Name: vitrification of in vitro matured oocytes collected from adult and prepubertal ovaries in sheep
Uploaded: 2021-07-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Vitrification of In Vitro Matured Oocytes Collected from Adult and Prepubertal Ovaries in Sheep at JoVE.com

Yazarlar bu çalışma için özel bir fon almadılar. Profesör Maria Grazia Cappai ve Dr. Valeria Pasciu, video seslendirmesi ve video yapımı sırasında laboratuvarı kurmaları için minnettar bir şekilde kabul edilmektedir.

Hayvan protokolü ve aşağıda açıklanan prosedürler, Sassari Üniversitesi'nde yürürlükte olan etik yönergelere, Avrupa Birliği Direktifi 86/609/EC'ye ve Avrupa Toplulukları Komisyonu 2007/526/EC'nin tavsiyesine uygundur.
1. Oosit manipülasyonu için medyanın hazırlanması
<ol><li>Dulbecco'nun fosfat tamponlu salinini 0,1 g/L penisilin ve 0,1 g/L streptomisin (PBS) ile destekleyerek toplanan yumurtalıkların taşınması için ortamı hazırlayın.</li>
	<li>9,5 g Doku Kültü...

<ol>
	<li>Arav, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+oocytes+and+embryos.">Cryopreservation of oocytes and embryos.</a> Theriogenology. 81 (1), 96-102 (2014).</li><li>Mullen, S. F., Fahy, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chronologic+review+of+mature+oocyte+vitrification+research+in+cattle,+pigs,+and+sheep.">A chronologic review of mature oocyte vitrification research in cattle, pigs, and sheep.</a> Theriogenology. 78 (8), 1709-1719 (2012).</li><li>Hwang, I. S., Hochi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+cryopreservation+of+bovine+oocytes.">Recent progress in cryopreservation of bovine oocytes.</a> BioMed Research International. 2014, (2014).</li><li>Berlinguer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+trehalose+co-incubation+on+in+vitro+matured+prepubertal+ovine+oocyte+vitrification.">Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification.</a> Cryobiology. 55 (1), (2007).</li><li>Quan, G., Wu, G., Hong, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+Cryopreservation+Based+in+Sheep:+The+Current+Status+and+Future+Perspective.">Oocyte Cryopreservation Based in Sheep: The Current Status and Future Perspective.</a> Biopreservation and Biobanking. 15 (6), 535-547 (2017).</li><li>Succu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recovery+time+after+warming+restores+mitochondrial+function+and+improves+developmental+competence+of+vitrified+ovine+oocytes.">A recovery time after warming restores mitochondrial function and improves developmental competence of vitrified ovine oocytes.</a> Theriogenology. 110, (2018).</li><li>Succu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+in+vitro+matured+ovine+oocytes+affects+in+vitro+pre-implantation+development+and+mRNA+abundance.">Vitrification of in vitro matured ovine oocytes affects in vitro pre-implantation development and mRNA abundance.</a> Molecular Reproduction and Development. 75 (3), (2008).</li><li>Succu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+Devices+Affect+Structural+and+Molecular+Status+of+In+Vitro+Matured+Ovine+Oocytes.">Vitrification Devices Affect Structural and Molecular Status of In Vitro Matured Ovine Oocytes.</a> Molecular Reproduction and Development. 74, 1337-1344 (2007).</li><li>Hosseini, S. M., Asgari, V., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic,+rather+than+nuclear-DNA,+insufficiencies+as+the+major+cause+of+poor+competence+of+vitrified+oocytes.">Cytoplasmic, rather than nuclear-DNA, insufficiencies as the major cause of poor competence of vitrified oocytes.</a> Reproductive BioMedicine Online. , (2015).</li><li>Succu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+concentration+in+vitrification+medium+affects+the+developmental+competence+of+in+vitro+matured+ovine+oocytes.">Calcium concentration in vitrification medium affects the developmental competence of in vitro matured ovine oocytes.</a> Theriogenology. 75 (4), (2011).</li><li>Sanaei, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+vitrification+of+in+vitro+matured+ovine+oocytes;+beneficial+effects+of+Ethylene+Glycol+Tetraacetic+acid,+an+intracellular+calcium+chelator.">An improved method for vitrification of in vitro matured ovine oocytes; beneficial effects of Ethylene Glycol Tetraacetic acid, an intracellular calcium chelator.</a> Cryobiology. 84, 82-90 (2018).