Name: vitrification of in vitro matured oocytes collected from adult and prepubertal ovaries in sheep
Uploaded: 2021-07-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Vitrification of In Vitro Matured Oocytes Collected from Adult and Prepubertal Ovaries in Sheep at JoVE.com

저자는이 작품에 대한 구체적인 자금을받지 못했습니다. 마리아 그라치아 카파이 교수와 발레리아 파시우 박사는 비디오 보이스오버와 비디오 제작 중 실험실 을 설립한 것에 대해 감사하게 인정받고 있습니다.

동물 프로토콜 및 아래에 설명된 구현된 절차는 유럽 연합 지침 86/609/EC및 유럽 공동체 위원회 2007/526/EC의 권고에 따라 사사리 대학의 발효 윤리 지침에 따라 결정됩니다.
1. 오낭 조작을 위한 미디어 준비
<ol><li>덜벡코의 인산완충식식염을 0.1g/L 페니실린과 0.1g/L 연쇄상구균(PBS)으로 보충하여 수집된 난소의 수송을 위한 매체를 준비한다.</li>
	<li>페니실린으로 보충된 밀리큐 ?...

<ol>
	<li>Arav, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+oocytes+and+embryos.">Cryopreservation of oocytes and embryos.</a> Theriogenology. 81 (1), 96-102 (2014).</li><li>Mullen, S. F., Fahy, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chronologic+review+of+mature+oocyte+vitrification+research+in+cattle,+pigs,+and+sheep.">A chronologic review of mature oocyte vitrification research in cattle, pigs, and sheep.</a> Theriogenology. 78 (8), 1709-1719 (2012).</li><li>Hwang, I. S., Hochi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+cryopreservation+of+bovine+oocytes.">Recent progress in cryopreservation of bovine oocytes.</a> BioMed Research International. 2014, (2014).</li><li>Berlinguer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+trehalose+co-incubation+on+in+vitro+matured+prepubertal+ovine+oocyte+vitrification.">Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification.</a> Cryobiology. 55 (1), (2007).</li><li>Quan, G., Wu, G., Hong, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+Cryopreservation+Based+in+Sheep:+The+Current+Status+and+Future+Perspective.">Oocyte Cryopreservation Based in Sheep: The Current Status and Future Perspective.</a> Biopreservation and Biobanking. 15 (6), 535-547 (2017).</li><li>Succu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recovery+time+after+warming+restores+mitochondrial+function+and+improves+developmental+competence+of+vitrified+ovine+oocytes.">A recovery time after warming restores mitochondrial function and improves developmental competence of vitrified ovine oocytes.</a> Theriogenology. 110, (2018).</li><li>Succu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+in+vitro+matured+ovine+oocytes+affects+in+vitro+pre-implantation+development+and+mRNA+abundance.">Vitrification of in vitro matured ovine oocytes affects in vitro pre-implantation development and mRNA abundance.</a> Molecular Reproduction and Development. 75 (3), (2008).</li><li>Succu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+Devices+Affect+Structural+and+Molecular+Status+of+In+Vitro+Matured+Ovine+Oocytes.">Vitrification Devices Affect Structural and Molecular Status of In Vitro Matured Ovine Oocytes.</a> Molecular Reproduction and Development. 74, 1337-1344 (2007).</li><li>Hosseini, S. M., Asgari, V., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic,+rather+than+nuclear-DNA,+insufficiencies+as+the+major+cause+of+poor+competence+of+vitrified+oocytes.">Cytoplasmic, rather than nuclear-DNA, insufficiencies as the major cause of poor competence of vitrified oocytes.</a> Reproductive BioMedicine Online. , (2015).</li><li>Succu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+concentration+in+vitrification+medium+affects+the+developmental+competence+of+in+vitro+matured+ovine+oocytes.">Calcium concentration in vitrification medium affects the developmental competence of in vitro matured ovine oocytes.</a> Theriogenology. 75 (4), (2011).</li><li>Sanaei, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+vitrification+of+in+vitro+matured+ovine+oocytes;+beneficial+effects+of+Ethylene+Glycol+Tetraacetic+acid,+an+intracellular+calcium+chelator.">An improved method for vitrification of in vitro matured ovine oocytes; beneficial effects of Ethylene Glycol Tetraacetic acid, an intracellular calcium chelator.</a> Cryobiology. 84, 82-90 (2018).</li><li>Quan, G. B., Wu, G. Q., Wang, Y. J., Ma, Y., Lv, C. R., Hong, Q. