Name: direct agroinoculation of maize seedlings by injection with recombinant foxtail mosaic virus and sugarcane mosaic virus infectious clones
Uploaded: 2021-02-27T14:30:00
Duration: 5 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Agroinoculation of Maize Seedlings by Injection with Recombinant Foxtail Mosaic Virus and Sugarcane Mosaic Virus Infectious Clones at JoVE.com

Iowa State University maakt deel uit van een team dat DARPA's Insect Allies-programma HR0011-17-2-0053 ondersteunt. Dit werk werd ook ondersteund door het Iowa State University Plant Sciences Institute, Iowa State University Crop Bioengineering Center, USDA NIFA Hatch projectnummer 3808 en State of Iowa Funds. K.L.H. werd ook gedeeltelijk ondersteund door het Iowa State University Predictive Plant Phenomics graduate trainingsprogramma gefinancierd door de National Science Foundation (DGE # 1545453) en door Agricultural and Food Research Initiative grant no. 2019-07318 van het USDA National Institute of Food and Agriculture. De financiers hadden geen rol in het ontwerp van de studie en verzameling, analyse en interpretatie van gegevens en in het schrijven van het manuscript. Alle meningen, bevindingen en conclusies of aanbevelingen die in dit materiaal worden uitgedrukt, zijn die van de auteurs en weerspiegelen niet noodzakelijkerwijs de opvattingen van de financiers.
We bedanken Nick Lauter (USDA-ARS, Ames, IA) voor het zaaien van maïsinteeltlijnen, Christian F. Montes-Serey (Iowa State University) voor het maken van de FoMV-GFP-kloon en Tyler Austin (Iowa State University) voor technische assistentie.

1. Plasmide constructie
OPMERKING: Dit protocol kan worden toegepast op andere virale vectoren of Agrobacterium-stammen , maar dit kan het algehele succes van inenting door agro-injectie beïnvloeden. Voer altijd bacteriële inentings- en platingstappen uit in een laminaire stroomkap.
<ol><li>FoMV geluidsdemping construct OPMERKING: Luria-Bertani (LB) media (Miller) wordt gebruikt voor alle media, tenzij anders aangegeven. Vloeibare LB wordt gemaakt door 25 g korrels in 1.000 ml gedestilleerd water te suspenseren en gedurende 15 minuten bij 121 °C te autoclaveren. Solid LB-media worden op dezelfde manier gemaakt met de toevoeging van 1,5% agar vóór het autoclaveren. Antibiotica worden toegevoegd nadat LB is afgekoeld tot ~ 60 ° C en de oplossing wordt in petriplaten van 95 x 15 mm gegoten. De te gebruiken antibioticaconcentraties zijn als volgt: rifampicine (rif) bij 25 μg/ml, gentamycine (gent) bij 50 μg/ml en kanamycine (kan) bij 50 μg/ml.<ol><li>PCR versterkt fragmenten van het maïsgen die moeten worden gedempt (bijvoorbeeld les22 of pds) met behulp van een voorwaartse primer met een PacI-restrictieplaats en een omgekeerde primer met een XbaI-restrictieplaats. Dit zal ligatie van de genfragmenten in de MCS1* van de FoMV-pCAMBIA1380 binaire vector in de antisense oriëntatie mogelijk maken. OPMERKING: Stel de PCR in met behulp van een high-fidelity DNA-polymerase, voorwaartse en omgekeerde primers op 10 μM elk, plasmide DNA-sjabloon en water, volgens de DNA-polymerasespecificaties. Amplificeer gedurende 35 cycli, met behulp van een gloeitemperatuur volgens de DNA polymerase en primer smelttemperatuur (Tm), en een 30 s extensie per kilobase die moet worden versterkt.</li>
		<li>Voer PCR-zuivering uit met behulp van een PCR-zuiveringskit volgens de specificaties van de kit.</li>
