Name: direct agroinoculation of maize seedlings by injection with recombinant foxtail mosaic virus and sugarcane mosaic virus infectious clones
Uploaded: 2021-02-27T14:30:00
Duration: 5 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Agroinoculation of Maize Seedlings by Injection with Recombinant Foxtail Mosaic Virus and Sugarcane Mosaic Virus Infectious Clones at JoVE.com

Iowa State University er en del af et team, der støtter DARPAs Insect Allies-program HR0011-17-2-0053. Dette arbejde blev også støttet af Iowa State University Plant Sciences Institute, Iowa State University Crop Bioengineering Center, USDA NIFA Hatch projektnummer 3808 og State of Iowa Funds. KLH blev også delvist støttet af Iowa State University Predictive Plant Phenomics kandidatuddannelsesprogram finansieret af National Science Foundation (DGE #1545453) og af Agricultural and Food Research Initiative tilskud nr. 2019-07318 fra USDA National Institute of Food and Agriculture. Finansiererne havde ingen rolle i udformningen af undersøgelsen og indsamlingen, analysen og fortolkningen af data og i at skrive manuskriptet. Eventuelle meninger, resultater og konklusioner eller anbefalinger, der udtrykkes i dette materiale, er forfatternes og afspejler ikke nødvendigvis finansieringskildernes synspunkter.
Vi takker Nick Lauter (USDA-ARS, Ames, IA) for frø af majs indavlede linjer, Christian F. Montes-Serey (Iowa State University) for at gøre FoMV-GFP klonen og Tyler Austin (Iowa State University) for teknisk bistand.