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+maturation+and+developmental+capability+of+ovine+oocytes+at+germinal+vesicle+stage+following+vitrification+using+different+cryodevices.">Meiotic maturation and developmental capability of ovine oocytes at germinal vesicle stage following vitrification using different cryodevices.</a> Cryobiology. 72 (1), 33-40 (2016).</li><li>Fern&#225;ndez-Reyez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=maturation+and+embryo+development+in+vitro+of+immature+porcine+and+ovine+oocytes+vitrified+in+different+devices.">maturation and embryo development in vitro of immature porcine and ovine oocytes vitrified in different devices.</a> Cryobiology. 64 (3), 261-266 (2012).</li><li>Ahmadi, E., Shirazi, A., Shams-Esfandabadi, N., Nazari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidants+and+glycine+can+improve+the+developmental+competence+of+vitrified/warmed+ovine+immature+oocytes.">Antioxidants and glycine can improve the developmental competence of vitrified/warmed ovine immature oocytes.</a> Reproduction in Domestic Animals. 54 (3), 595-603 (2019).</li><li>Barrera, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+delipidated+estrous+sheep+serum+supplementation+on+in+vitro+maturation,+cryotolerance+and+endoplasmic+reticulum+stress+gene+expression+of+sheep+oocytes.">Impact of delipidated estrous sheep serum supplementation on in vitro maturation, cryotolerance and endoplasmic reticulum stress gene expression of sheep oocytes.</a> PLoS ONE. 13 (6), (2018).</li><li>Walker, S. K., Hill, J. L., Kleemann, D. O., Nancarrow, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Ovine+Embryos+in+Synthetic+Oviductal+Fluid+Containing+Amino+Acids+at+Oviductal+Fluid+Concentrations.">Development of Ovine Embryos in Synthetic Oviductal Fluid Containing Amino Acids at Oviductal Fluid Concentrations.</a> Biology of Reproduction. 55 (3), 703-708 (1996).</li><li>Kuwayama, M., Vajta, G., Kato, O., Leibo, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+vitrification+method+for+cryopreservation+of+human+oocytes.">Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes.</a> Reproductive BioMedicine Online. 11 (3), 300-308 (2005).</li><li>Wu, X., Jin, X., Wang, Y., Mei, Q., Li, J., Shi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+spectral+properties+of+novel+chlorinated+pH+fluorescent+probes.">Synthesis and spectral properties of novel chlorinated pH fluorescent probes.</a> Journal of Luminescence. 131 (4), 776-780 (2011).</li><li>Dell'Aquila, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prooxidant+effects+of+verbascoside,+a+bioactive+compound+from+olive+oil+mill+wastewater,+on+in+vitro+developmental+potential+of+ovine+prepubertal+oocytes+and+bioenergetic/oxidative+stress+parameters+of+fresh+and+vitrified+oocytes.">Prooxidant effects of verbascoside, a bioactive compound from olive oil mill wastewater, on in vitro developmental potential of ovine prepubertal oocytes and bioenergetic/oxidative stress parameters of fresh and vitrified oocytes.</a> BioMed Research International. 2014, (2014).</li><li>Gadau, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+quantitative+analysis+on+&#945;-tubulin+modifications+in+glioblastoma+cells.">Morphological and quantitative analysis on &#945;-tubulin modifications in glioblastoma cells.</a> Neuroscience Letters. 687, 111-118 (2018).</li><li>los Reyes, M. D., Palomino, J., Parraguez, V. H., Hidalgo, M., Saffie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+distribution+and+meiotic+progression+in+canine+oocytes+during+in+vivo+and+in+vitro+maturation.">Mitochondrial distribution and meiotic progression in canine oocytes during in vivo and in vitro maturation.</a> Theriogenology. , (2011).</li><li>Leoni, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+the+kinetic+of+the+first+meiotic+division+and+in+active+mitochondrial+distribution+between+prepubertal+and+adult+oocytes+mirror+differences+in+their+developmental+competence+in+a+sheep+model.">Differences in the kinetic of the first meiotic division and in active mitochondrial distribution between prepubertal and adult oocytes mirror differences in their developmental competence in a sheep model.</a> PLoS ONE. 10 (4), (2015).</li><li>Berlinguer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+trehalose+co-incubation+on+in+vitro+matured+prepubertal+ovine+oocyte+vitrification.">Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification.</a> Cryobiology. 55 (1), 27-34 (2007).</li><li>Serra, E., Gadau, S. D., Berlinguer, F., Naitana, S., Succu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+features+and+microtubular+changes+in+vitrified+ovine+oocytes.">Morphological features and microtubular changes in vitrified ovine oocytes.</a> Theriogenology. 148, 216-224 (2020).</li><li>Asgari, V., Hosseini, S. M., Ostadhosseini, S., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+dependent+effect+of+post+warming+interval+on+microtubule+organization,+meiotic+status,+and+parthenogenetic+activation+of+vitrified+in+vitro+matured+sheep+oocytes.">Time dependent effect of post warming interval on microtubule organization, meiotic status, and parthenogenetic activation of vitrified in vitro matured sheep oocytes.</a> Theriogenology. 75 (5), 904-910 (2011).</li><li>Ciotti, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+spindle+recovery+is+faster+in+vitrification+of+human+oocytes+compared+to+slow+freezing.">Meiotic spindle recovery is faster in vitrification of human oocytes compared to slow freezing.</a> Fertility and Sterility. 91 (6), 2399-2407 (2009).</li><li>Ledda, S., Bogliolo, L., Leoni, G., Naitana, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Coupling+and+Maturation-Promoting+Factor+Activity+in+In+Vitro-Matured+Prepubertal+and+Adult+Sheep+Oocytes1.">Cell Coupling and Maturation-Promoting Factor Activity in In Vitro-Matured Prepubertal and Adult Sheep Oocytes1.</a> Biology of Reproduction. 65 (1), 247-252 (2001).</li><li>Palmerini, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+maturation+is+slowed+in+prepubertal+lamb+oocytes:+ultrastructural+evidences.">In vitro maturation is slowed in prepubertal lamb oocytes: ultrastructural evidences.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 12, (2014).</li><li>Leoni, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relations+between+relative+mRNA+abundance+and+developmental+competence+of+ovine+oocytes.">Relations between relative mRNA abundance and developmental competence of ovine oocytes.</a> Molecular Reproduction and Development. 74 (2), 249-257 (2007).</li><li>Succu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+vitrification+solutions+and+cooling+upon+in+vitro+matured+prepubertal+ovine+oocytes.">Effect of vitrification solutions and cooling upon in vitro matured prepubertal ovine oocytes.</a> Theriogenology. 68 (1), 107-114 (2007).</li><li>Larman, M. G., Sheehan, C. B., Gardner, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-free+vitrification+reduces+cryoprotectant-induced+zona+pellucida+hardening+and+increases+fertilization+rates+in+mouse+oocytes.">Calcium-free vitrification reduces cryoprotectant-induced zona pellucida hardening and increases fertilization rates in mouse oocytes.</a> Reproduction. 131 (1), 53-61 (2006).</li><li>Yeste, M., Jones, C., Amdani, S. N., Patel, S., Coward, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+activation+deficiency:+a+role+for+an+oocyte+contribution.">Oocyte activation deficiency: a role for an oocyte contribution.</a> Human Reproduction Update. 22 (1), 23-47 (2016).</li><li>Rienzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte,+embryo+and+blastocyst+cryopreservation+in+ART:+systematic+review+and+meta-analysis+comparing+slow-freezing+versus+vitrification+to+produce+evidence+for+the+development+of+global+guidance.">Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance.</a> Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).</li><li>De Santis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+vitrification:+influence+of+operator+and+learning+time+on+survival+and+development+parameters.">Oocyte vitrification: influence of operator and learning time on survival and development parameters.</a> Placenta. 32, 280-281 (2011).</li><li>Zhang, X., Catalano, P. N., Gurkan, U. A., Khimji, I., Demirci, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+technologies+in+medical+applications+of+minimum+volume+vitrification.">Emerging technologies in medical applications of minimum volume vitrification.</a> Nanomedicine. 6 (6), 1115-1129 (2011).</li></ol>