		<li>Verteer het gezuiverde PCR-product en de FoMV-EV met de restrictie-enzymen XbaI en PacI. Gebruik 1 μg plasmide of het hele gezuiverde PCR-product, 2 μL 10x buffer, 1 μL restrictie-enzym en voeg water toe om een eindreactievolume van 20 μL te maken. Incubeer volgens enzymspecificatie.</li>
		<li>Ligate het verteerde PCR-product en FoMV-EV samen met T4 DNA-ligase volgens het protocol van de fabrikant.</li>
		<li>Transformeer het geligeerde plasmide in DH5α chemisch competente E. coli-cellen met behulp van de heat shock-methode.<ol>
<li>Ontdooi cellen op ijs en voeg 3 μL plasmide toe aan de buis. Incubeer op ijs gedurende 30 minuten en vervolgens een hitteschok gedurende 30 s bij 42 °C.</li>
			<li>Leg 5 minuten op ijs, voeg 200 μL superoptimale bouillon met katabole onderdrukking (SOC) toe en laat E. coli-cellen gedurende 1 uur bij 37 °C herstellen in SOC-media met schudden bij 225 tpm.</li>
			<li>Plaat op kanamycine selectieve LB media en incubeer bij 37 °C 's nachts.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Controleer kolonies op nauwkeurige klonen door Sanger-sequencing met behulp van de primers FM-5840F en FM-6138R (aanvullende tabel 1). Dien 250 ng plasmide-DNA in bij een faciliteit die Sanger-sequencing zal uitvoeren. Voor dit experiment werden monsters verzonden naar Iowa State University DNA Core Facility.</li>
		<li>Ent 2 ml vloeibare LB met de gekozen kolonie en incubeer bij 37 °C 's nachts met schudden bij 225 tpm. Extract plasmide DNA uit de nachtkweek door middel van een alkalische lysis plasmide DNA-preparaat52.</li>
		<li>Transformeer plasmide-DNA in Agrobacterium stam GV3101-cellen met behulp van de vries-dooimethode. Laat 100 μL chemisch competente cellen ontdooien op ijs, voeg 1-5 μL plasmide toe en incubeer gedurende 30 minuten op ijs. Breng gedurende 1 min vloeibare stikstof aan en incubeer vervolgens bij 37 °C gedurende 3 min. Voeg 1 ml SOC toe, laat 2-3 uur bij 28 °C herstellen met schudden, plaat op rif, gent en kan selectieve LB-media en incubeer bij 28 °C gedurende 2 dagen.</li>
		<li>Scherm kolonies op de aanwezigheid van insert met kolonie PCR. Kies een enkele bacteriekolonie en meng deze in 30 μL water. Stel een PCR-reactie in door toevoeging van 12,5 μL polymerasemastermix, 1,25 μL van elke 10 μM primer, FM-5840F en FM-6138R, 3 μL van de bacteriële koloniesuspensie en water tot een eindvolume van 25 μL. Cyclus 35 keer met een gloeitemperatuur van 64 °C en een verlengingstijd van 1 min (1 min voor elke kb versterkt).</li>
		<li>Ent 2-5 ml vloeibare LB (rif, gent, kan) met de juiste Agrobacterium-kolonie . Laat het een nacht groeien bij 28 °C met schudden bij 225 rpm.</li>
		<li>Meng de nachtcultuur met een 50% glyceroloplossing 1:1. Bewaren bij -80 °C voor langdurige opslag.</li>
	</ol></li>
	<li>FoMV expressie construct<ol>
<li>PCR versterkt de coderingsvolgorde van belang, inclusief start- en stopcodons (bijv. GFP) zoals beschreven in 1.1.1, door een Bsu36I-restrictiesite toe te voegen op de voorwaartse primer en een PspOMI-restrictiesite op de omgekeerde primer om directioneel klonen in de zinsoriëntatie in MCS2 mogelijk te maken.</li>
		<li>Voer PCR-zuivering uit met behulp van een PCR-zuiveringskit volgens de specificaties van de kit.</li>
		<li>Verteer het PCR-product en de FoMV-EV met de restrictie-enzymen Bsu36I en PspOMI, zoals beschreven in 1.1.3.</li>
		<li>Ligate het verteerde PCR-product en FoMV-EV samen met T4 DNA-ligase volgens het protocol van de fabrikant.</li>
