Name: direct agroinoculation of maize seedlings by injection with recombinant foxtail mosaic virus and sugarcane mosaic virus infectious clones
Uploaded: 2021-02-27T14:30:00
Duration: 5 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Agroinoculation of Maize Seedlings by Injection with Recombinant Foxtail Mosaic Virus and Sugarcane Mosaic Virus Infectious Clones at JoVE.com

جامعة ولاية أيوا هي جزء من فريق يدعم برنامج حلفاء الحشرات في DARPA HR0011-17-2-0053. تم دعم هذا العمل أيضا من قبل معهد علوم النبات بجامعة ولاية أيوا ، ومركز الهندسة الحيوية للمحاصيل بجامعة ولاية أيوا ، ومشروع NIFA Hatch التابع لوزارة الزراعة الأمريكية رقم 3808 ، وصناديق ولاية أيوا. كما تم دعم K.L.H. جزئيا من قبل برنامج تدريب الخريجين على الظواهر النباتية التنبؤية بجامعة ولاية أيوا بتمويل من المؤسسة الوطنية للعلوم (DGE #1545453) ومنحة مبادرة البحوث الزراعية والغذائية رقم 2019-07318 من المعهد الوطني للأغذية والزراعة التابع لوزارة الزراعة الأمريكية. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها وتفسيرها وفي كتابة المخطوطة. أي آراء أو نتائج أو استنتاجات أو توصيات يتم التعبير عنها في هذه المواد هي آراء المؤلفين ولا تعكس بالضرورة وجهات نظر الممولين.
نشكر لوتر (USDA-ARS ، Ames ، IA) على بذور الخطوط المزروعة بالذرة ، وكريستيان ف. مونتيس سيري (جامعة ولاية أيوا) على صنع استنساخ FoMV-GFP ، وتايلر أوستن (جامعة ولاية أيوا) للمساعدة التقنية.