가축의 오키테 냉동 보존은 여성 유전 자원의 장기적인 보존뿐만 아니라 배아 생명 공학의 개발을 진전시킬 수 있습니다. 따라서, 난소 진동을 위한 표준 방법의 개발은 가축과 연구 분야 모두에 유리할 것이다. 이 프로토콜에서는 성인 양 난소 진동을 위한 완전한 방법이 제시되고 청소년 oocyte에 대한 효율적인 유리화 시스템의 개발을 위한 견고한 출발점을 나타낼 수 있습니다.
<p class="jove_con...

여성 게임테의 장기 저장은 유전적 선정 프로그램에 의한 국내 동물 사육 개선, 전시 야생동물 종 보존 프로그램을 통한 생물다양성 보존 에 기여하고, 생체외 배아 생산 또는 핵이식 프로그램1,2,3에통합될 저장된 난모세포의 가용성에 힘입어 체외 생명공학 연구 및 응용 프로그램을 강화하는 등 광범위한 응용 프로그램을 제공할 수 있다. 청소년 난소 성 유리화는 또한 사육 프로그램4에서생성 간격을 단축하여 유전 적 이득을 증가시킬 것이다. 난모세포의 초고속 냉각 및 온난화에 의한 진동은 현재 가축 난모세포 냉동 보존5에대한 표준 접근법으로 간주됩니다. 반추제에서는, 진동하기 전에, 난소는 일반적으로 아바토이르 유래 난소2로부터얻은 여포로부터 회수 한 후 시험관 내에서 성숙된다. 성인, 특히 프레우버탈 난소4,6은실제로 냉동 보존될 난귀의 거의 무제한 수를 공급할 수 있다.
가축에서, 오낭 성 진동 및 온난화 후, 배반물 수확량>10% 일반적으로 지난 10 년 동안 여러 실험실에 의해 보고 되었습니다3. 그러나, 작은 반추제 난미제에서 난막염 은 여전히 청소년과 성인 난소 모두에 대해 상대적으로 새로운 것으로 간주되며, 양 난미화물 진동에 대한 표준 방법은2,5로확립되어야 한다. 최근의 발전에도 불구하고, 유리화되고 따뜻해진 난소세포는 실제로 발달 잠재력을 제한하는 몇 가지 기능적 및 구조적 변화를 제시합니다7,8,9. 따라서, 생체화/온수 양 난모세포 2에서 10% 이상에서 발아세포 개발을 보고한 기사는 거의없다. 전술한 변경 사항을 줄이기 위해 여러 가지 접근법을 조사했습니다: 바이트로화 및 해동 용액의 조성을최적화(10·11); 다른 저온 장치의 사용을 실험8,12,13; 및 시험관 내 성숙(IVM)4,14, 15 및/또는온난화후 회복 시간 동안 6.
여기에서 우리는 청소년과 성인 기증자에게서 집합되고 냉동 보존 의 앞에 시험관에서 성숙한 양 난모세포의 병용 을 위한 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜에는 시험외 성숙에서 부터 진동, 온난화 및 온난화 후 문화 기간에 이르는 모든 절차가 포함되어 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#8242;,7&#8242;-Dichlorofluorescin diacetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-6883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin bovine fraction V, protease free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisbenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst 33342)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2 2H20)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH,Wetzlar</td>
			<td>TCS SP5 DMI 6000CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotop Kitazato</td>
			<td>Medical Biological Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D- (-) Fructose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)Trehalose dehydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg yolk</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol (EG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FSH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoutarine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Diaphot, Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cystine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Isoleucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L1512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L1137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O6503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Phenylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Serine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V6504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride heptahydrate (MgSO4.7H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Makler Counting Chamber</td>
			<td>Sefi-Medical Instruments ltd.Biosigma S.r.l.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Red CM-H2XRos</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New born calf serum heat inactivated (FCS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N4762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl alcohol (87-90% hydrolyzed, average mol wt 30,000-70,000)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dl-lactate solution syrup</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sperm Class Analyzer</td>
			<td>Microptic S.L.</td>
			<td>S.C.A. v 3.2.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical software Minitab 18.1</td>
			<td>2017 Minitab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Olimpus</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15,456-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