1. Plasmid konstruktion
BEMÆRK: Denne protokol kan anvendes på andre virale vektorer eller Agrobacterium-stammer , men dette kan påvirke den samlede succes med podning ved agroinjektion. Udfør altid bakterielle podnings- og pletteringstrin i en laminær strømningshætte.
<ol><li>FoMV-lyddæmpningskonstruktion BEMÆRK: Luria-Bertani (LB) medier (Miller) bruges til alle medier, medmindre andet er angivet. Flydende LB fremstilles ved at suspendere 25 g granulat i 1.000 ml destilleret vand og autoklavere i 15 minutter ved 121 °C. Solid LB-medier fremstilles ligeledes med tilsætning af 1,5% agar før autoklavering. Antibiotika tilsættes, efter at LB er afkølet til ~60 °C, og opløsningen hældes i 95 x 15 mm Petri-plader. De antibiotikakoncentrationer, der skal anvendes, er som følger: rifampicin (rif) ved 25 μg/ml, gentamycin (gent) ved 50 μg/ml og kanamycin (kan) ved 50 μg/ml.<ol><li>PCR forstærker fragmenter fra majsgenet, der skal dæmpes (f.eks. les22 eller pds) ved hjælp af en fremadrettet primer med et PacI-begrænsningssted og en omvendt primer med et XbaI-begrænsningssted. Dette vil muliggøre ligering af genfragmenterne i MCS1* af FoMV-pCAMBIA1380 binær vektor i antisense-orienteringen. BEMÆRK: Opsæt PCR ved hjælp af en HIGH-fidelity DNA-polymerase, fremadgående og omvendte primere ved 10 μM hver, plasmid-DNA-skabelon og vand efter DNA-polymerasespecifikationerne. Forstærk i 35 cyklusser ved hjælp af en udglødningstemperatur i henhold til DNA-polymerasen og primersmeltetemperaturen (Tm) og en 30 s forlængelse pr. Kilobase, der skal amplificeres.</li>
		<li>Udfør PCR-rensning ved hjælp af et PCR-rensningssæt i henhold til kitspecifikationerne.</li>
		<li>Fordøje det rensede PCR-produkt og FoMV-EV med restriktionsenzymerne XbaI og PacI. Brug 1 μg plasmid eller hele det rensede PCR-produkt, 2 μL 10x buffer, 1 μL restriktionsenzym, og tilsæt vand for at lave et 20 μL endeligt reaktionsvolumen. Inkuber i henhold til enzymspecifikation.</li>
		<li>Ligate det fordøjede PCR-produkt og FoMV-EV sammen med T4 DNA-ligase i henhold til producentens protokol.</li>
		<li>Omdan det ligerede plasmid til DH5α kemisk kompetente E. coli-celler ved hjælp af varmechokmetoden.<ol>
<li>Tø celler på is og tilsæt 3 μL plasmid til røret. Inkuber på is i 30 minutter, og opvarm derefter stød i 30 s ved 42 ° C.</li>
			<li>Læg på is i 5 minutter, tilsæt 200 μL super optimal bouillon med katabolisk undertrykkelse (SOC) og lad E. coli-celler komme sig i SOC-medier i 1 time ved 37 ° C med omrystning ved 225 o / min.</li>
			<li>Plade på kanamycin selektive LB-medier og inkuber ved 37 °C natten over.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Kontroller kolonierne for nøjagtige kloner ved Sanger-sekventering ved hjælp af primerne FM-5840F og FM-6138R (supplerende tabel 1). Indsend 250 ng plasmid-DNA til en facilitet, der udfører Sanger-sekventering. Til dette eksperiment blev prøver sendt til Iowa State University DNA Core Facility.</li>
		<li>Inokuler 2 ml flydende LB med den valgte koloni og inkuber ved 37 °C natten over med rystelser ved 225 o / min. Uddrag plasmid-DNA fra natten over-kulturen gennem et alkalisk lysisplasmid-DNA-præparat52.</li>
		<li>Transformer plasmid-DNA til Agrobacterium-stamme GV3101-celler ved hjælp af fryse-optøningsmetoden. Lad 100 μL kemisk kompetente celler tø op på is, tilsæt 1-5 μL plasmid og inkuber på is i 30 minutter. Anbring i flydende nitrogen i 1 min., og inkuber derefter ved 37 °C i 3 min. Tilsæt 1 ml SOC, lad det komme sig i 2-3 timer ved 28 °C med omrystning, plade på rif, gent og kan selektive LB-medier og inkuber ved 28 °C i 2 dage.</li>
		<li>Skærmkolonier for tilstedeværelsen af indsats med koloni PCR. Vælg en enkelt bakteriekoloni og bland den i 30 μL vand. Der opstilles en PCR-reaktion ved at tilsætte 12,5 μL polymerasemasterblanding, 1,25 μL af hver 10 μM-primer, FM-5840F og FM-6138R, 3 μL af bakteriekolonisuspensionen og vand til et slutvolumen på 25 μL. Cyklus 35 gange med en udglødningstemperatur på 64 °C og en forlængelsestid på 1 min (1 min for hver kb amplificeret).</li>
		<li>Inokuler 2-5 ml flydende LB (rif, gent, kan) med den korrekte Agrobacterium koloni. Lad det vokse natten over ved 28 °C med rystelser ved 225 o/min.</li>
		<li>Bland overnatningskulturen med en 50% glycerolopløsning 1:1. Opbevares ved -80 °C til langtidsopbevaring.</li>
	</ol></li>
	<li>FoMV udtryk konstruktion<ol>
<li>PCR forstærker kodningssekvensen af interesse, herunder start- og stopkodoner (f.eks. GFP) som beskrevet i 1.1.1, og tilføjer et Bsu36I-begrænsningssted på den forreste primer og et PspOMI-begrænsningssted på den omvendte primer for at muliggøre retningsbestemt kloning i forstandsorienteringen til MCS2.</li>
		<li>Udfør PCR-rensning ved hjælp af et PCR-rensningssæt i henhold til kittets specifikationer.</li>
		<li>Sammendrag PCR-produktet og FoMV-EV med restriktionsenzymerne Bsu36I og PspOMI som beskrevet i 1.1.3.</li>
		<li>Ligate det fordøjede PCR-produkt og FoMV-EV sammen med T4 DNA-ligase i henhold til producentens protokol.</li>