ليس لدى الباحثين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Agrobacterium هي أداة أساسية تسهل العديد من تقنيات البيولوجيا الجزيئية في البحوث المتعلقة بالنبات. توفر هذه الدراسة بروتوكول حقن زراعي لتلقيح ناقلات الفيروسات FoMV و SCMV مباشرة في أنسجة الذرة لتطبيقات VIGS و VOX. والهدف الرئيسي هو زيادة سهولة وفائدة التكنولوجيات القائمة على الفيروسات لأغراض البحث في نباتات المحاصيل الأحادية الوط. على الرغم من أنه تم الإبلاغ عن التلقيح الزراعي المباشر للذرة لعدد قليل من الفيروسات ، إلا أن المؤلفين ليسوا على دراية ببروتوكول مفصل ، ولا توجد أمثلة على تطبيقات VIGS و VOX في تلك الدراسات19,22.
وقد أفيد ، وتم تأكيده أثناء تطوير هذا البروتوكول ، أن موقع الحقن هو عامل رئيسي لإطلاق عدوى فيروسية جهازية بنجاح عن طريق الحقن الزراعي 19. يفترض أن يكون حقن الموقع الموصى به باستمرار على النبات هو أكبر متغير ، لأن الموقع الدقيق لل meristem في شتلات الذرة لا يمكن اكتشافه بالعين تقريبا. لتقليل التباين بين الأشخاص ، يوصى بتشريح عدد قليل من شتلات الذرة وصولا إلى meristem لتصور موقعها بشكل أفضل (الشكل 3C). يجب أن يكون موقف meristem فيما يتعلق بعقدة coleoptilar هو نفسه تقريبا بالنسبة للنباتات التي يتراوح عمرها بين 4-7 أيام. بالإضافة إلى ذلك ، فإن ممارسة الحقن بسائل مصبوغ يوفر دليلا مرئيا بسهولة على كيفية ملء "اللقاح" لأزيز الورقة ، ولأن موقع الحقن مميز بالصبغة ، يمكن تأكيد دقة موقع الحقن (الشكل 3G ، H). الأنسجة المريستماتيكية هي الأكثر عرضة للحقن الزراعي ، ولكن حقن معلقات Agrobacterium مباشرة في هذا النسيج يؤدي إلى تأثيرات مورفولوجية غير مرغوب فيها (الشكل 6)19. تبقى النباتات ذات الميريستيم التالفة على قيد الحياة ، ولكن العيوب الناتجة غير مرغوب فيها ، وبالتالي ، يجب تجنب الحقن المباشر لهذا الأنسجة.
هناك العديد من المتغيرات التي قد تؤثر على الإطلاق الناجح للعدوى الفيروسية الجهازية عن طريق الحقن الزراعي لأن ثلاثة أنظمة بيولوجية معقدة (النبات والفيروس وسلالة Agrobacterium) يجب أن تتفاعل بتنسيق. ويمكن أن يساعد على هذا التفاعل المعقد الخلايا سريعة الانقسام في المنطقة الميرستيماتية، مما يجعلها موقعا مثاليا للتلقيح الزراعي19. يجب أن تكون سلالة Agrobacterium قادرة على إصابة خلايا الأنسجة النباتية لتوصيل الحمض النووي T الذي يحمل الجينوم الفيروسي ، ويجب أن يكون النبات عرضة للفيروس من أجل بدء التكاثر الفيروسي والعدوى الجهازية. تختلف الأنماط الجينية للذرة في قابليتها للفيروسات (على سبيل المثال ، Mo17 مقاوم ل FoMV) أو سلالات Agrobacterium ، ولكن يبدو أن الغالبية التي تم اختبارها عرضة لكل من FoMV و SCMV (الجدول 1 والجدول 2)53. على سبيل المثال ، قد يكون الخط الداخلي FR1064 وصنف الذرة الحلوة Golden Bantam عرضة بشكل خاص لكل من GV3101 Agrobacterium والمتجهات القائمة على FoMV.