vitrification of in vitro matured oocytes collected from adult and prepubertal ovaries in sheep

가축에서는 도살장에서 쉽게 얻을 수 있는 많은 수의 난소와 난소 로 인해 체외 배아 생산 시스템을 개발하고 지속할 수 있다. 성인 난소는 항상 여러 개 항성 여포를 부담, 전 사춘기 기증자에서 난소의 최대 수는 4 주에 사용할 수 있습니다, 때 난소는 개소 여포의 피크 번호를 곰. 따라서, 4 주 된 양은 좋은 기증자로 간주됩니다, 프레우버탈 난모세포의 발달 능력이 성인 대응에 비해 낮은 경우에도. 
기본 연구 및 상업 응용 프로그램은 성인 및 프레우버탈 기증자 모두에서 얻은 유리화 된 난초를 성공적으로 냉동 보존 할 수있는 가능성에 의해 증폭 될 것입니다. 프레우버탈 기증자로부터 수집된 난소세포의 병리화는 또한 생성 간격을 단축하고 따라서 사육 프로그램에서 유전 이득을 증가시키는 것을 허용할 것입니다. 그러나, 동결 보존 후 발달 잠재력의 손실은 포유류 난모세포를 아마 냉동 보존하는 가장 어려운 세포 유형 중 하나를 만든다. 사용 가능한 냉동 보존 기술 중, 유리화는 동물과 인간의 난모세포에 널리 적용됩니다. 기술의 최근 발전에도 불구하고, 냉동 보호제의 고농도에 노출뿐만 아니라 차가운 부상과 삼투압은 여전히 여러 구조적 및 분자 변화를 유도하고 포유류 난모세포의 발달 잠재력을 감소. 여기에서, 우리는 청소년과 성인 기증자에게서 집합되고 냉동 보존 의 앞에 시험관에서 성숙한 양 난모세포의 병신을 위한 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜에는 시험외 성숙에서 부터 진동, 온난화 및 후 침습 기간에 이르는 모든 절차가 포함되어 있습니다. MII 단계에서 진동하는 난초는 실제로 온난화 에 따라 수정 될 수 있지만 냉동 보존 절차로 인한 손상을 복원하고 발달 잠재력을 높이기 위해 수정되기 전에 추가 시간이 필요합니다. 따라서, 온난화 후 문화 조건과 타이밍은 난모세포 발달 잠재력의 회복을위한 중요한 단계입니다, 특히 난모세포는 청소년 기증자로부터 수집 될 때.

청소년 기증자의 난소 세포의 극온성은 성인 기증자에 비해 낮습니다. 관찰된 첫 번째 효과는 성인 난모세포에 비해 온난화 후 생존율이 낮습니다(도1A;θ 2 시험 P<0.001). 청소년 난모세포는 온난화 후 멤브레인 무결성이 낮은 것으로나타났다(그림 1B). 성숙 배지에서 트레할로오스를 사용하는 것은 이 설탕이 청소년 난모세포에서 저온 부상을 줄...

