrification medium affects the developmental competence of in vitro matured ovine oocytes.</a> Theriogenology. 75 (4), (2011).</li><li>Sanaei, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+vitrification+of+in+vitro+matured+ovine+oocytes;+beneficial+effects+of+Ethylene+Glycol+Tetraacetic+acid,+an+intracellular+calcium+chelator.">An improved method for vitrification of in vitro matured ovine oocytes; beneficial effects of Ethylene Glycol Tetraacetic acid, an intracellular calcium chelator.</a> Cryobiology. 84, 82-90 (2018).</li><li>Quan, G. B., Wu, G. Q., Wang, Y. J., Ma, Y., Lv, C. R., Hong, Q. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+maturation+and+developmental+capability+of+ovine+oocytes+at+germinal+vesicle+stage+following+vitrification+using+different+cryodevices.">Meiotic maturation and developmental capability of ovine oocytes at germinal vesicle stage following vitrification using different cryodevices.</a> Cryobiology. 72 (1), 33-40 (2016).</li><li>Fern&#225;ndez-Reyez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=maturation+and+embryo+development+in+vitro+of+immature+porcine+and+ovine+oocytes+vitrified+in+different+devices.">maturation and embryo development in vitro of immature porcine and ovine oocytes vitrified in different devices.</a> Cryobiology. 64 (3), 261-266 (2012).</li><li>Ahmadi, E., Shirazi, A., Shams-Esfandabadi, N., Nazari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidants+and+glycine+can+improve+the+developmental+competence+of+vitrified/warmed+ovine+immature+oocytes.">Antioxidants and glycine can improve the developmental competence of vitrified/warmed ovine immature oocytes.</a> Reproduction in Domestic Animals. 54 (3), 595-603 (2019).</li><li>Barrera, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+delipidated+estrous+sheep+serum+supplementation+on+in+vitro+maturation,+cryotolerance+and+endoplasmic+reticulum+stress+gene+expression+of+sheep+oocytes.">Impact of delipidated estrous sheep serum supplementation on in vitro maturation, cryotolerance and endoplasmic reticulum stress gene expression of sheep oocytes.</a> PLoS ONE. 13 (6), (2018).</li><li>Walker, S. K., Hill, J. L., Kleemann, D. O., Nancarrow, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Ovine+Embryos+in+Synthetic+Oviductal+Fluid+Containing+Amino+Acids+at+Oviductal+Fluid+Concentrations.">Development of Ovine Embryos in Synthetic Oviductal Fluid Containing Amino Acids at Oviductal Fluid Concentrations.</a> Biology of Reproduction. 55 (3), 703-708 (1996).</li><li>Kuwayama, M., Vajta, G., Kato, O., Leibo, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+vitrification+method+for+cryopreservation+of+human+oocytes.">Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes.</a> Reproductive BioMedicine Online. 11 (3), 300-308 (2005).</li><li>Wu, X., Jin, X., Wang, Y., Mei, Q., Li, J., Shi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+spectral+properties+of+novel+chlorinated+pH+fluorescent+probes.">Synthesis and spectral properties of novel chlorinated pH fluorescent probes.</a> Journal of Luminescence. 131 (4), 776-780 (2011).</li><li>Dell'Aquila, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prooxidant+effects+of+verbascoside,+a+bioactive+compound+from+olive+oil+mill+wastewater,+on+in+vitro+developmental+potential+of+ovine+prepubertal+oocytes+and+bioenergetic/oxidative+stress+parameters+of+fresh+and+vitrified+oocytes.">Prooxidant effects of verbascoside, a bioactive compound from olive oil mill wastewater, on in vitro developmental potential of ovine prepubertal oocytes and bioenergetic/oxidative stress parameters of fresh and vitrified oocytes.</a> BioMed Research International. 2014, (2014).</li><li>Gadau, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+quantitative+analysis+on+&#945;-tubulin+modifications+in+glioblastoma+cells.">Morphological and quantitative analysis on &#945;-tubulin modifications in glioblastoma cells.</a> Neuroscience Letters. 687, 111-118 (2018).</li><li>los Reyes, M. D., Palomino, J., Parraguez, V. H., Hidalgo, M., Saffie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+distribution+and+meiotic+progression+in+canine+oocytes+during+in+vivo+and+in+vitro+maturation.">Mitochondrial distribution and meiotic progression in canine oocytes during in vivo and in vitro maturation.</a> Theriogenology. , (2011).</li><li>Leoni, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+the+kinetic+of+the+first+meiotic+division+and+in+active+mitochondrial+distribution+between+prepubertal+and+adult+oocytes+mirror+differences+in+their+developmental+competence+in+a+sheep+model.">Differences in the kinetic of the first meiotic division and in active mitochondrial distribution between prepubertal and adult oocytes mirror differences in their developmental competence in a sheep model.