يعد رقم الورقة التي تم أخذ عينات منها وتوقيت أخذ العينات ل RT-PCR أمرا بالغ الأهمية لإجراء تقييم دقيق للعدوى الفيروسية. في الأمثلة الموضحة هنا ، تم تحديد رقم الورقة من خلال البدء من الورقة الأولى المستديرة (المعروفة باسم "ورقة الإبهام") والعد لأعلى. تم أخذ عينات من الأوراق بمجرد توسيعها وبدأت الورقة التالية في الظهور. ومع ذلك ، قد تختلف الأوراق المثلى لأخذ العينات بناء على أنواع الفيروسات المستخدمة ، وظروف النمو ، والنمط الجيني للذرة. لذلك ، يوصى بإجراء تجربة دورة زمنية أولية عند تطبيق هذا البروتوكول على نظام فيروسات جديد لتحسين استراتيجية أخذ العينات فيما يتعلق بالإجازات والتوقيت.
يؤثر البناء المحدد المستخدم بشكل كبير على كفاءة هذا البروتوكول. على سبيل المثال، فإن المتجهات الفارغة، FoMV-EV و SCMV-EV، و FoMV-PDS و FoMV-LES22، وكلاهما يحتوي على إدخالات صغيرة (313 نقطة أساس و 329 نقطة أساس، على التوالي)، تنتج عادة أعلى النسب المئوية للنباتات ذات الأعراض الفيروسية في هذه التجارب (الجدولان 1 والجدول 2). ومع ذلك، فإن الفيروسات المؤتلفة التي تحمل إدخالات أكبر من GFP ORF (720 نقطة أساس) في FoMV-GFP و SCMV-GFP، لديها معدلات إصابة أقل بكثير بالمقارنة مع النباتات التي يتم حقنها بالناقل الفارغ أو هياكل إسكات الجينات. قد يكون هذا الاتجاه بسبب الآثار السلبية على اللياقة الفيروسية الناجمة عن زيادة كميات المواد الوراثية الخارجية في الجينوم الفيروسي. وقد أظهرت العديد من الدراسات أن استقرار إدراج النواقل الفيروسية النباتية يعتمد إلى حد كبير على حجم الإدراج وتسلسله36,54,55,56,57. بالإضافة إلى ذلك، كان هناك اختلاف ملحوظ في النسبة المئوية للنباتات التي تصاب بالعدوى بعد التلقيح إما بناقل FoMV أو SCMV الفارغ، مما يشير إلى الحاجة إلى عمل إضافي لتحسين هذا البروتوكول ل SCMV (الجدول 1). تشير هذه النتائج إلى أنه قد تكون هناك حاجة إلى بعض استكشاف الأخطاء وإصلاحها عند تطوير بنية ، لأن تسلسل وطول الجزء يمكن أن يؤثرا على الكفاءة.
بشكل عام ، أظهرت هذه الدراسة أن الحقن الزراعي لشتلات الذرة هو طريقة تلقيح فعالة لفيروسين مختلفين من فيروسات نبات الحمض النووي الريبي ، وتكوينات ناقلات متعددة ، و 11 نمطا وراثيا للذرة. يشير هذا العمل مع FoMV و SCMV ، مقترنا بالأعمال السابقة التي تستخدم الحقن مع فيروس مرقش كلوروتيك الذرة (MCMV) أو MSV ، إلى أن الحقن الزراعي مناسب لتلقيح شتلات الذرة بنسخ معدية من كل من فيروسات الحمض النووي الريبي والحمض النووي19،20،21،22. بالإضافة إلى ذلك ، يظهر هذا العمل أيضا أن الحقن الزراعي هو طريقة قابلة للتطبيق لناقلات VIGS و VOX ويمكن تطبيقه على النباتات التي لا يتجاوز عمرها أربعة أيام (الجدول 3). ومن المتوقع أن يتم تكييف البروتوكول المعروض هنا بسهولة من قبل علماء أحياء الذرة لتسهيل البحث في دراسات علم الجينوم الوظيفية التي تنطوي على إسكات الجينات العابرة (VIGS) والإفراط في التعبير (VOX). كما أن الحقن الزراعي لديه القدرة على تسهيل نهج تحرير الجينات القائمة على الفيروسات (VEdGE) التي كانت ستكون محدودة بخلاف ذلك بسبب الاعتماد على تحويل النبات ، مما قد يؤدي إلى تحسين كفاءة التحرير وكذلك إمكانية الوصول إليها58،59،60. وبالنظر إلى أن سلالة Agrobacterium المناسبة، والأنماط الجينية للذرة، والنواقل الفيروسية يتم دمجها بعناية، فمن المتوقع أن يصبح التلقيح عن طريق الحقن الزراعي أداة قيمة لتحليل وظائف الجينات العابرة في الذرة.