</li><li>Quan, G. B., Wu, G. Q., Wang, Y. J., Ma, Y., Lv, C. R., Hong, Q. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+maturation+and+developmental+capability+of+ovine+oocytes+at+germinal+vesicle+stage+following+vitrification+using+different+cryodevices.">Meiotic maturation and developmental capability of ovine oocytes at germinal vesicle stage following vitrification using different cryodevices.</a> Cryobiology. 72 (1), 33-40 (2016).</li><li>Fern&#225;ndez-Reyez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=maturation+and+embryo+development+in+vitro+of+immature+porcine+and+ovine+oocytes+vitrified+in+different+devices.">maturation and embryo development in vitro of immature porcine and ovine oocytes vitrified in different devices.</a> Cryobiology. 64 (3), 261-266 (2012).</li><li>Ahmadi, E., Shirazi, A., Shams-Esfandabadi, N., Nazari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidants+and+glycine+can+improve+the+developmental+competence+of+vitrified/warmed+ovine+immature+oocytes.">Antioxidants and glycine can improve the developmental competence of vitrified/warmed ovine immature oocytes.</a> Reproduction in Domestic Animals. 54 (3), 595-603 (2019).</li><li>Barrera, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+delipidated+estrous+sheep+serum+supplementation+on+in+vitro+maturation,+cryotolerance+and+endoplasmic+reticulum+stress+gene+expression+of+sheep+oocytes.">Impact of delipidated estrous sheep serum supplementation on in vitro maturation, cryotolerance and endoplasmic reticulum stress gene expression of sheep oocytes.</a> PLoS ONE. 13 (6), (2018).</li><li>Walker, S. K., Hill, J. L., Kleemann, D. O., Nancarrow, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Ovine+Embryos+in+Synthetic+Oviductal+Fluid+Containing+Amino+Acids+at+Oviductal+Fluid+Concentrations.">Development of Ovine Embryos in Synthetic Oviductal Fluid Containing Amino Acids at Oviductal Fluid Concentrations.</a> Biology of Reproduction. 55 (3), 703-708 (1996).</li><li>Kuwayama, M., Vajta, G., Kato, O., Leibo, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+vitrification+method+for+cryopreservation+of+human+oocytes.">Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes.</a> Reproductive BioMedicine Online. 11 (3), 300-308 (2005).</li><li>Wu, X., Jin, X., Wang, Y., Mei, Q., Li, J., Shi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+spectral+properties+of+novel+chlorinated+pH+fluorescent+probes.">Synthesis and spectral properties of novel chlorinated pH fluorescent probes.</a> Journal of Luminescence. 131 (4), 776-780 (2011).</li><li>Dell'Aquila, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prooxidant+effects+of+verbascoside,+a+bioactive+compound+from+olive+oil+mill+wastewater,+on+in+vitro+developmental+potential+of+ovine+prepubertal+oocytes+and+bioenergetic/oxidative+stress+parameters+of+fresh+and+vitrified+oocytes.">Prooxidant effects of verbascoside, a bioactive compound from olive oil mill wastewater, on in vitro developmental potential of ovine prepubertal oocytes and bioenergetic/oxidative stress parameters of fresh and vitrified oocytes.</a> BioMed Research International. 2014, (2014).</li><li>Gadau, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+quantitative+analysis+on+&#945;-tubulin+modifications+in+glioblastoma+cells.">Morphological and quantitative analysis on &#945;-tubulin modifications in glioblastoma cells.</a> Neuroscience Letters. 687, 111-118 (2018).</li><li>los Reyes, M. D., Palomino, J., Parraguez, V. H., Hidalgo, M., Saffie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+distribution+and+meiotic+progression+in+canine+oocytes+during+in+vivo+and+in+vitro+maturation.">Mitochondrial distribution and meiotic progression in canine oocytes during in vivo and in vitro maturation.</a> Theriogenology. , (2011).</li><li>Leoni, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+the+kinetic+of+the+first+meiotic+division+and+in+active+mitochondrial+distribution+between+prepubertal+and+adult+oocytes+mirror+differences+in+their+developmental+competence+in+a+sheep+model.">Differences in the kinetic of the first meiotic division and in active mitochondrial distribution between prepubertal and adult oocytes mirror differences in their developmental competence in a sheep model.</a> PLoS ONE. 10 (4), (2015).