</a> PLoS ONE. 10 (4), (2015).</li><li>Berlinguer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+trehalose+co-incubation+on+in+vitro+matured+prepubertal+ovine+oocyte+vitrification.">Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification.</a> Cryobiology. 55 (1), 27-34 (2007).</li><li>Serra, E., Gadau, S. D., Berlinguer, F., Naitana, S., Succu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+features+and+microtubular+changes+in+vitrified+ovine+oocytes.">Morphological features and microtubular changes in vitrified ovine oocytes.</a> Theriogenology. 148, 216-224 (2020).</li><li>Asgari, V., Hosseini, S. M., Ostadhosseini, S., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+dependent+effect+of+post+warming+interval+on+microtubule+organization,+meiotic+status,+and+parthenogenetic+activation+of+vitrified+in+vitro+matured+sheep+oocytes.">Time dependent effect of post warming interval on microtubule organization, meiotic status, and parthenogenetic activation of vitrified in vitro matured sheep oocytes.</a> Theriogenology. 75 (5), 904-910 (2011).</li><li>Ciotti, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+spindle+recovery+is+faster+in+vitrification+of+human+oocytes+compared+to+slow+freezing.">Meiotic spindle recovery is faster in vitrification of human oocytes compared to slow freezing.</a> Fertility and Sterility. 91 (6), 2399-2407 (2009).</li><li>Ledda, S., Bogliolo, L., Leoni, G., Naitana, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Coupling+and+Maturation-Promoting+Factor+Activity+in+In+Vitro-Matured+Prepubertal+and+Adult+Sheep+Oocytes1.">Cell Coupling and Maturation-Promoting Factor Activity in In Vitro-Matured Prepubertal and Adult Sheep Oocytes1.</a> Biology of Reproduction. 65 (1), 247-252 (2001).</li><li>Palmerini, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+maturation+is+slowed+in+prepubertal+lamb+oocytes:+ultrastructural+evidences.">In vitro maturation is slowed in prepubertal lamb oocytes: ultrastructural evidences.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 12, (2014).</li><li>Leoni, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relations+between+relative+mRNA+abundance+and+developmental+competence+of+ovine+oocytes.">Relations between relative mRNA abundance and developmental competence of ovine oocytes.</a> Molecular Reproduction and Development. 74 (2), 249-257 (2007).</li><li>Succu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+vitrification+solutions+and+cooling+upon+in+vitro+matured+prepubertal+ovine+oocytes.">Effect of vitrification solutions and cooling upon in vitro matured prepubertal ovine oocytes.</a> Theriogenology. 68 (1), 107-114 (2007).</li><li>Larman, M. G., Sheehan, C. B., Gardner, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-free+vitrification+reduces+cryoprotectant-induced+zona+pellucida+hardening+and+increases+fertilization+rates+in+mouse+oocytes.">Calcium-free vitrification reduces cryoprotectant-induced zona pellucida hardening and increases fertilization rates in mouse oocytes.</a> Reproduction. 131 (1), 53-61 (2006).</li><li>Yeste, M., Jones, C., Amdani, S. N., Patel, S., Coward, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+activation+deficiency:+a+role+for+an+oocyte+contribution.">Oocyte activation deficiency: a role for an oocyte contribution.</a> Human Reproduction Update. 22 (1), 23-47 (2016).</li><li>Rienzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte,+embryo+and+blastocyst+cryopreservation+in+ART:+systematic+review+and+meta-analysis+comparing+slow-freezing+versus+vitrification+to+produce+evidence+for+the+development+of+global+guidance.">Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance.</a> Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).</li><li>De Santis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+vitrification:+influence+of+operator+and+learning+time+on+survival+and+development+parameters.">Oocyte vitrification: influence of operator and learning time on survival and development parameters.</a> Placenta. 32, 280-281 (2011).</li><li>Zhang, X., Catalano, P. N., Gurkan, U. A., Khimji, I., Demirci, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+technologies+in+medical+applications+of+minimum+volume+vitrification.">Emerging technologies in medical applications of minimum volume vitrification.</a> Nanomedicine. 6 (6), 1115-1129 (2011).</li></ol>