تم تصميم النسخ المعدية للعديد من الفيروسات النباتية لإسكات الجينات الناجم عن الفيروسات (VIGS) ، والإفراط في التعبير الجيني (VOX) ، ومؤخرا ، تحرير الجينات التي تدعم الفيروسات (VEdGE) 1،2،3،4،5،6،7،8،9،10،11 . مع تطوير تركيبات فيروسية جديدة ، يجب أيضا النظر في طرق لإصابة الأنسجة النباتية بنجاح بهذه الفيروسات المعدلة. تشمل الطرق الحالية لإطلاق العدوى الفيروسية في النباتات قصف الجسيمات ، أو التلقيح بالفرك لنسخ الحمض النووي الريبي في المختبر أو استنساخ الحمض النووي ، أو التلقيح بثقب الأوعية الدموية ، أو تلقيح Agrobacterium tumefaciens (التلقيح الزراعي) 5،12،13،14،15،16،17 . كل طريقة من طرق التطعيم هذه لها مزايا وعيوب متأصلة ، والتي تشمل التكلفة ، والحاجة إلى معدات متخصصة ، وجدوى داخل نظام معين للفيروسات النباتية. يفضل الطرق التي تستخدم تسلل أو حقن سلالات Agrobacterium التي تحتوي على تركيبات T-DNA الثنائية المصممة لتوصيل الفيروسات المؤتلفة ، لأنها بسيطة وغير مكلفة. ومع ذلك ، لا توجد طرق مفصلة للتلقيح الزراعي للأنواع أحادية الفلقة مثل Zea mays (الذرة).
تم نشر أحد التقارير الأولى عن التلقيح الزراعي لتسليم الفيروس في عام 1986 ، عندما تم إدخال جينوم فيروس فسيفساء القرنبيط (CaMV) في بنية T-DNA ، وتم تلقيح Agrobacterium الناتج الذي يحمل هذا البناء على نباتات اللفت18. ومنذ ذلك الحين تم تطوير طرق إضافية للتلقيح الزراعي. على سبيل المثال ، في حالة فيروس فسيفساء ذيل الثعلب (FoMV) ، يمكن استخدام Nicotiana benthamiana كمضيف وسيط لتوليد جزيئات الفيروس في الأوراق التي توفر مصدرا للتلقيح 6. إن التلقيح المطاطي للذرة باستخدام أوراق N. benthamiana المصابة فعال وسريع وبسيط ، لكن استخدام مضيف وسيط لا يعمل مع جميع الفيروسات التي تصيب الذرة. ففيروس فسيفساء قصب السكر، على سبيل المثال، لا يمكن أن يصيب N. benthamiana، مما يتطلب استخدام مصادر تلقيح بديلة للناقلات المشتقة من هذا الفيروس. في عام 1988 ، تم إدخال Agrobacterium التي تحتوي على فيروس خط الذرة (MSV) ، وهو فيروس DNA ، في شتلات الذرة عن طريق الحقن (الحقن الزراعي) ، مما يدل على أن طرق التلقيح القائمة على Agrobacterium مفيدة أيضا ل monocots19. على الرغم من هذا النجاح المبكر مع الحقن الزراعي ، فقد تم نشر عدد قليل من الدراسات التي تستخدم هذه التقنية في الذرة ، مما يترك أسئلة مفتوحة حول إمكانية تطبيق هذه الطريقة على فيروسات الحمض النووي الريبي وناقلات VIGS و VOX و VEdGE 20،21،22. ومع ذلك ، فإن الاستخدام الواسع النطاق للحقن الزراعي في أنواع monocot واعد ، لأن هذا النهج العام قد استخدم في السحلية والأرز والقمح 23،24،25،26،27،28.
تم تحسين هذا البروتوكول لسلالة FoMV و Agrobacterium GV3101 وتم تطبيقه أيضا على متجه SCMV. FoMV هو فيروس potexvirus مع مجموعة واسعة من المضيفين تشمل 56 نوعا من الأحاديات والثنائيات29. يحتوي FoMV على حاسة إيجابية تبلغ 6.2 كيلو قاعدة (kb) ، جينوم RNA أحادي الخيط يشفر خمسة بروتينات مختلفة من خمسة إطارات قراءة مفتوحة (ORFs) 30،31،32،33،34،35. تم تطوير FoMV سابقا إلى ناقل VIGS و VOX للذرة من خلال دمج استنساخ معدي في العمود الفقري البلازميد T-DNA 6,36,37. تم تعديل الجينوم الفيروسي لتطبيقات VIGS عن طريق إضافة موقع استنساخ (MCS1*) مباشرة في اتجاه مجرى بروتين المعطف (CP) (الشكل 1A)36. وفيما يتعلق بتطبيقي VOX وVEdGE، تم تكرار مروج الإنتاج الأنظف وأضيف موقع استنساخ ثان (MCS2) لتمكين إدراج تسلسلات ذات أهمية بين ORF 4 وCP (الشكل 1B)6. متجه FoMV الذي يحتوي على كل من MCS1 و MCS2 بدون إدراج هو متجه FoMV فارغ (FoMV-EV) (الشكل 1).
SCMV هو فيروس غير ذي صلة تم تطويره ل VOX في الذرة 38. وهو عضو في عائلة Potyviridae ، التي تم تصميم العديد من أعضائها للتعبير عن البروتينات الأجنبية في planta39,40,41,42,43,44. يشمل النطاق المضيف ل SCMV الذرة والذرة الرفيعة وقصب السكر45,46 ، مما يجعله ذا قيمة للدراسات الوظيفية الجينية في نباتات المحاصيل الرئيسية هذه 36,38. SCMV لديه إحساس إيجابي ، جينوم الحمض النووي الريبي أحادي الخيط يبلغ طوله حوالي 10 كيلو بايت في الطول 47,48. لإنشاء متجه SCMV VOX ، تم استخدام تقاطع P1 / HCPro الراسخ كموقع إدراج للتسلسلات غير المتجانسة38. ويتبع موقع الاستنساخ هذا تسلسل ترميز موقع انقسام البروتياز NIa-Pro، مما يؤدي إلى إنتاج بروتينات مستقلة عن البروتين المتعدد SCMV (الشكل 1C).
تم تحويل بلازميدات الحمض النووي T-DNA التي تحمل cDNA المعدية لهذه الفيروسات المؤتلفة إلى سلالة Agrobacterium GV3101. GV3101 هي سلالة من نوع النوبالين ، والتي من المعروف أنها قادرة على نقل الحمض النووي T-DNA إلى الأنواع أحادية الفلقة ، بما في ذلك الذرة 26،28،49. بالإضافة إلى ذلك ، استخدمت دراسات الحقن الزراعي السابقة سلالات C58 أو مشتقاتها GV3101 ، وكذلك 19،20،22،27.
تم استخدام ثلاثة جينات مميزة في تطوير هذا البروتوكول: اثنان لإسكات الجينات وواحد للتعبير الجيني. تم استخدام جزء من 329 زوج أساسي (bp) من آفة جين الذرة يحاكي 22 (les22 ، GRMZM2G044074) لبناء ناقل إسكات FoMV-LES22. عندما يتم إسكات les22 في الذرة ، تظهر بقع صغيرة مستديرة من الخلايا الميتة على طول الأوعية الدموية للأوراق التي تتوسع وتتجمع في مناطق واسعة من أنسجة الأوراق الميتة50. FoMV-PDS ، الذي يحتوي على جزء 313 نقطة أساس من جين الذرة الرفيعة phytoene desaturase (pds ، LOC110436156 ، هوية تسلسل 96٪ إلى pds الذرة ، GRMZM2G410515) ، يحفز إسكات PDS في الذرة ، مما يؤدي إلى خطوط صغيرة من الخلايا المبيضة ضوئيا على طول الأوعية الدموية للأوراق التي تطول بمرور الوقت51. تم استخدام تسلسل الترميز السليم لبروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) لإثبات التعبير عن البروتين لكل من FoMV (FoMV-GFP) و SCMV (SCMV-GFP). عادة ما يكون تعبير GFP في الأوراق أكثر قابلية للكشف في 14 يوما بعد التلقيح (DPI)6. على الرغم من وجود دراسات سابقة تستخدم الحقن الزراعي للناقلات الفيروسية في الذرة ، فقد أظهرت هذه التجارب فقط أن الحقن الزراعي يمكن أن يسهل العدوى الفيروسية من استنساخ معدي في شتلات الذرة ولا يتوسع إلى الفيروسات المؤتلفة المصممة لتطبيقات VIGS أو VOX 19,20,21,22. يعتمد البروتوكول المعروض هنا على طرق الحقن الزراعي السابقة ، وخاصة Grismley et al.19. بشكل عام ، تتوافق طريقة الحقن الزراعي هذه مع ناقلات VIGS و VOX ، ولا تتطلب معدات متخصصة أو مضيفات بديلة كمصادر للتلقيح ، وتقلل من الوقت الإجمالي والتكلفة اللازمين لإعداد وتنفيذ التطعيمات بالنسبة للطرق الشائعة الأخرى التي تتطلب البيولوجيا أو النسخ في المختبر. سيسهل هذا البروتوكول دراسات الجينوم الوظيفية في الذرة مع التطبيقات التي تشمل VIGS و VOX و VEdGE.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955450</td>