</li><li>Berlinguer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+trehalose+co-incubation+on+in+vitro+matured+prepubertal+ovine+oocyte+vitrification.">Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification.</a> Cryobiology. 55 (1), 27-34 (2007).</li><li>Serra, E., Gadau, S. D., Berlinguer, F., Naitana, S., Succu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+features+and+microtubular+changes+in+vitrified+ovine+oocytes.">Morphological features and microtubular changes in vitrified ovine oocytes.</a> Theriogenology. 148, 216-224 (2020).</li><li>Asgari, V., Hosseini, S. M., Ostadhosseini, S., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+dependent+effect+of+post+warming+interval+on+microtubule+organization,+meiotic+status,+and+parthenogenetic+activation+of+vitrified+in+vitro+matured+sheep+oocytes.">Time dependent effect of post warming interval on microtubule organization, meiotic status, and parthenogenetic activation of vitrified in vitro matured sheep oocytes.</a> Theriogenology. 75 (5), 904-910 (2011).</li><li>Ciotti, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+spindle+recovery+is+faster+in+vitrification+of+human+oocytes+compared+to+slow+freezing.">Meiotic spindle recovery is faster in vitrification of human oocytes compared to slow freezing.</a> Fertility and Sterility. 91 (6), 2399-2407 (2009).</li><li>Ledda, S., Bogliolo, L., Leoni, G., Naitana, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Coupling+and+Maturation-Promoting+Factor+Activity+in+In+Vitro-Matured+Prepubertal+and+Adult+Sheep+Oocytes1.">Cell Coupling and Maturation-Promoting Factor Activity in In Vitro-Matured Prepubertal and Adult Sheep Oocytes1.</a> Biology of Reproduction. 65 (1), 247-252 (2001).</li><li>Palmerini, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+maturation+is+slowed+in+prepubertal+lamb+oocytes:+ultrastructural+evidences.">In vitro maturation is slowed in prepubertal lamb oocytes: ultrastructural evidences.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 12, (2014).</li><li>Leoni, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relations+between+relative+mRNA+abundance+and+developmental+competence+of+ovine+oocytes.">Relations between relative mRNA abundance and developmental competence of ovine oocytes.</a> Molecular Reproduction and Development. 74 (2), 249-257 (2007).</li><li>Succu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+vitrification+solutions+and+cooling+upon+in+vitro+matured+prepubertal+ovine+oocytes.">Effect of vitrification solutions and cooling upon in vitro matured prepubertal ovine oocytes.</a> Theriogenology. 68 (1), 107-114 (2007).</li><li>Larman, M. G., Sheehan, C. B., Gardner, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-free+vitrification+reduces+cryoprotectant-induced+zona+pellucida+hardening+and+increases+fertilization+rates+in+mouse+oocytes.">Calcium-free vitrification reduces cryoprotectant-induced zona pellucida hardening and increases fertilization rates in mouse oocytes.</a> Reproduction. 131 (1), 53-61 (2006).</li><li>Yeste, M., Jones, C., Amdani, S. N., Patel, S., Coward, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+activation+deficiency:+a+role+for+an+oocyte+contribution.">Oocyte activation deficiency: a role for an oocyte contribution.</a> Human Reproduction Update. 22 (1), 23-47 (2016).</li><li>Rienzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte,+embryo+and+blastocyst+cryopreservation+in+ART:+systematic+review+and+meta-analysis+comparing+slow-freezing+versus+vitrification+to+produce+evidence+for+the+development+of+global+guidance.">Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance.</a> Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).</li><li>De Santis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+vitrification:+influence+of+operator+and+learning+time+on+survival+and+development+parameters.">Oocyte vitrification: influence of operator and learning time on survival and development parameters.</a> Placenta. 32, 280-281 (2011).</li><li>Zhang, X., Catalano, P. N., Gurkan, U. A., Khimji, I., Demirci, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+technologies+in+medical+applications+of+minimum+volume+vitrification.">Emerging technologies in medical applications of minimum volume vitrification.</a> Nanomedicine. 6 (6), 1115-1129 (2011).</li></ol>