家畜における卵母細胞凍結保存は、女性の遺伝資源の長期的な保存だけでなく、胚性バイオテクノロジーの開発を進めることができる。したがって、卵母細胞ガラス化のための標準的な方法の開発は、家畜と研究部門の両方に有利であろう。このプロトコルでは、成虫の羊卵子ガラス化のための完全な方法が提示され、若年卵母細胞のための効率的なガラス化システムの開発のための固体の?...

雌の配偶子の長期保存は、遺伝的選択プログラムによる家畜飼育の改善、元その場の野生動物種保護プログラムを通じた生物多様性の保全に寄与すること、および貯蔵された卵母細胞が体外胚生産または核移植プログラム1、2、3に組み込まれる可能性のおかげで、生体内バイオテクノロジーの研究と応用を促進するなど、幅広い用途を提供することができる。若年卵母細胞ガラス化はまた、繁殖プログラム4の生成間隔を短くすることによって遺伝的利益を増加させるだろう。卵母細胞の超急速冷却および温暖化によるガラス化は、現在、家畜卵母細胞凍結保存のための標準的なアプローチと考えられている5.反芻動物では、ガラス化の前に、卵母細胞は、通常、インビトロで成熟し、アバトワール由来卵巣から得られた卵胞から取り出した後2。成人、特に思春期前卵巣4,6は、凍結保存される卵母細胞の事実上無制限の数を実際に供給することができる。
牛では、卵子のガラス化および温暖化後、>10%の胚盤胞収量は、過去10年間にいくつかの実験室によって一般的に報告されている3。しかし、小さな反虫卵子では、卵形の卵形は、まだ若年卵母細胞と成人卵母細胞の両方について比較的新しいと考えられており、羊の卵母細胞のガラス化のための標準的な方法は、2,5に確立され続ける。最近の進歩にもかかわらず、ガラス化され、温めた卵母細胞は確かに彼らの発達の可能性7、8、9を制限するいくつかの機能的および構造的な変化を提示する。したがって、ガラス化/温めた羊の卵母細胞2では10%以上の胚盤胞発生を報告した記事はほとんどありません。上記の変更を減らすためにいくつかのアプローチが検討されている:ガラス化および解凍ソリューション10、11の組成を最適化する。異なるクライオデバイス8、12、13の使用を試してみる。そして、体外成熟(IVM)4、14、15および/または温暖化後の回復時間中に特定の治療を適用する6.
ここでは、若年性および成人ドナーから採取され、凍結保存の前に体外で成熟した羊の卵母細胞のガラス化のためのプロトコルについて説明する。このプロトコルには、卵母細胞の体外成熟からガラス化、温暖化および温暖化後の培養期間まで、すべての手順が含まれています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#8242;,7&#8242;-Dichlorofluorescin diacetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-6883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin bovine fraction V, protease free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisbenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst 33342)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2 2H20)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH,Wetzlar</td>
			<td>TCS SP5 DMI 6000CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotop Kitazato</td>
			<td>Medical Biological Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D- (-) Fructose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)Trehalose dehydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg yolk</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol (EG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FSH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoutarine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Diaphot, Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cystine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Isoleucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L1512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L1137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O6503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Phenylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Serine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V6504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride heptahydrate (MgSO4.7H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Makler Counting Chamber</td>
			<td>Sefi-Medical Instruments ltd.Biosigma S.r.l.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Red CM-H2XRos</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New born calf serum heat inactivated (FCS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N4762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl alcohol (87-90% hydrolyzed, average mol wt 30,000-70,000)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dl-lactate solution syrup</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sperm Class Analyzer</td>
			<td>Microptic S.L.</td>
			<td>S.C.A. v 3.2.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical software Minitab 18.1</td>
			<td>2017 Minitab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Olimpus</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15,456-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

vitrification of in vitro matured oocytes collected from adult and prepubertal ovaries in sheep