			<td>alternatively, BD 309659</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Corning Science</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1kb+ Ladder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10787018</td>
			<td>For assessing sizes of PCR products</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G x 5/8&#34; PrecisionGlide Needles</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28&#176;C Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Agrobacterium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For E. coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D134406</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A4800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>E-3120</td>
			<td>For making gels to check for virus/insert stability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrobacterium tumefaciens Strain GV3101</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Carries vir plasmid encoding T-DNA transfer machinery, RifR, GmR, from lab stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bsu36I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K1672</td>
			<td>Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit with Dnase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C298</td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5alpha Competent E. coli Cells</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Ligase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K1422</td>
			<td>Rapid DNA Ligation Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenediamine Tetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Peters Fertilizer 15-15-15 Concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat Inserts</td>
			<td>T.O. Plastics</td>
			<td>715357C</td>
			<td>For germinating seeds in trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flats</td>
			<td>T.O. Plastics</td>
			<td>710245C</td>
			<td>For germinating seeds in trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorCam</td>
			<td>Photon Systems Instruments</td>
			<td></td>
			<td>To assess maize plants for GFP expression before microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Electrophoresis Box</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A38</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-500</td>
			<td>For saving frozen stocks of bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Go-Taq, 2X</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144</td>
			<td>for pHing solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>109827</td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin, Monosulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Pots</td>
			<td>Kordlok</td>
			<td>SQL0550</td>
			<td>5x5x4&#34; or bigger.&#160; For transplanting seedlings.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani (LB) Broth, Miller</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>M1245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maize Golden Bantam Sweet Corn Seed</td>
			<td>American Meadows, West Coast Seeds</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maize Inbred Seed</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Our seed comes from our institution, but we are not able to provide this for other researchers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxima H Minus Reverse Transcriptase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EP0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ</td>
			<td>Elga</td>
			<td></td>
			<td>Purelab Ultra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch PCR &#38; DNA Cleanup Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peters Excel 15-5-15 Fertilizer</td>
			<td>ICL Specialty Fertilizers</td>
			<td>G99140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, 95 mm x 15 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875714G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P171</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Our primers were synthesized through our institutional DNA facility or through IDT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PspOMI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>557303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase A</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12091021</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SbfI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For weighing chemicals for media or buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil Substrate</td>
			<td>SunGro Horticulture</td>
			<td>SS#1-F1P</td>
			<td>Sunshine Mix #1/Fafard-1P, any soil mix that maize grows well in is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For measuring OD600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sybr Safe, 10,000X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S33102</td>
			<td>For making gels to check for virus/insert stability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP154</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>15596018</td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh Paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For weighing chemicals for media or buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XbaI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0145</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct agroinoculation of maize seedlings by injection with recombinant foxtail mosaic virus and sugarcane mosaic virus infectious clones