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Vitrification of In Vitro Matured Oocytes Collected from Adult and Prepubertal Ovaries in Sheep

이 프로토콜은 성인 및 청소년 양 난모세포의 유리화를 위한 표준 방법을 제공하는 것을 목표로 합니다. 여기에는 시험관 내 성숙 미디어 준비부터 온난화 후 문화에 이르기까지 모든 단계가 포함됩니다. 난동체는 최소한의 필수 볼륨을 보장하기 위해 Cryotop을 사용하여 MII 단계에서 진동됩니다.

양에서 성인 및 프레우버탈 난소에서 채취한 생체외 성숙 난소의 진동

In livestock, in vitro embryo production systems can be developed and sustained thanks to the large number of ovaries and oocytes that can be easily ...

장기 저장 후 난소 세포의 잠재적 생존의 유지는 좋은 기회의 도구를 나타냅니다. 청소년 난수체 진동은 번식 프로그램의 생성 간격에서 훨씬 짧아졌습니다. 초고속 냉각 및 온난화에 의한 진동은 가축 난소 보존의 표준 접근법으로 간주됩니다.그러나 양에서이 절차는 여전히 비교적 새로운 것으로 간주되며 표준 방법이 부족합니다. 이 비디오에서는 청소년과 성인 기증자 모두에서 수집한 양 난미세포의 병용 과실을 위한 프로토콜을 설명하고, 냉동 보존 이전에 숙성된 체외에서 설명합니다. 이 프로토콜에는 체외 성숙, 시험 신분, 온난화 및 온난화 후 문화의 모든 절차가 포함됩니다.정전기에서 24시간 동안 시험관에서 숙성된 Cumulus 난모세포 복합체를 회수한 후, 성숙 배지에서 트레할로오스의 백 마이크로몰러를 보충하는 조건. 체외 성숙에 따라, 난모세포는 60배 배율로 스테레오 현미경으로 부드럽게 피펫팅하여 기계적으로 적수푸스 세포를 탈피하였다. 바이트화 절차에서 제출할 난모세포의 선택은 이 절차의 성공적인 적용을 보증하는 첫 번째 중요한 단계를 나타냅니다.지질 방울의 균일한 분포, 모든 엠마의 무결성및 공간에서 연속적인 중추적인, 약 19 마이크로미터의 외경을 작고, 첫 번째 극지 체의 압출을 나타내고, 따라서 M2에서, 스테이지를 선택해야 한다. 유리화는 극저온 장치와 함께 최소 필수 볼륨 방법을 사용하여 수행되었다. 선발 후, 5명의 청소년 난모세포그룹이 2분 동안 기본 배지에서 섭씨 38.5도로 조절되었습니다.난모세포는 교정 용액에 3분 동안 노출되어 탈수되었습니다. 사용되는 유리화 장치에 난모세포의 하중은 중요하고 중요한 단계입니다. 극저온은 홀더에 부착된 폴리프로필렌 스트립을 사용합니다.이 방법에서, 진동용액의 난모세포는 0점 미만의 밀리리터가 필름 스트립 위에 유리 모세관으로 빠르게 적재된다. 그런 다음 용액을 제거해야 하며, 극저온 보존될 세포를 덮을 수 있을 만큼 얇은 층을 남겨두어야 합니다. Cryotop 장치에 로드되기 전에 30 초 이내에 액체 질소로 직접 급락했습니다.따뜻한 실내 생물학적 온도를 위해, 각 유리화 장치의 함량은 액체 질소에서 200 마이크로리터 방울로 리할로오스 용액을 감소시키는 것으로 옮겨졌다. 난피테는 얇은 유리 파이펫으로 난모세포를 드래그하여 추적 형 냉동 보호제의 제거를 촉진하기 위해 세트를 이송했다. 마지막으로, 난모세포는 5%의 이산화탄소를 배양한 배양기의 기본 배지에서 미리 번식하였다.온난화 직후, 그리고 온난화 후 문화의 각 시간 지점에 대해, 난소세포는 100배 배율로 반전된 현미경을 사용하여 형태학적으로 평가되었다. 청소년 기증자의 난모세포의 극저온 허용 오차는 온난화 후 멤브레인 무결성이 낮은 변경된 것과 비교하여 낮습니다. 청소년 난소에서 유도 된 성숙 배지에서 트레할로스의 사용은 더 높은 막 무결성을 증가시켜 진동 후 생존율을 증가시킵니다.그러나 골짜기, 수정, 및 청소년 난모세포의 발달 속도는 trehalose 보충에 의해 증가되지 않았다. 칼슘 농도가 2.2 밀리그램에 해당하는 탄압을 가진 매체를 사용하여 청소년 난모세포의 진동을 위해, 칼슘 농도로 진동하는 난모세포에 비해 더 높은 수정률을 취해야 하지만, 생산을 가능하게 하는 차이는 발견되지 않았다. 