家畜では、食肉処理場から容易に得ることができる多数の卵巣および卵母細胞のおかげで、インビトロ胚生産システムを開発し、持続させることができる。成人卵巣は常にいくつかの骨根卵胞を負担し、思春期前ドナーでは卵巣が四大葉包のピーク数を負担する4週齢で卵母細胞の最大数が利用可能である。したがって、4週齢の子羊は、成人の卵母細胞の発達能力が成人に比べて低い場合でも、良好なドナーとみなされる。 
基礎研究と商業用途は、成人および前頭体ドナーの両方から得られたガラス状卵母細胞を正常に凍結保存する可能性によって後押しされるであろう。前立体ドナーから採取された卵母細胞のガラス化はまた、生成間隔を短くし、繁殖プログラムにおける遺伝的利益を増加させることも可能にする。しかし、凍結保存後の発達力の喪失は、哺乳類の卵母細胞をおそらく凍結保存するのが最も困難な細胞型の1つとなる。利用可能な凍結保存技術の中で、ガラス化は動物およびヒト卵母細胞に広く適用される。この技術の最近の進歩にもかかわらず、高濃度の凍結保護剤への暴露、ならびに冷たい傷害および浸透ストレスは依然としていくつかの構造的および分子的変化を誘発し、哺乳類卵母細胞の発達可能性を低下させる。ここでは、若年および成人ドナーから採取され、凍結保存の前に体外で成熟した羊の卵母細胞のガラス化のためのプロトコルについて述べている。このプロトコルには、卵母細胞の体外成熟からガラス化、温暖化および温暖化後のインキュベーション期間まで、すべての手順が含まれています。MII段階でガラス化された卵母細胞は、実際に温暖化後に受精することができるが、凍結保存手順による損傷を回復し、その発達可能性を高めるために受精前に余分な時間が必要である。したがって、温暖化後の培養条件およびタイミングは、特に卵母細胞が若年性ドナーから採取される場合、卵母細胞の発達可能性を回復するための重要なステップである。

若年性ドナーからの卵母細胞の凍結耐性は、成人の卵子に比べて低い。最初に観察された効果は、成体卵母細胞と比較して温暖化後生存率が低い(図1A;χ2試験P<0.001)。若年卵母細胞は、温暖化後の膜完全性の低下を示した(図1B)。成熟培地におけるトレハロースの使用は、この糖が若年卵母細胞の凍結傷害を減少させるかどうかを検証するこ?...

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Vitrification of In Vitro Matured Oocytes Collected from Adult and Prepubertal Ovaries in Sheep

このプロトコルは、成体および若年性羊卵子のガラス化のための標準的な方法を提供することを目的としている。これは、体外成熟培地の調製から温暖化後の培養までのすべてのステップを含む。卵母細胞は最小必須容積を保障するためにクライオトップを使用してMII段階でガラス化される。

羊の成人および前頭前卵巣から採取された体外期の成熟卵母細胞のガラス化

In livestock, in vitro embryo production systems can be developed and sustained thanks to the large number of ovaries and oocytes that can be easily ...