تستخدم مناهج التلقيح القائمة على Agrobacterium على نطاق واسع لإدخال النواقل الفيروسية في الأنسجة النباتية. تفصل هذه الدراسة بروتوكولا لحقن شتلات الذرة بالقرب من الأنسجة المرستماتية مع Agrobacterium الذي يحمل ناقلا فيروسيا. تم استخدام مستنسخات فيروس الفسيفساء المؤتلف ذيل الثعلب (FoMV) المصممة لإسكات الجينات والتعبير الجيني لتحسين هذه الطريقة ، وتم توسيع استخدامها لتشمل فيروس فسيفساء قصب السكر المؤتلف (SCMV) المصمم للتعبير الجيني. يتم إدخال شظايا الجينات أو تسلسلات الترميز ذات الأهمية في جينوم فيروسي معدل ومعد تم استنساخه في ناقل البلازميد الثنائي T-DNA pCAMBIA1380. يتم تحويل بنى البلازميد الناتجة إلى سلالة Agrobacterium tumefaciens GV3101. يمكن حقن شتلات الذرة التي لا يتجاوز عمرها 4 أيام بالقرب من عقدة coleoptilar مع إعادة تعليق البكتيريا في محلول MgSO4. أثناء العدوى بالبكتيريا الأكروباكتيرية ، يتم نقل الحمض النووي T-DNA الذي يحمل الجينوم الفيروسي إلى خلايا الذرة ، مما يسمح بنسخ جينوم الحمض النووي الريبي الفيروسي. عندما يتكاثر الفيروس المؤتلف وينتشر بشكل منهجي في جميع أنحاء النبات ، يمكن ملاحظة الأعراض الفيروسية والتغيرات المظهرية الناتجة عن إسكات آفة الجينات المستهدفة التي تحاكي 22 (les22) أو phytoene desaturase (pds) على الأوراق ، أو يمكن الكشف عن التعبير عن بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) عند الإضاءة باستخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية أو المجهر الفلوري. للكشف عن الفيروس وتقييم سلامة الإدراج في وقت واحد ، يتم استخراج الحمض النووي الريبي من أوراق النبات المحقون ويتم إجراء RT-PCR باستخدام الاشعال المحيطة بموقع الاستنساخ المتعدد (MCS) الذي يحمل التسلسل المدخل. وقد استخدم هذا البروتوكول بفعالية في العديد من الأنماط الجينية للذرة ويمكن توسيعه بسهولة ليشمل ناقلات فيروسية أخرى، مما يوفر أداة يسهل الوصول إليها لإدخال النواقل الفيروسية في الذرة.