		<li>Omdannes til DH5α kemisk kompetente E. coli-celler ved hjælp af varmechokmetoden som beskrevet i 1.1.5. Plade på kanamycin selektive LB-medier og inkuber ved 37 °C natten over.</li>
		<li>Kontroller kolonierne for nøjagtige kloner ved Sanger-sekventering som beskrevet i 1.1.6 ved hjælp af primerne 5AmuS2 og 5AmuA2 (supplerende tabel 1).</li>
		<li>Inokuler 2 ml flydende LB med den valgte koloni og inkuber ved 37 °C natten over med omrystning ved 225 o/min. Uddrag plasmid-DNA fra natten over-kulturen gennem et alkalisk lysisplasmid-DNA-præparat52.</li>
		<li>Plasmid-DNA omdannes til Agrobacterium-stamme GV3101 kemisk kompetente celler ved hjælp af fryse-optøningsmetoden som beskrevet i 1.1.8. Plade på rif, gent og kan selektive LB medier og inkubere ved 28 °C i 2 dage.</li>
		<li>Skærmkolonier for tilstedeværelse af indsats med koloni PCR ved hjælp af primerne 5AmuS2 og 5AmuA2.</li>
		<li>Inokuler 2-5 ml flydende LB (rif, gent, kan) med den korrekte Agrobacterium koloni. Ryst natten over ved 225 o / min ved 28 ° C.</li>
		<li>Bland overnatningskulturen med en 50% glycerolopløsning 1:1. Opbevares ved -80 °C til langtidsopbevaring.</li>
	</ol></li>
	<li>SCMV udtryk konstruktion<ol>
<li>PCR forstærker genet af interesse (f.eks. GFP) eksklusive stopkodonet som beskrevet i 1.1.1, herunder et PspOMI-fordøjelsessted på den fremadrettede primer og et SbfI-fordøjelsessted på den omvendte primer for at muliggøre retningsbestemt kloning i den binære vektor SCMV-pCAMBIA1380. BEMÆRK: Insert skal klones i ramme med det virale polyprotein.</li>
		<li>Udfør PCR-rensning ved hjælp af et PCR-rensningssæt i henhold til kittets specifikationer.</li>
		<li>Sammendrag PCR-produktet og SCMV-EV med restriktionsenzymerne PspOMI og SbfI som beskrevet i 1.1.3.</li>
		<li>Ligate det fordøjede PCR-produkt og SCMV-EV sammen med T4 DNA-ligase i henhold til producentens protokol.</li>
		<li>Produktet omdannes til DH5α kemisk kompetente E. coli-celler ved hjælp af varmechokmetoden som beskrevet i 1.1.5. Plade på kan selektive LB medier og inkubere ved 37 °C natten over.</li>
		<li>Skærmkolonier for nøjagtige kloner ved Sanger-sekventering som beskrevet i 1.1.6 ved hjælp af primerne SC-745F og HCProR1 (supplerende tabel 1).</li>
		<li>Inokuler 2 ml flydende LB med den valgte koloni og inkuber ved 37 °C natten over med rystelser ved 225 o / min. Uddrag plasmid-DNA'et fra den overnattende kultur gennem et alkalisk lysisplasmid-DNA-præparat52.</li>
		<li>Plasmid-DNA'et omdannes til Agrobacterium-stamme GV3101 kemisk kompetente celler ved hjælp af fryse-optøningsmetoden som beskrevet i 1.1.8. Plade på rif, gent og kan selektive LB medier og inkubere ved 28 °C i 2 dage.</li>
		<li>Screene kolonier for tilstedeværelse af indsats med koloni PCR med primerne SC-745F og HCProR1 som beskrevet i 1.1.9.</li>
		<li>Inokuler 2-5 ml flydende LB (rif, gent, kan) med den korrekte Agrobacterium koloni. Ryst natten over ved 225 o / min ved 28 ° C.</li>
		<li>Bland overnatningskulturen med en 50% glycerolopløsning 1:1. Opbevares ved -80 °C til langtidsopbevaring.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Forberedelse af frøplanter
<ol><li>Plant 1-2 majsfrø (»Golden Bantam«-sukkermajs, FR1064, B73 osv.) i tørvebaseret vækstmedium i små skær anbragt i bakker 4-7 dage før injektion. Anbring i et vækstkammer under 16 timer dage ved 25 ° C og 8 timer nætter ved 22 ° C (~ 185 fotosyntetisk aktiv stråling (PAR)) eller i et drivhus under 16 timer dage ved 22-25 ° C og 8 timer nætter ved 22-25 ° C (350-400 PAR). BEMÆRK: Følsomheden over for Agrobacterium varierer mellem majsgenotyper, hvilket påvirker succesraten. Derudover kan nogle virale vektorer være uforenelige med visse majsgenotyper.</li>
	<li>Vand regelmæssigt og gød en gang om ugen med 15-5-15 flydende gødning ved 330 dele pr. Million (PPM).</li>
</ol>3. Fremstilling af Agrobacterium
<ol><li>En dag før injektionen skal du forberede LB flydende medier med det passende antibiotikum (rif, gent, kan) og inokulere med Agrobacterium-stammen , der bærer den ønskede virale konstruktion. Det anbefales at tilsætte 20 μL glycerolbestand i 50 ml LB, hvilket skal give tilstrækkelig bakteriekultur til at inokulere >100 planter og kan skaleres op eller ned efter behov. BEMÆRK: Forbered nok inokulum til at have en endelig mængde bakteriel suspension på mindst 1 ml ved en optisk densitet på 600 nm (OD600) på 1,0 for hver 4-5 planter.</li>
	<li>Ryst ved 225 o / min ved 28 ° C i 24 timer.</li>
	<li>Pelletsbakterier i 10 min ved 4.000 x g ved stuetemperatur. Kassér supernatanten.</li>
	<li>Vask pillen grundigt med 1 ml deioniseret (DI) vand ved pipettering eller blid hvirvel.</li>
	<li>Gentag trin 3.3 for at pille bakterier.</li>
	<li>Resuspend pillen i 1 ml 10 mM MgSO4-opløsning ved pipettering eller skånsom hvirvel.<ol>