長期保存後の卵母細胞の生存可能性の維持は、遺伝的選択プログラムによる家畜飼育の改善、野生生物種の保全を通じた生物多様性の保全、バイオテクノロジーの研究の増加に寄与するため、大きな機会のツールを表しています。若年卵母細胞ガラス化は、繁殖プログラムにおける生成間隔においてはるかに短かった。超急速な冷却および温暖化によるビトリファクションは、牛の卵母細胞保存における標準的なアプローチと考えられている。しかし、羊では、この手順はまだ比較的新しいと考えられており、標準的な方法が欠けています。このビデオでは、若年性および成人ドナーの両方から採取された羊の卵母細胞のガラス化のためのプロトコルと、凍結保存前に成熟した体外でのプロトコルについて説明します。このプロトコルには、体外成熟、ガラス化、温暖化、温暖化後の培養からのすべての手順が含まれます。乳母卵複合体を回収した後、若年卵母細胞を含む状態で24時間インビトロで成熟し、成熟培地におけるトレハロースの百マイクロモルによる補充。体外成熟後、卵母細胞はCumulus細胞を穏やかにピペット化して機械的に脱ヌードし、60倍の倍率でステレオ顕微鏡で検査した。ガラス化手順で提出する卵母細胞の選択は、この手順の正常な適用を保証する最初の重要なステップを表します。均一な細胞質を有する者だけが、脂質滴の均質な分布を有し、すべてのエマ広く、そして空間における連続的な極めて重要な完全性、コンパクトなゾナ透明体は約19マイクロメートルの外径を示し、したがって、第1極体の押出を示し、したがってM2では、段階を選択しなければならない。ガラス化は、クライオトップス装置を用いて、最小必須ボリューム法を用いて行った。選択後、5つの若い卵母細胞のグループを2分間、ベース培地で38.5°Cに条件付けした。次いで、卵母細胞を、キャリブレーション溶液に3分間曝露して脱水した。使用されるガラス化装置における卵母細胞のローディングは重要かつ重要なステップである。クライオトップはホルダーに付すポリプロピレンストリップを使用します。この方法では、ガラス化溶液中の卵母細胞は、0ポイント未満のミリリットルが、フィルムストリップの上にガラスキャピラリーを急速に装填する。その後、溶液を除去し、凍結保存される細胞を覆うのに十分な薄い層を残す必要があります。クライオトップ装置にロードされる前に、30秒以内に液体窒素に直接突っ込んだ。温かい内部の生物学的温度については、各ガラス化装置の含有量を液体窒素から200マイクロリットルの減少トレハロース溶液に移した。卵母細胞を移管したセットは、卵母細胞を薄いガラスピペットで引きずり、眼下凍結保護剤の除去を促進した。最後に、卵母細胞を5%の二酸化炭素中のインキュベーター中の塩基培地で前繁殖した。温暖化直後、および温暖化後培養の各時点について、卵母細胞を100倍倍の逆顕微鏡を用いて形態学的に評価した。若年性ドナーからの卵母細胞のクライオ耐性は、温暖化後の膜完全性が低い変化したものに比べて低い。若年卵母細胞でより高い膜完全性で誘導される成熟培地におけるトレハロースの使用は、ガラス化後の生存率を増加させる。しかし、切断、受精、および若年卵母細胞の発達率はトレハロース補充によって増加しなかった。若い卵母細胞のガラス化のために2.2ミリグラムのデシリットルに等しいカルシウム濃度の培地を使用すると、カルシウム濃度でガラス化された卵母細胞と比較して受精率が高いが、生産を可能にする違いは見つからなかった。温暖化後の培養を異なる期間で比較することにより、古い2つから採取された4時間の培養卵母細胞が、エネルギッシュな結合と微小管のセットアップを回復し、より高い切断および芽細胞廃棄物で発達能力を回復できることを示した。ミトコンドリア活性は、他の時点と比較して、温暖化後培養の4時間後にガラス化された暖かい若年卵子において高かった。ミトコンドリア分布の分け替えも、温暖化後の培養の6時間の間に変化した。さらに、細胞内活性酸素種は、0、4、および6時間と比較して、温暖化後培養の2時間で若年卵母細胞において有意に低かった。しかし、他の卵母細胞に見られるものとは対照的に、若年卵母細胞における温暖化後培養中に自発的なパルテノゲン化活性化の割合が増加した。提案された方法の主な利点の1つは、卵母細胞の収集から体外成熟、ガラス化、および温暖化に全てのステップが含まれていることである。さらに、ガラス化手順中に発生した損傷からの卵母細胞回収を可能にする温暖化後培養期間が含まれています。受精に最適な時間を選択することは困難であり、ガラス化プログラムの結果に影響を与える可能性があります。また、遅い凍結とは異なり、ガラス化は手作業の手法であり、オペレータに依存する点も考慮する必要があります。そのため、ガラス化プログラムの結果評価においてオペレータの効果を考慮した熟練技術者や研究者の必要性が大きな課題です。私たちの研究室からのさらなる研究は、卵母細胞ガラス化手順と選択を標準化し、若い卵母細胞のニーズに合わせてメディア組成物をより良く調整することを可能にします。文化と性格と抗酸化物質の使用に関する無視は、私たちは有望な機会を提供します。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

操作と<em&gt;インビトロ</emの&gt;成熟<em&gt;アフリカツメガエル</em細胞質内精子注入し&gt;卵母細胞、胚発生を研究するために

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

インビトロコロニーアッセイでトライ強力な前駆細胞を特徴付けるための大人のマウスの膵臓から分離されました

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

ひと多能性幹細胞からプリミティブかつ決定的な造血前駆細胞の分化を監督

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

マウス膵臓前駆細胞の in Vitroからスキャフォールド フリー、三次元のインスリンを表現する Pancreatoids の生成

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Human Blastocyst Biopsy and Vitrification

ヒト胚盤胞生検とガラス化

Blastocyst biopsy is performed to obtain a reliable genetic diagnosis during IVF cycles with preimplantation genetic testing. Then, the ideal workflow ...

Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

未熟ネコの最小体積ガラス化

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

牛の初期のアンタル卵胞からの卵母細胞のための体外培養戦略

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...

Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

成人マウス卵巣における正確な卵胞列挙体

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial ...

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

ゼブラフィッシュの卵巣卵胞における濾胞細胞と卵母細胞の分離

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...