Watch this Scientific Journal Video about Direct Agroinoculation of Maize Seedlings by Injection with Recombinant Foxtail Mosaic Virus and Sugarcane Mosaic Virus Infectious Clones at JoVE.com

Direct Agroinoculation of Maize Seedlings by Injection with Recombinant Foxtail Mosaic Virus and Sugarcane Mosaic Virus Infectious Clones

يتم تقديم بروتوكول الحقن القائم على Agrobacterium (الحقن الزراعي) لتلقيح فيروس فسيفساء ذيل الثعلب وفيروسات فسيفساء قصب السكر المستنسخة في شتلات الذرة. يؤدي التلقيح بهذه الطريقة إلى العدوى الفيروسية ، وإسكات الجينات التي يسببها الفيروس للجينات الواسمة ، والإفراط في التعبير الفيروسي عن GFP.

التلقيح الزراعي المباشر لشتلات الذرة عن طريق الحقن مع فيروس فسيفساء ذيل الثعلب المؤتلف وفيروس فسيفساء قصب السكر المستنسخات المعدية

Agrobacterium-based inoculation approaches are widely used for introducing viral vectors into plant tissues. This study details a protocol for the ...

يسمح هذا البروتوكول بتلقيح النواقل الفيروسية مباشرة في مصانع الذرة التي يمكن تطبيقها بسهولة في معظم إعدادات المختبرات دون الحاجة إلى أي معدات متخصصة باهظة الثمن. التلقيح المباشر يلغي استخدام مضيف بديل كمصدر للتلقيح ، مما يوفر الوقت والموارد. ويمكن تطبيق هذه الطريقة على ناقلات فيروسية إضافية، وخطوط الذرة، وربما أنواع أخرى من الأحاديات.ابدأ بزراعة 1 إلى 2 من بذور الذرة في وسط النمو القائم على الخث في إدراج صغير يوضع داخل الصواني. ضع الصواني في غرفة نمو أقل من 16 ساعة يوميا عند 25 درجة مئوية و 8 ساعات ليلا عند 22 إلى 25 درجة مئوية ، أو في دفيئة عند 22 إلى 25 درجة مئوية مع 16 ساعة يوميا و 8 ساعات ليلا. سقي النباتات بانتظام وتسميدها مرة واحدة في الأسبوع باستخدام 15-5-15 سماد سائل بتركيز 330 جزءا في المليون.تحضير agrobacterium للحقن عن طريق تلقيح سلالة agrobacterium التي تحتوي على البنية الفيروسية المطلوبة في وسائط LB بالمضادات الحيوية. ثم ، احتضن القارورة أو الأنابيب عند 28 درجة مئوية أثناء الاهتزاز عند 225 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي ، قم بتكوير البكتيريا عن طريق التركيز عند 4،000 مرة G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتخلص من supernatant.ثم ، اغسل الكريات بملليلتر واحد من الماء منزوع الأيونات. أعد تعليق الكريات في ملليلتر واحد من محلول كبريتات المغنيسيوم 10 ملليمولار ، وقم بقياس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر. ثم اضبطه على 1.0.استخدم شتلات الذرة التي يتراوح عمرها بين 4 و 7 أيام لحقن البكتيريا الزراعية. تجميع حقنة وإبرة. حقن التعليق البكتيري بلطف 2-3 ملم فوق العقدة القولونية حتى يملأ الكوليوبتيل ، أو يكون مرئيا في الوبر ، معلقا في مرحلة نمو النباتات.حقن جميع الشتلات وتغيير المحقنة والإبر لحقن كل بناء. تأكيد العدوى المظهرية من خلال مراقبة الآفات من إسكات الجينات الضابطة ، والآفة تحاكي 22 أو ديساتوراز فيتوين على الأوراق. استخدم جهاز تصوير التألق للفحص السريع للنباتات والمجهر الفلوري للكشف عن وجود تعبير GFP.إجراء تحليل التعبير الجيني للكشف الجزيئي عن العدوى. استخراج الحمض النووي الريبي الكلي من أوراق النباتات المصابة بعد 14 إلى 21 يوما من الإصابة ، وتوليف الحمض النووي الريبي الأول كما هو موضح في مخطوطة النص. قم بإجراء النسخ العكسي PCR لتأكيد العدوى وتحديد سلامة الجين أو جزء الجين ذي الأهمية باستخدام مواد تمهيدية محددة مصممة للتركيبات الفيروسية المختلفة.تصور منتج PCR على هلام أغاروز 1٪ يحتوي على بقعة حمض نووي لتحديد وجود أو عدم وجود فيروس وجزء من الجين أو الجين. تم استخدام هذا البروتوكول لإدخال الفيروسات المؤتلفة المصممة للجين في شتلات الذرة. بعد حوالي 12 يوما من الحقن ، لوحظ إسكات الأنماط الظاهرية على الأوراق كنخر وتبييض ضوئي.تم الكشف عن وجود بناء في الأوراق بعد العدوى من خلال مراقبة تعبير البروتين الفلوري الأخضر تحت التألق باستخدام مرشح GFP مختلف. تم تصور تعبير بروتين الفلورسنت الأخضر في الأوراق المصابة بفيروس فسيفساء ذيل الثعلب على أنها مناطق صغيرة مثقوبة من التألق موزعة عبر الأوراق وكبقع كبيرة في الأوراق المصابة بفيروس فسيفساء قصب السكر. باستخدام تحليل التعبير الجيني ، تم تأكيد عدوى فيروس فسيفساء ذيل الثعلب الجهازية ولوحظ إسكات الجينات أو قمع ديساتوراز فيتوين والآفة التي تحاكي 22.استخدم البناء أيضا كفاءة العدوى المتأثرة. في حالة عدوى فيروس فسيفساء ذيل الثعلب ، فإن فيروس فسيفساء ذيل الثعلب الناقل الفارغ ، وآفة فيروس فسيفساء ذيل الثعلب التي تحاكي 22 عادة ما يكون لديها أعلى كفاءة العدوى بنسبة 53٪ و 54٪ على التوالي. فيروس الفسيفساء ذيل الثعلب phytoene desaturase بكفاءة أقل قليلا عند 39٪ و foxtail فسيفساء فيروس بروتين الفلورسنت الأخضر ، عند أدنى كفاءة عند 16٪ وفي الوقت نفسه ، كانت كفاءة العدوى بفيروس فسيفساء قصب السكر بروتين الفلورسنت الأخضر 8٪ التوقيت وستستند الأعراض إلى الناقل الفيروسي وخط الذرة المستخدم.قد لا يعني عدم وجود نمط ظاهري مرئي عدم وجود إسكات أو تعبير. يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على تقنيات تحرير الجينات من خلال تحسين طرق التسليم للحمض النووي الريبي المرشد.