Evcil hayvanlarda oosit kriyoprezervasyonu sadece dişi genetik kaynakların uzun süreli korunmasına izin vermekle kalmaz, aynı zamanda embriyonik biyoteknolojilerin gelişimini de ilerletebilir. Bu nedenle, oosit vitrifikasyonu için standart bir yöntemin geliştirilmesi hem hayvancılık hem de araştırma sektörüne avantaj sağlayacaktır. Bu protokolde, yetişkin koyun oosit vitrifikasyonu için eksiksiz bir yöntem sunulmaktadır ve juvenil oosit için etkili bir vitrifikasyon sisteminin geliştirilmesi için ...

Dişi gametlerin uzun süreli depolanmasının, genetik seçim programlarıyla evcil hayvan yetiştiriciliğinin iyileştirilmesi, ex-situ yaban hayatı türlerinin korunması programı ile biyoçeşitliliğin korunmasına katkıda bulunması ve in vitro embriyo üretimi veya nükleer transplantasyon programlarına dahil edilecek depolanmış oositlerin mevcudiyeti sayesinde in vitro biyoteknoloji araştırma ve uygulamalarının artırılması gibi çok çeşitli uygulamalar sunabilir1,2,3. Juvenil oosit vitrifikasyonu da üreme programlarında üretim aralığını kısaltarak genetik kazancı artıracaktır4. Oositlerin ultra hızlı soğutulması ve ısıtılması ile vitrifikasyon şu anda hayvancılık oositleri kriyoprezervasyonu için standart bir yaklaşım olarak kabul edilir5. Ruminantlarda, vitrifikasyondan önce, oositler genellikle in vitro olarak olgunlaştırılır, a sittoir türevi yumurtalıklardan elde edilen foliküllerden alındıktan sonra2. Yetişkin ve özellikle prepubertal yumurtalıklar4,6, gerçekten kriyoprezerserved için neredeyse sınırsız sayıda oosit sağlayabilir.
Sığırlarda, oosit vitrifikasyonu ve ısınmadan sonra, son on yılda birkaç laboratuvar tarafından yaygın olarak bildirilen % 10'> blastosist verimi3. Bununla birlikte, küçük ruminantlarda oosit vitrifikasyonu hem genç hem de yetişkin oositler için hala nispeten yeni kabul edilir ve koyun oosit vitrifikasyonu için standart bir yöntem kurulmaya devam eder2,5. Son gelişmelere rağmen, vitrifiye edilmiş ve ısıtılmış oosit gerçekten de gelişim potansiyellerini sınırlayan çeşitli fonksiyonel ve yapısal değişiklikler sunar7,8,9. Bu nedenle, çok az makale% 10 veya daha fazla vitrifiye / ısıtılmış koyun oositleri2blastosist gelişimini bildirmiştir. Yukarıda belirtilen değişiklikleri azaltmak için çeşitli yaklaşımlar araştırılmıştır: vitrifikasyon ve çözülme çözeltilerinin bileşimini optimize etmek10,11; farklı kriyo cihazlarının kullanımı ile deneme8,12,13; ve in vitro olgunlaşma (IVM)4, 14,15ve/veya ısınmadan sonraki iyileşme süresi sırasında özel tedaviler uygulamak6.
Burada, çocuk ve yetişkin donörlerden toplanan ve kriyoprezervasyondan önce in vitro olarak olgunlaşan koyun oositlerinin vitrifikasyonu için bir protokol açıklıyoruz. Protokol, oosit in vitro olgunlaşmadan vitrifikasyona, ısınma ve ısınma sonrası kültür dönemine kadar tüm prosedürleri içerir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#8242;,7&#8242;-Dichlorofluorescin diacetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-6883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin bovine fraction V, protease free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisbenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst 33342)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2 2H20)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH,Wetzlar</td>
			<td>TCS SP5 DMI 6000CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotop Kitazato</td>
			<td>Medical Biological Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D- (-) Fructose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)Trehalose dehydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg yolk</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol (EG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FSH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoutarine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Diaphot, Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cystine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Isoleucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L1512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L1137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O6503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Phenylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Serine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V6504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride heptahydrate (MgSO4.7H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Makler Counting Chamber</td>
			<td>Sefi-Medical Instruments ltd.Biosigma S.r.l.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Red CM-H2XRos</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New born calf serum heat inactivated (FCS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N4762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl alcohol (87-90% hydrolyzed, average mol wt 30,000-70,000)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dl-lactate solution syrup</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sperm Class Analyzer</td>
			<td>Microptic S.L.</td>
			<td>S.C.A. v 3.2.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical software Minitab 18.1</td>
			<td>2017 Minitab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Olimpus</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15,456-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

vitrification of in vitro matured oocytes collected from adult and prepubertal ovaries in sheep