<li>Tilsæt eventuelt 200 μM acetosyringon til opløsningen. Selvom det er almindeligt anvendt, forbedrer acetosyringon kun transformationsevnen hos nogle Agrobacterium-stammer . Forfatterne har ikke fundet ud af, at tilsætningen af acetosyringon påvirker effektiviteten i denne protokol (supplerende tabel 2). BEMÆRK: 10 mM MgSO4-opløsning kan fremstilles af en 1 M stamopløsning med en pH på 6,3 opbevaret ved stuetemperatur. Opløsningen vil sandsynligvis ikke kræve pH-justering.</li>
	</ol>
</li>
	<li>OD600 af prøven måles med et spektrofotometer og fortyndes til 1,0 OD600 med 10 mM MgSO4-opløsning. BEMÆRK: Dette er et sikkert stoppested. Bakteriel suspension kan opbevares ved stuetemperatur i op til 5 timer før injektion.</li>
</ol>4. Injektion
BEMÆRK: Majsplanter fra 4-7 dage gamle kan bruges til injektion. Frøplantevæksten påvirkes i høj grad af vækstbetingelser, mængden af PAR (dvs. højere PAR i drivhuset end i vækstkammeret) og genotype, blandt andet, der kan være vanskelig at kontrollere under drivhusforhold. Planter kan injiceres så unge som 4 dage gamle, når de er 2-3 cm høje uden blade udvidet og så gamle som 7 dage, når det nederste afrundede blad udvides. Succesraten for disse podningsmetoder falder hurtigt, når planterne ældes mere end 7 dage efter såning. Injektionsstedet er det samme, uanset plantens alder.
<ol><li>Iført sikkerhedsbriller skal du injicere bakteriesuspensionen i kimplanterne 2-3 mm over coleoptilar-knuden ved hjælp af en 25G x 5/8 "nål fastgjort til en 1 ml engangssprøjte. BEMÆRK: Den coleoptilar knude er, hvor krone rødder til sidst vil danne. Dette er den laveste knude på planten. Typisk vil der ske en farveændring fra grøn til hvid ved og under knuden. Injektionsstedet er lige over meristemet. Dissekering af et par frøplanter på dette stadium kan hjælpe med at visualisere placeringen af meristemet og dermed det rette injektionssted.</li>
	<li>Påfør blidt tryk på sprøjten, indtil suspensionen fylder koleoptilen eller er synlig i hvirvlen, afhængigt af plantens vækststadium. Dette er ca. 100-200 μL suspension. BEMÆRK: Hvis det er svært at injicere suspensionen i frøplanten, kan injektionsstedet være for lavt. Moderat tryk er alt, hvad der skal være nødvendigt for at injicere suspensionen.</li>
	<li>Injicer alle frøplanter, skift sprøjter og nåle til hver konstruktion.</li>
</ol>5. Fortsat plantepleje
<ol><li>Transplanter de injicerede frøplanter til 13 x 13 x 15 cm eller større potter, når de er 7-8 dage gamle.</li>
	<li>Oprethold vækstbetingelser (16 timers fotoperiode og befrugtning en gang om ugen).</li>
</ol>6. Bekræftelse af infektion (fænotypisk og RT-PCR)
<ol><li>Fænotypisk score planter mellem 14-21 DPI. Læsioner fra hæmning af kontrolgenernes læsion efterligner 22 eller phytoen desaturase kan let ses på bladene og adskiller sig fra FoMV symptomer. GFP-ekspression kan detekteres via fluorescerende mikroskopbilleddannelse eller anden UV-lysbilleddannelse. BEMÆRK: Nogle konstruktioner / virale vektorer kan tage længere tid at vise symptomer eller måske slet ikke vise nogen symptomer. Høje lysforhold øger i høj grad fænotyperne forårsaget af hæmning af læsion efterligner 22 og phytoen desaturase. Læsioner kan være mindre synlige eller fraværende, hvis planter opretholdes under lavere lysforhold såsom et vækstkammer, men den faktiske infektionshastighed som bestemt af RT-PCR bør ikke påvirkes (tabel 1).</li>
	<li>For at bekræfte infektion molekylært, prøveblad 6 mellem 14-21 DPI og ekstrahere total RNA ved anvendelse af en phenol-chloroformekstraktion i henhold til producentens instruktion.</li>
	<li>Brug af det ekstraherede RNA som en skabelon til at generere førstestrengs cDNA.<ol>
<li>CDNA-reaktionen opstilles med op til 5 μg total RNA, 1 μL tilfældige hexamerprimere, 1 μL oligo (dT)18 primere, 1 μL dNTP'er, 1 μL omvendt transkriptase og vand til et endeligt volumen på 14,5 μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Brug primere designet til den virale konstruktion og cDNA som skabelon til at udføre PCR på hver prøve for at bekræfte virusinfektion og bestemme integriteten af genet eller genfragmentet af interesse som beskrevet i 1.1.1, undtagen reducere cyklusser til 25 for FoMV og 30 for SCMV for at undgå falske positiver.<ol>
<li>Til FoMV-dæmpningskonstruktioner skal du bruge primere FM-5840F og FM-6138R til at forstærke på tværs af MCS1*, som indeholder majsgenfragmentet. Til FoMV-ekspressionskonstruktioner skal du bruge primerne 5AmuS2 og 5AmuA2 til at forstærke på tværs af MCS2, som indeholder det indsatte gen.</li>
		<li>Til SCMV-ekspressionskonstruktioner skal du bruge primere SC745-F og HCProR1 til at forstærke på tværs af MCS, som indeholder det indsatte gen (supplerende figur 3).</li>
		<li>For et endogent kontrolgen skal du bruge primere ZmActS og ZmActA, som forstærker et mRNA-fragment af majsaktin (GRMZM2G126010) eller primere ZmUbiF og ZmUbiR, som forstærker et mRNA-fragment af majspolyubiquitin (GRMZM2G409726_T01).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Visualiser PCR-produktet på en 1% agarosegel indeholdende en nukleinsyreplet for at bestemme tilstedeværelsen eller fraværet af virus og gen eller genfragment.</li>
</ol>