Research

JoVE Journal

Biology

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

الوقس عدوى الفيروس والتحليل الزمني في التعبير الجيني الفيروسات : الجزء 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

الوقس عدوى الفيروس والتحليل الزمني في التعبير الجيني الفيروسات : الجزء 2

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

الوقس عدوى الفيروس والتحليل الزمني في التعبير الجيني الفيروسات : الجزء 3

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

تقنية لتصور في الوقت نفسه للفيروسات محددة CD8 + الخلايا T والخلايا المصابة بالفيروسات في الموضع</em

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences

فسيفساء Transgenesis اسماك الزرد لتقييم متواليات محسن

The completion of the human genome sequence, along with that of many other species, has highlighted the challenge of ascribing specific function to non ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

التسليم المباشر للMorpholinos MIF في Otocyst اسماك الزرد عن طريق الحقن وElectroporation يؤثر على التنمية الداخلية الأذن

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

كيميائيا سدت [ميكروأري] لتحديد ملامح عالية الإنتاجية من تعدد في الإرسال ارتباط بالغليكوزيل بروتين معين في عينات مجمع

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

على البروتين MultiBac مجمع منصة الإنتاج في EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

والطماطم / GFP-FLP / FRT الطريقة للتصوير لايف من الفسيفساء الكبار<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; خلايا مستقبلة للضوء

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination

التعبير وتنقية جزيئات تشبه الفيروسات للتطعيم

Virus-like particles (VLPs) and subviral particles (SVPs) are an alternative approach to viral vaccine design that offers the advantages of increased ...