Hayvancılıkta, bir mezbahadan kolayca elde edilebilen çok sayıda yumurtalık ve oosit sayesinde in vitro embriyo üretim sistemleri geliştirilebilir ve sürdürülebilir. Yetişkin yumurtalıklar her zaman birkaç antral folikül taşırken, pubertal öncesi donörlerde, yumurtalıkların antral foliküllerin en yüksek sayılarını taşıdığı 4 haftalıkken maksimum sayıda oosit mevcuttur. Bu nedenle, 4 haftalık kuzular, prepubertal oositlerin gelişimsel yeterliliği yetişkin meslektaşlarına kıyasla daha düşük olsa bile iyi donör olarak kabul edilir. 
Temel araştırmalar ve ticari uygulamalar, hem yetişkin hem de prepubertal donörlerden elde edilen vitrifiye oositlerin başarıyla kriyoprezer tasarrufu olasılığı ile artırılacaktır. Prepubertal donörlerden toplanan oositlerin vitrifikasyonu da üretim aralığının kısaltılmasına ve böylece üreme programlarındaki genetik kazancın artırılmasına olanak sağlayacaktır. Bununla birlikte, kriyoprezervasyondan sonra gelişimsel potansiyelin kaybı, memeli oositleri muhtemelen kriyoprezervasyonu en zor hücre türlerinden biri haline getirir. Mevcut kriyoprezervasyon teknikleri arasında vitrifikasyon hayvan ve insan oositlerine yaygın olarak uygulanmaktadır. Teknikteki son gelişmelere rağmen, yüksek konsantrasyonlarda kriyoprotektif ajanların yanı sıra ürpertici yaralanma ve ozmotik strese maruz kalmak hala birkaç yapısal ve moleküler değişikliğe neden olmakta ve memeli oositlerin gelişim potansiyelini azaltmaktadır. Burada, çocuk ve yetişkin donörlerden toplanan ve kriyoprezervasyondan önce olgunlaşmış in vitro koyun oositlerinin vitrifikasyonu için bir protokol açıklıyoruz. Protokol, oosit in vitro olgunlaşmadan vitrifikasyona, ısınma ve ısınma sonrası kuluçka dönemine kadar tüm prosedürleri içerir. MII aşamasında vitrifiye edilen oositler ısınmadan sonra gerçekten döllenebilir, ancak kriyoprezervasyon prosedürleri nedeniyle hasarı geri yüklemek ve gelişim potansiyellerini artırmak için döllenmeden önce ekstra zamana ihtiyaçları vardır. Bu nedenle, ısınma sonrası kültür koşulları ve zamanlama, özellikle oositler genç donörlerden toplandığında, oosit gelişim potansiyelinin restorasyonu için çok önemli adımlardır.

Çocuk donörlerden gelen oosit kriyotoleransı yetişkin olanlara göre daha düşüktür. Gözlenen ilk etki, yetişkin oositlere kıyasla ısınma sonrası sağkalım oranının daha düşük olmasıdır(Şekil 1A; χ2 test P<0.001). Juvenil oositler ısındıktan sonra daha düşük bir membran bütünlüğü göstermiştir (Şekil 1B). Olgunlaşma ortamında trehaloz kullanımı, bu şekerin juvenil oositlerdeki kriyoinjuries'i azaltıp azaltamay...

Watch this Scientific Journal Video about Vitrification of In Vitro Matured Oocytes Collected from Adult and Prepubertal Ovaries in Sheep at JoVE.com

Vitrification of In Vitro Matured Oocytes Collected from Adult and Prepubertal Ovaries in Sheep

Protokol, yetişkin ve yavru koyun oositlerinin vitrifikasyonu için standart bir yöntem sağlamayı amaçlamaktadır. Tüp bebek medyasının hazırlanmasından ısınma sonrası kültüre kadar tüm adımları içerir. Oositler, minimum temel hacmi sağlamak için Cryotop kullanılarak MII aşamasında vitrifiye edilir.

Koyunlarda Erişkin ve Prepubertal Yumurtalıklardan Toplanan In Vitro Olgunlaşmış Oositlerin Vitrifikasyonu

In livestock, in vitro embryo production systems can be developed and sustained thanks to the large number of ovaries and oocytes that can be easily ...