Forskerne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Agrobacterium er et vigtigt værktøj, der letter adskillige molekylærbiologiske teknikker i planterelateret forskning. Denne undersøgelse giver en agroinjektionsprotokol til inokulering af FoMV- og SCMV-virale vektorer direkte i majsvæv til VIGS- og VOX-applikationer. Hovedmålet er at øge letheden og nytten af virusbaserede teknologier til forskning i monocot afgrødeplanter. Selv om der er rapporteret om direkte agroinokulering af majs for nogle få vira, er forfatterne ikke bekendt med en detaljeret protokol, og der er ingen eksempler på VIGS- og VOX-applikationer i disse undersøgelser19,22.
Det er blevet rapporteret og blev bekræftet under udviklingen af denne protokol, at injektionsstedet er en nøglefaktor for en vellykket lancering af en systemisk virusinfektion via agroinjektion19. Konsekvent injektion af den anbefalede placering på planten antages at være den største variabel, fordi meristemets nøjagtige position i majsplanter næsten ikke kan detekteres af øjet. For at minimere interpersonel variation anbefales det at dissekere et par majsplanter ned til meristemet for bedre at visualisere dets placering (figur 3C). Meristemets position i forhold til coleoptilar knuden skal være nogenlunde den samme for planter i alderen 4-7 dage gamle. Derudover giver praktisering af injektion med en farvet væske en let synlig demonstration af, hvordan "inokulumet" fylder bladhvirvelen, og fordi injektionsstedet er markeret med farvestof, kan nøjagtigheden af injektionsstedet bekræftes (figur 3G,H). Meristematisk væv er de mest modtagelige for agroinjektion, men injektion af Agrobacterium-suspensioner direkte i dette væv resulterer i uønskede morfologiske virkninger (figur 6)19. Planter med beskadigede meristemer overlever, men de resulterende defekter er uønskede, og derfor bør direkte injektion af dette væv undgås.
Der er flere variabler, der kan påvirke den vellykkede lancering af en systemisk virusinfektion via agroinjektion, fordi tre komplekse biologiske systemer (plante-, virus- og Agrobacterium-stamme) skal interagere i koordination. Dette komplekse samspil kan hjælpes på hjælp af de hurtigt delende celler i det meristematiske område, hvilket gør det til et ideelt sted for agroinokulering19. Agrobacterium-stammen skal kunne inficere celler i plantevævet for at levere det T-DNA, der bærer det virale genom, og planten skal være modtagelig for virussen for at kunne igangsætte viral replikation og systemisk infektion. Majsgenotyper adskiller sig i deres modtagelighed for vira (f.eks. Mo17 er resistent over for FoMV) eller Agrobacterium-stammer, men de fleste, der blev testet, synes at være modtagelige for både FoMV og SCMV (tabel 1 og tabel 2)53. For eksempel kan den indavlede linje FR1064 og sødmajssorten Golden Bantam være særligt modtagelige for både GV3101 Agrobacterium og FoMV-baserede vektorer.
Bladnummeret og tidspunktet for prøveudtagning for RT-PCR er afgørende for nøjagtig vurdering af virusinfektion. I de eksempler, der er vist her, blev bladtallet bestemt ved at starte ved det første afrundede blad (almindeligvis kendt som "tommelfingerbladet") og tælle opad. Bladene blev samplet, når de var udvidet, og det næste blad var begyndt at dukke op. Hvilke blade der er optimale til prøveudtagning, kan dog variere afhængigt af de anvendte virusarter, vækstbetingelser og majsgenotype. Derfor anbefales et indledende tidskursuseksperiment, når denne protokol anvendes på et nyt virussystem for at optimere prøveudtagningsstrategien med hensyn til blade og timing.
Den specifikke konstruktion, der anvendes, påvirker effektiviteten af denne protokol betydeligt. For eksempel producerer de tomme vektorer, FoMV-EV og SCMV-EV og FoMV-PDS og FoMV-LES22, som begge indeholder små skær (henholdsvis 313 bp og 329 bp), typisk de højeste procentdele af planter med virale symptomer i disse forsøg (tabel 1 og tabel 2). Rekombinante vira, der bærer større skær af GFP ORF (720 bp) i FoMV-GFP og SCMV-GFP, havde imidlertid meget lavere infektionshastigheder sammenlignet med planter injiceret med de tomme vektor- eller genhæmningskonstruktioner. Denne tendens kan skyldes de negative virkninger på viral fitness forårsaget af stigende mængder eksogent genetisk materiale i det virale genom. Flere undersøgelser har vist, at insertstabiliteten af plantevirale vektorer i høj grad afhænger af insertstørrelse og sekvens36,54,55,56,57. Derudover var der en bemærkelsesværdig forskel i procentdelen af planter, der bliver inficeret efter podning med enten FoMV eller SCMV tom vektor, hvilket tyder på, at der er behov for yderligere arbejde for at optimere denne protokol til SCMV (tabel 1). Disse resultater indikerer, at der kan være behov for en vis fejlfinding, når man udvikler en konstruktion, fordi fragmentets sekvens og længde begge kan påvirke effektiviteten.
Samlet set har denne undersøgelse vist, at agroinjektion af majsplanter er en effektiv podningsmetode til to forskellige RNA-plantevira, flere vektorkonfigurationer og 11 genotyper af majs. Dette arbejde med FoMV og SCMV, parret med tidligere værker, der anvender injektion med majs chlorotic mottle virus (MCMV) eller MSV, indikerer, at agroinjektion er egnet til podning af majsplanter med infektiøse kloner af både RNA- og DNA-vira19,20,21,22. Derudover viser dette arbejde yderligere, at agroinjektion er en levedygtig metode til VIGS- og VOX-vektorer og kan anvendes på planter så unge som fire dage gamle (tabel 3). Den protokol, der præsenteres her, forventes let at blive tilpasset af majsbiologer for at lette forskning i funktionelle genomiske undersøgelser, der involverer forbigående genhæmning (VIGS) og overekspression (VOX). Agroinjektion har også kapacitet til at lette virusbaserede genredigeringsmetoder (VEdGE), der ellers ville være begrænset af afhængighed af plantetransformation, hvilket potentielt forbedrer redigeringseffektiviteten samt tilgængeligheden58,59,60. I betragtning af at den relevante Agrobacterium-stamme, majsgenotyper og virale vektorer er omhyggeligt kombineret, forventes podning ved agroinjektion at blive et værdifuldt redskab til forbigående genfunktionsanalyser i majs.