서로 다른 기간에 대한 온난화 후 문화를 비교하여, 우리는 이전 두에서 수집 된 배양 난미세포의 4 시간 후 에너지 결합및 미세 관 설정을 복구 할 수 있음을 보여 주었다, 높은 분열과 blastocytes 폐기물로 개발 능력을 복원 할 수 있습니다.미토콘드리아 활동은 다른 시간 점에 비해 온난화 후 문화의 4 시간 후에 유리화 된 따뜻한 청소년 난모세포에서 더 높았다. 미토콘드리아 분포 이별또한 온난화 후 6시간 동안 변경되었습니다. 더욱이, 반응성 산소 종 세포 내 수준은 0, 4, 및 6 시간에 비해 온난화 후 문화의 2 시간에 청소년 난모세포에서 현저하게 낮았다.그러나, 그리고 다른 난모세포에서 찾아낸 것과 는 대조적으로, 자발적인 parthenogentic 활성화의 비율은 청소년 난모세포에 있는 포스트 온난화 문화 도중 증가했습니다. 제안 된 방법의 주요 장점 중 하나는 난소 수집에서 체외 성숙, 진동 및 온난화에 이르기까지 모든 단계를 포함한다는 것입니다. 또한 온난 후 문화 기간을 포함하여 진동 절차 중에 발생한 손해로부터 난토테 복구를 허용합니다.수정을위한 최적의 시간을 선택하는 것은 도전이며, 유리화 프로그램의 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 또한 느린 동결과 는 달리, 유리화가 수동 기술이며, 따라서 연산자 의존적이라고 생각되어야합니다. 이러한 이유로, 주요 과제는 시험화 프로그램의 결과 평가에서 운영자 효과를 고려하는 숙련 된 기술자와 연구원의 필요성입니다.우리의 실험실에서 추가 연구는 oocyte 진동 절차 및 선택을 표준화하는 시도, 청소년 oocyte의 요구에 미디어 구성을 더 잘 조정할 수 있습니다. 문화와 성격과 항산화제의 사용에 대한 무시는 유망한 기회를 제공합니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

조작 및<em&gt; 체외</em의&gt; 성숙<em&gt; 아프리카 발톱 개구리 laevis의</em세포질 내 정자 주입에 이어&gt; 난 모세포, 배아 발달을 연구하는

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

연구

발생학

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

체외 식민지 분석 실험에서 트라이 강력한 전구 세포를 특성화를위한 성인 쥐 췌장에서 분리

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

기본 및 확실 한 조 혈 창시자 인간 만능 줄기 세포에서의 감독

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

비 계, 3 차원 인슐린 표현 Pancreatoids 마우스 췌 장 창시자에 체 외에서 의 세대

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Human Blastocyst Biopsy and Vitrification

인간 배반포 생검 및 유리화

Blastocyst biopsy is performed to obtain a reliable genetic diagnosis during IVF cycles with preimplantation genetic testing. Then, the ideal workflow ...

Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

미성숙한 고양이 오키트의 최소 볼륨 바이트화

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

가축의 초기 개국 여포에서 온수에 대한 생체 외 문화 전략

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...

Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

성인 마우스 난소의 정확한 여포 열거

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial ...

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

얼룩말 피시의 난소 여포에서 여포 세포와 난소 세포의 분리

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...