Uzun süreli depolamadan sonra oosit potansiyelinin canlılığının korunması, genetik seçim programlarının evcil hayvan yetiştiriciliğini geliştireceği, yaban hayatı türlerinin korunması yoluyla biyoçeşitliliğin korunmasına katkıda bulunacağı ve biyoteknoloji araştırmalarını artıracağı için büyük bir fırsat aracını temsil ediyor. Juvenil oosit vitrifikasyonu üreme programlarında nesil aralığında çok daha kısaydı. Ultrarapid soğutma ve ısınma ile vitrifaction sığır oosit korunmasında standart bir yaklaşım olarak kabul edilir.Bununla birlikte, koyunlarda bu prosedür hala nispeten yeni olarak kabul edilir ve standart bir yöntem eksiktir. Bu videoda, hem genç hem de yetişkin donörlerden toplanan ve in vitro kriyoprezervasyondan önce olgunlaşan koyun oositinin vitrifikasyonu için bir protokol açıklıyoruz. Protokol, in vitro olgunlaşma, vitrifikasyon, ısınma ve ısınma sonrası kültürden tüm prosedürleri içerir.Kümülüs oosit kompleksini geri aldıktan sonra, 24 saat boyunca in vitro olarak olgunlaştırılarak, olgunlaşma ortamında yüz mikromolar trehaloz ile takviye, juvenil oosit için dahil bir durum. İn vitro olgunlaşmayı takiben, oositler Kümülüs hücrelerinin hafifçe pipetlenmesiyle mekanik olarak inküre edildi ve stereo mikroskop altında 60x büyütme ile incelendi. Vitrifikasyon prosedürlerinde sunacak oositlerin seçimi, bu prosedürün başarılı bir şekilde uygulanmasını garanti etmek için ilk önemli adımı temsil eder.Sadece tek tip sitoplazma olanlar, lipit damlacıklarının homojen dağılımı, uzayda tüm Emma geniş ve sürekli pivotal bütünlüğü, kompakt zona pellucida yaklaşık 19 mikrometre dış çapı ve ilk kutup gövdesinin ekstrüzyonunu gösteren ve böylece M2'de aşama seçilmelidir. Vitrifikasyon, bir Cryotops cihazı ile minimum temel hacim yöntemi kullanılarak gerçekleştirildi. Seçimden sonra, beş çocuk oosit grubu iki dakika boyunca taban ortamında 38,5 santigrat derecede koşullandırılmıştır.Oositler daha sonra bir kalibrasyon çözeltisine üç dakika maruz kalıtsal maruz kalıtsal olarak susuz kaldı. Oositlerin kullanılan vitrifikasyon cihazına yüklenmesi önemli ve kritik bir adımdır. Kriyotop, tutucuya bağlı bir polipropilen şerit kullanır.Bu yöntemde, vitrifikasyon çözeltisinde, 0 puan mililitreden daha az olan oositler, film şeridinin üzerine hızla cam bir kılcal damar ile yüklenir. Daha sonra çözelti çıkarılmalı ve geride kriyoprezerserve edilecek hücreleri kaplayacak kadar ince bir tabaka bırakılmalıdır. Cryotop cihazına yüklenmeden ve 30 saniye içinde doğrudan sıvı nitrojene dalmadan önce.Sıcak iç biyolojik sıcaklık için, her vitrifikasyon cihazının içeriği sıvı azottan azalan trehaloz çözeltisinin 200 mikroliter damlasına aktarıldı. Oositler, intracelular kriyoprotektantların çıkarılmasını teşvik etmek için oositleri ince, cam pipetle sürükleyerek aktarıldı. Son olarak, oositler% 5 karbondioksitte inkübatörde bir baz ortamda önceden yetiştirildi.Isınmadan hemen sonra ve ısınma sonrası kültürün her zaman noktası için, oositler 100x büyütmeli ters bir mikroskop kullanılarak morfolojik olarak değerlendirildi. Çocuk donörlerden gelen oositlerin kriyo toleransı, ısındıktan sonra daha düşük membran bütünlüğüne sahip değiştirilmiş olanlara kıyasla daha düşüktür. Juvenil oositlerde indüklenen olgunlaşma ortamında trehaloz kullanımı daha yüksek membran bütünlüğünü artırarak vitrifikasyon sonrası sağkalım oranlarını artırır.Ancak trehaloz takviyesi ile rekolte, döllenme ve juvenil oositlerin gelişim oranları artmamıştır. Juvenil oositlerin vitrifikasyonu için 2,2 miligram desilitreye eşit kalsiyum konsantrasyonuna sahip ortamların kullanımı, kalsiyum konsantrasyonu ile