Infektiøse kloner af mange plantevira er blevet konstrueret til virusinduceret genhæmning (VIGS), genoverekspression (VOX) og senest virusaktiveret genredigering (VEdGE)1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Efterhånden som nye virale konstruktioner udvikles, skal metoder til med succes at inficere plantevæv med disse modificerede vira også overvejes. Nuværende metoder til at lancere virusinfektioner i planter omfatter partikelbombardement, rub-podning af in vitro RNA-transkripter eller DNA-kloner, vaskulær punkteringspodning eller Agrobacterium tumefaciens podning (agroinokulation)5,12,13,14,15,16,17 . Hver af disse podningsmetoder har iboende fordele og ulemper, som omfatter omkostninger, behov for specialudstyr og gennemførlighed inden for et givet plantevirussystem. Metoder, der anvender infiltration eller injektion af Agrobacterium-stammer, der indeholder binære T-DNA-konstruktioner designet til at levere rekombinante vira, foretrækkes, fordi de er enkle og billige. Der mangler imidlertid detaljerede agroinokuleringsmetoder for monocotyledonøse arter som Zea mays (majs).
En af de første rapporter om agroinokulering til viruslevering blev offentliggjort i 1986, da genomet af blomkålmosaikvirus (CaMV) blev indsat i en T-DNA-konstruktion, og den resulterende Agrobacterium, der bærer denne konstruktion, blev rub-podet på majroeplanter18. Yderligere metoder til agroinokulering er siden blevet udviklet. I tilfælde af foxtail mosaikvirus (FoMV) kan Nicotiana benthamiana f.eks. bruges som mellemvært til at generere viruspartikler i blade, der giver en inokulumkilde6. Rub podning af majs ved hjælp af inficerede N. benthamiana blade er effektiv, hurtig og enkel, men brugen af en mellemliggende vært virker ikke for alle majsinficerende vira. Sukkerrørmosaikvirus (SCMV) kan for eksempel ikke inficere N. benthamiana, hvilket kræver anvendelse af alternative inokulumkilder til vektorer afledt af denne virus. I 1988 blev Agrobacterium indeholdende majsstribevirus (MSV), en DNA-virus, indført i majsplanter ved injektion (agroinjektion), hvilket demonstrerede, at Agrobacterium-baserede podningsmetoder også er nyttige til monocots19. På trods af denne tidlige succes med agroinjektion er der kun offentliggjort få undersøgelser, der anvender denne teknik i majs, hvilket efterlader åbne spørgsmål om anvendeligheden af denne metode til RNA-vira og VIGS-, VOX- og VEdGE-vektorer20,21,22. Imidlertid er bred anvendelse af agroinjektion i monocot-arter lovende, fordi denne generelle tilgang er blevet brugt i orkidé, ris og hvede23,24,25,26,27,28.
Denne protokol blev optimeret til FoMV og Agrobacterium stamme GV3101 og er også blevet anvendt på en SCMV-vektor. FoMV er et potexvirus med et bredt værtsområde, der omfatter 56 monocot- og dicotarter29. FoMV har et 6,2 kilobase (kb) positivt sans, enkeltstrenget RNA-genom, der koder for fem forskellige proteiner fra fem åbne læserammer (ORF'er)30,31,32,33,34,35. FoMV blev tidligere udviklet til både en VIGS- og VOX-vektor til majs ved at inkorporere en infektiøs klon på en T-DNA-plasmidrygrad6,36,37. Det virale genom blev modificeret til VIGS-applikationer ved at tilføje et kloningssted (MCS1*) umiddelbart nedstrøms for pelsproteinet (CP) (figur 1A)36. For VOX- og VEdGE-applikationer blev CP-promotoren duplikeret, og et andet kloningssted (MCS2) blev tilføjet for at muliggøre indsættelse af sekvenser af interesse mellem ORF 4 og CP (figur 1B)6. FoMV-vektoren, der indeholder både MCS1 og MCS2 uden skær, er FoMV tom vektor (FoMV-EV) (figur 1).
SCMV er en ikke-relateret virus, der er udviklet til VOX i majs38. Det er medlem af Potyviridae-familien, hvoraf flere medlemmer er blevet konstrueret til at udtrykke fremmede proteiner i planta39,40,41,42,43,44. Værtsområdet for SCMV omfatter majs, sorghum og sukkerrør45,46, hvilket gør det værdifuldt for genfunktionelle undersøgelser i disse store afgrødeplanter36,38. SCMV har et positivt sense, enkeltstrenget RNA-genom på ca. 10 kb i længden47,48. For at skabe SCMV VOX-vektoren blev det veletablerede P1/HCPro-kryds brugt som indsættelsessted for heterologe sekvenser38. Dette kloningssted efterfølges af sekvens, der koder for et NIa-Pro proteasespaltningssted, hvilket fører til produktion af proteiner, der er uafhængige af SCMV-polyproteinet (figur 1C).
T-DNA-plasmider, der bærer infektiøst cDNA af disse rekombinante vira, er blevet omdannet til Agrobacterium-stamme GV3101. GV3101 er en nopalin type stamme, som er velkendt for at kunne overføre T-DNA til monocotyledonous arter, herunder majs26,28,49. Derudover har tidligere agroinjektionsundersøgelser brugt stammerne C58 eller dets derivat GV3101 samt19,20,22,27.
Tre markørgener blev anvendt i udviklingen af denne protokol: to til genhæmning og en til genekspression. Et 329 basepar (bp) fragment fra majsgenlæsionen efterligner 22 (les22, GRMZM2G044074) blev brugt til at konstruere dæmpningsvektoren FoMV-LES22. Når les22 er tavs i majs, vises små, runde pletter af nekrotiske celler langs vaskulaturen af blade, der udvider sig og samler sig i store områder af nekrotisk bladvæv50. FoMV-PDS, der indeholder et 313 bp fragment fra sorghumgenet phytoen desaturase (pds, LOC110436156, 96% sekvensidentitet til majs pds, GRMZM2G410515), inducerer dæmpning af pds i majs, hvilket resulterer i små striber af fotoblegede celler langs vaskulaturen af bladene, der forlænges over tid51. Den intakte kodningssekvens for grønt fluorescerende protein (GFP) blev brugt til at demonstrere proteinekspression for både FoMV (FoMV-GFP) og SCMV (SCMV-GFP). GFP-ekspression i bladene er typisk mest påviselig 14 dage efter podning (DPI)6. Selvom der har været tidligere undersøgelser, der anvender agroinjektion af virale vektorer i majs, har disse eksperimenter kun vist, at agroinjektion kan lette virusinfektion fra en infektiøs klon i majsplanter og ikke udvides til rekombinante vira designet til VIGS- eller VOX-applikationer19,20,21,22. Protokollen, der præsenteres her, bygger på tidligere agroinjektionsmetoder, især Grismley et al.19. Samlet set er denne agroinjektionsmetode kompatibel med VIGS- og VOX-vektorer, kræver ikke specialudstyr eller alternative værter som inokulumkilder og reducerer den samlede tid og de omkostninger, der kræves for at oprette og udføre podninger i forhold til andre almindelige metoder, der kræver bioletik eller in vitro-transkription. Denne protokol vil lette funktionelle genomforskninger i majs med applikationer, der involverer VIGS, VOX og VEdGE.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955450</td>
			<td>alternatively, BD 309659</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Corning Science</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1kb+ Ladder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10787018</td>
			<td>For assessing sizes of PCR products</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G x 5/8&#34; PrecisionGlide Needles</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28&#176;C Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Agrobacterium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For E. coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D134406</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A4800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>E-3120</td>
			<td>For making gels to check for virus/insert stability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrobacterium tumefaciens Strain GV3101</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Carries vir plasmid encoding T-DNA transfer machinery, RifR, GmR, from lab stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bsu36I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K1672</td>
			<td>Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit with Dnase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C298</td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5alpha Competent E. coli Cells</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Ligase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K1422</td>
			<td>Rapid DNA Ligation Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenediamine Tetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Peters Fertilizer 15-15-15 Concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat Inserts</td>
			<td>T.O. Plastics</td>
			<td>715357C</td>
			<td>For germinating seeds in trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flats</td>
			<td>T.O. Plastics</td>
			<td>710245C</td>
			<td>For germinating seeds in trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorCam</td>
			<td>Photon Systems Instruments</td>
			<td></td>
			<td>To assess maize plants for GFP expression before microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Electrophoresis Box</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A38</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-500</td>
			<td>For saving frozen stocks of bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Go-Taq, 2X</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144</td>
			<td>for pHing solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>109827</td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin, Monosulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Pots</td>
			<td>Kordlok</td>
			<td>SQL0550</td>
			<td>5x5x4&#34; or bigger.&#160; For transplanting seedlings.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani (LB) Broth, Miller</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>M1245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maize Golden Bantam Sweet Corn Seed</td>
			<td>American Meadows, West Coast Seeds</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maize Inbred Seed</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Our seed comes from our institution, but we are not able to provide this for other researchers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxima H Minus Reverse Transcriptase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EP0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ</td>
			<td>Elga</td>
			<td></td>
			<td>Purelab Ultra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch PCR &#38; DNA Cleanup Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peters Excel 15-5-15 Fertilizer</td>
			<td>ICL Specialty Fertilizers</td>
			<td>G99140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, 95 mm x 15 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875714G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P171</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Our primers were synthesized through our institutional DNA facility or through IDT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PspOMI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>557303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase A</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12091021</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SbfI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For weighing chemicals for media or buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil Substrate</td>
			<td>SunGro Horticulture</td>
			<td>SS#1-F1P</td>
			<td>Sunshine Mix #1/Fafard-1P, any soil mix that maize grows well in is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For measuring OD600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sybr Safe, 10,000X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S33102</td>
			<td>For making gels to check for virus/insert stability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP154</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>15596018</td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh Paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For weighing chemicals for media or buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XbaI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0145</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct agroinoculation of maize seedlings by injection with recombinant foxtail mosaic virus and sugarcane mosaic virus infectious clones

Agrobacterium-baserede podningsmetoder anvendes i vid udstrækning til at indføre virale vektorer i plantevæv. Denne undersøgelse beskriver en protokol til injektion af majsplanter nær meristematisk væv med Agrobacterium , der bærer en viral vektor. Rekombinante foxtail mosaikvirus (FoMV) kloner konstrueret til genhæmning og genekspression blev brugt til at optimere denne metode, og dens anvendelse blev udvidet til at omfatte en rekombinant sukkerrør mosaikvirus (SCMV) konstrueret til genekspression. Genfragmenter eller kodende sekvenser af interesse indsættes i et modificeret, infektiøst viralt genom, der er blevet klonet i den binære T-DNA-plasmidvektor pCAMBIA1380. De resulterende plasmidkonstruktioner omdannes til Agrobacterium tumefaciens stamme GV3101. Majsplanter så unge som 4 dage gamle kan injiceres nær coleoptilar knuden med bakterier resuspended i MgSO4 opløsning. Under infektion med Agrobacterium overføres T-DNA'et, der bærer det virale genom, til majsceller, hvilket muliggør transkription af det virale RNA-genom. Da den rekombinante virus replikerer og systematisk spredes gennem hele planten, kan virale symptomer og fænotypiske ændringer som følge af hæmning af målgenernes læsion efterligne 22 (les22) eller phytoendesaturase (pds) observeres på bladene, eller ekspression af grønt fluorescerende protein (GFP) kan detekteres ved belysning med UV-lys eller fluorescensmikroskopi. For at detektere viruset og vurdere insertets integritet samtidigt ekstraheres RNA fra bladene på den injicerede plante, og RT-PCR udføres ved hjælp af primere, der flankerer det multiple kloningssted (MCS), der bærer den indsatte sekvens. Denne protokol er blevet anvendt effektivt i flere majsgenotyper og kan let udvides til andre virale vektorer og tilbyder derved et tilgængeligt værktøj til introduktion af viral vektor i majs.