vitrifiye edilen oositlere kıyasla daha yüksek döllenme oranlarına sahip olmalıdır, ancak üretimi sağlayan herhangi bir farklılık bulunamadı. Isınma sonrası kültürü farklı sürelerde karşılaştırarak, yaşlı iki kişiden toplanan dört saatlik kültür oositinden sonra enerjik bağları ve mikrotübüler kurulumu geri kazanabildiğini ve daha yüksek dekolte ve blastosit atıkları ile gelişimsel yetkinliği geri kazanabildiğini gösterdik.Mitokondriyal aktivite, dört saatlik ısınma sonrası kültürden sonra diğer zaman noktalarına kıyasla vitrifiye sıcak juvenil oositlerde daha yüksekti. Mitokondriyal dağılım ayrışması da altı saatlik ısınma sonrası kültür sırasında değişti. Ayrıca, reaktif oksijen türleri hücre içi düzeyleri, ıslah edici oositlerde ısınma sonrası kültürün iki saatinde 0, 4 ve 6 saate kıyasla önemli ölçüde daha düşüktü.Bununla birlikte, diğer oositlerde bulunanların aksine, juvenil oositlerde ısınma sonrası kültür sırasında spontan partenogentik aktivasyon oranları artmıştır. Önerilen yöntemin ana avantajlarından biri, oosit toplanmasından in-vitro olgunlaşmaya, vitrifikasyona ve ısınmaya kadar tüm adımları içermesidir. Ayrıca, vitrifikasyon prosedürü sırasında oluşan hasarlardan oosit iyileşmesine izin vermek için ısınma sonrası bir kültür dönemi içerir.Döllenme için en uygun zamanı seçmek zordur ve vitrifikasyon programının sonucunu etkileyebilir. Yavaş dondurmanın aksine, vitrifikasyonun manuel bir teknik olduğu ve bu nedenle operatöre bağlı olduğu da düşünülmelidir. Bu nedenle, vitrifikasyon programının sonucunun değerlendirilmesinde operatör etkisini dikkate alan yetenekli teknisyenlere ve araştırmacılara duyulan ihtiyaç büyük bir zorluktur.Laboratuvarımızdan daha fazla çalışma, oosit vitrifikasyon prosedürünü ve seçimini standartlaştırmaya ve medya kompozisyonunu juvenil oosit ihtiyaçlarına daha iyi uyarlamaya izin verecektir. Kültür ve karakter kullanımı ve antioksidan kullanımı hakkında bir ihmal umut verici fırsatlar sunuyoruz.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipülasyon ve<em&gt; İn Vitro</emVe&gt; Olgunlaşma<em&gt; Xenopus laevis</emIntrasitoplazmik sperm enjeksiyonu izledi&gt; oositler, Embriyonik Geliştirme Çalışması

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In Vitro Colony Tahliller Tri-güçlü Progenitör Hücreleri karakterize Yetişkin Fare Pankreas İzole

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

İlkel ve kesin hematopoetik ataları insan Pluripotent kök hücrelerden farklılaşma yönetmen

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

İskele-free, üç boyutlu insülin ifade Pancreatoids fare pankreas ataları Vitro gelen nesil

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Human Blastocyst Biopsy and Vitrification

İnsan blastosist biyopsisi ve vitrifikasyon

Blastocyst biopsy is performed to obtain a reliable genetic diagnosis during IVF cycles with preimplantation genetic testing. Then, the ideal workflow ...

Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

Olgunlaşmamış Kedi Yumurtalarının Minimum HacimVitrifikasyonu

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

Sığırlarda Erken Antral Folikülden Oositler Için Tüp Bebek Kültür Stratejisi

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...

Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Yetişkin Fare Yumurtalıklarında Doğru Folikül Numaralandırması

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial ...

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

Zebra Balıklarının Yumurtalık Foliküllerinde Foliküler Hücrelerin ve Oositlerin Ayrılması

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...