Watch this Scientific Journal Video about Direct Agroinoculation of Maize Seedlings by Injection with Recombinant Foxtail Mosaic Virus and Sugarcane Mosaic Virus Infectious Clones at JoVE.com

Direct Agroinoculation of Maize Seedlings by Injection with Recombinant Foxtail Mosaic Virus and Sugarcane Mosaic Virus Infectious Clones

En Agrobacterium-baseret injektion (agroinjection) protokol præsenteres til podning af foxtail mosaikvirus og sukkerrør mosaik viruscloner i majsplanter. Podning på denne måde fører til virusinfektion, virusinduceret genhæmning af markørgener og viral overekspression af GFP.

Direkte agroinokulering af majsplanter ved injektion med rekombinant foxtail mosaikvirus og sukkerrør mosaikvirus infektiøse kloner

Agrobacterium-based inoculation approaches are widely used for introducing viral vectors into plant tissues. This study details a protocol for the ...

Denne protokol tillader podning af virale vektorer direkte i majsplanter, der let kan anvendes i de fleste laboratorieindstillinger uden behov for dyrt specialudstyr. Direkte podning eliminerer brugen af en alternativ vært som en podningskilde, hvilket sparer både tid og ressourcer. Denne metode kan anvendes på yderligere virale vektorer, majslinjer og potentielt andre monocotarter.Begynd med at plante 1 til 2 majsfrø i det tørvbaserede vækstmedium i små indsatser placeret inde i bakker. Placer bakkerne i et vækstkammer under 16 timers dage ved 25 grader Celsius og 8 timers nætter ved 22 til 25 grader Celsius eller i et drivhus ved 22 til 25 grader Celsius med 16 timers dage og 8 timers nætter. Vand regelmæssigt planter og gød en gang om ugen med 15-5-15 flydende gødning ved 330 dele pr. Million koncentration.Forbered agrobacterium til injektion ved at inokulere agrobacterium stammen indeholdende den ønskede virale konstruktion i LB medier med antibiotika. Derefter inkuberes kolben eller rørene ved 28 grader Celsius, mens den rystes ved 225 o / min i 24 timer. Den næste dag pelleteres bakterierne ved centrificering ved 4.000 gange G i 10 minutter ved stuetemperatur og kasseres supernatanten.Vask derefter pelleten med en milliliter deioniseret vand. Suspender pelleten igen i en milliliter 10 millimolær magnesiumsulfatopløsning, og mål den optiske densitet ved 600 nanometer. Juster det derefter til 1.0.Brug 4 til 7 dage gamle majsplanter til injektion af agrobacterium. Saml sprøjten og nålen. Injicer forsigtigt bakteriesuspensionen 2-3 millimeter over den koleoptilulære knude, indtil den fylder coleoptilen eller er synlig i hvirvlen, afventende på plantens vækststadium.Injicer alle kimplanter og skift sprøjte og nåle til injektion af hver konstruktion. Bekræft fænotypisk infektion ved at observere læsioner fra hæmning af kontrolgenerne, læsion efterligner 22 eller phytoendesaturase på bladene. Brug en fluorescensbilleddannelsesenhed til hurtig screening af planter og fluorescensmikroskopi for at detektere tilstedeværelsen af GFP-ekspression.Udfør genekspressionsanalyse til molekylær påvisning af infektion. Uddrag total RNA fra blade af inficerede planter 14 til 21 dage efter infektion og syntetiseret første streng cDNA som beskrevet i tekstmanuskriptet. Udfør omvendt transkriptase PCR for at bekræfte infektion og bestemme genets integritet eller genfragment af interesse ved hjælp af specifikke primere designet til forskellige virale konstruktioner.Visualiser PCR-produktet på en 1% agarosegel indeholdende en nukleinsyreplet for at bestemme tilstedeværelsen eller fraværet af virus og gen eller genfragment. Denne protokol blev brugt til at indsætte rekombinante vira konstrueret til gen i majsplanter. Ca. 12 dage efter injektionen blev der observeret dæmpningsfænotyper på blade som nekrose og fotoblevaskning.Tilstedeværelsen af konstruktion i blade efter infektion blev påvist ved at observere grøn fluorescerende proteinekspression under en fluorescens ved hjælp af et andet GFP-filter. Grønt fluorescerende proteinudtryk i foxtail mosaikvirus inficerede blade blev visualiseret som små punkterede områder af fluorescens fordelt over bladene og som store pletter i sukkerrør mosaikvirus inficerede blade. Ved hjælp af genekspressionsanalysen blev systemisk foxtail mosaikvirusinfektion bekræftet, og genhæmning eller undertrykkelse af phytoendesaturase og læsionsefterligning 22 blev observeret.Konstruktionen anvendte også påvirket infektionseffektivitet. I tilfælde af foxtail mosaikvirusinfektion, foxtail mosaikvirus tom vektor og foxtail mosaikvirus læsion efterligne 22 havde typisk de højeste infektionseffektiviteter på henholdsvis 53% og 54%. Foxtail mosaikvirus phytoen desaturase ved en lidt lavere effektivitet på 39% og foxtail mosaikvirus grønt fluorescerende protein, ved den laveste effektivitet på 16%I mellemtiden var infektionseffektiviteten af sukkerrørmosaikvirus grønt fluorescerende protein 8%Timing og symptomer vil være baseret på den anvendte virale vektor og majslinje.Mangel på en visuel fænotype betyder muligvis ikke mangel på hæmning eller udtryk. Denne metode kan også anvendes på genredigeringsteknologier ved at forbedre leveringsmetoder til vejledning af RNA'er.

Research

JoVE Journal

Biology

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences

The completion of the human genome sequence, along with that of many other species, has highlighted the challenge of ascribing specific function to non ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

Kemisk blokeret antistof Microarray for Multiplexed Højkapacitetsforskning Profilering af specifikke protein Glycosylering i komplekse prøver

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Den MultiBac Protein Complex Production Platform på EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

Tomat / GFP-FLP / FRT Metode til Live Imaging af Mosaic Voksen<em&gt; Drosophila</em&gt; fotoreceptorceller

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination

Ekspression og oprensning af viruslignende partikler til vaccination

Virus-like particles (VLPs) and subviral particles (SVPs) are an alternative approach to viral vaccine design that offers the advantages of increased ...