		<li>Transformeer in DH5α chemisch competente E. coli-cellen met behulp van de hitteschokmethode zoals beschreven in 1.1.5. Plaat op kanamycine selectieve LB media en incubeer bij 37 °C 's nachts.</li>
		<li>Controleer kolonies op nauwkeurige klonen door Sanger-sequencing zoals beschreven in 1.1.6 met behulp van de primers 5AmuS2 en 5AmuA2 (aanvullende tabel 1).</li>
		<li>Ent 2 ml vloeibare LB met de gekozen kolonie en incubeer bij 37 °C 's nachts met schudden bij 225 RPM. Extract plasmide DNA uit de nachtkweek door middel van een alkalische lysis plasmide DNA-preparaat52.</li>
		<li>Transformeer plasmide-DNA in Agrobacterium stam GV3101 chemisch competente cellen met behulp van de vries-dooimethode zoals beschreven in 1.1.8. Plaat op rif, gent en kan selectieve LB media en incubeer bij 28 °C gedurende 2 dagen.</li>
		<li>Scherm kolonies op de aanwezigheid van insert met kolonie PCR met behulp van de primers 5AmuS2 en 5AmuA2.</li>
		<li>Ent 2-5 ml vloeibare LB (rif, gent, kan) met de juiste Agrobacterium kolonie. Schud 's nachts bij 225 rpm bij 28 °C.</li>
		<li>Meng de nachtcultuur met een 50% glyceroloplossing 1:1. Bewaren bij -80 °C voor langdurige opslag.</li>
	</ol></li>
	<li>SCMV-expressieconstruct<ol>
<li>PCR versterkt het gen van belang (bijv. GFP) met uitzondering van het stopcodon zoals beschreven in 1.1.1, inclusief een PspOMI-verteringsplaats op de voorwaartse primer en een SbfI-verteringsplaats op de omgekeerde primer om directioneel klonen in de SCMV-pCAMBIA1380 binaire vector mogelijk te maken. OPMERKING: Insert moet worden gekloond in frame met het virale polyproteïne.</li>
		<li>Voer PCR-zuivering uit met behulp van een PCR-zuiveringskit volgens de specificaties van de kit.</li>
		<li>Verteer het PCR-product en de SCMV-EV met de restrictie-enzymen PspOMI en SbfI, zoals beschreven in 1.1.3.</li>
		<li>Ligate het verteerde PCR-product en SCMV-EV samen met T4 DNA-ligase volgens het protocol van de fabrikant.</li>
		<li>Transformeer het product in DH5α chemisch competente E. coli-cellen met behulp van de hitteschokmethode zoals beschreven in 1.1.5. Plaat op kan selectieve LB media en incubeer bij 37 °C gedurende de nacht.</li>
		<li>Scherm kolonies voor nauwkeurige klonen door Sanger sequencing zoals beschreven in 1.1.6 met behulp van de primers SC-745F en HCProR1 (aanvullende tabel 1).</li>
		<li>Ent 2 ml vloeibare LB met de gekozen kolonie en incubeer bij 37 °C 's nachts met schudden bij 225 tpm. Extraheer het plasmide-DNA uit de nachtkweek door middel van een alkalisch lysisplasmide DNA-preparaat52.</li>
		<li>Transformeer het plasmide-DNA in Agrobacterium stam GV3101 chemisch competente cellen met behulp van de vries-dooimethode zoals beschreven in 1.1.8. Plaat op rif, gent en kan selectieve LB media en incubeer bij 28 °C gedurende 2 dagen.</li>
		<li>Scherm kolonies op aanwezigheid van insert met kolonie PCR met de primers SC-745F en HCProR1 zoals beschreven in 1.1.9.</li>
		<li>Ent 2-5 ml vloeibare LB (rif, gent, kan) met de juiste Agrobacterium-kolonie . Schud 's nachts bij 225 rpm bij 28 °C.</li>
		<li>Meng de nachtcultuur met een 50% glyceroloplossing 1:1. Bewaren bij -80 °C voor langdurige opslag.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Zaailing voorbereiding
<ol><li>Plant 1-2 maïszaden ('Golden Bantam' suikermaïs, FR1064, B73, enz.) in een op turf gebaseerd groeimedium in kleine inserts die 4-7 dagen voor injectie in trays worden geplaatst. Plaats in een groeikamer onder 16 uur dagen bij 25 °C en 8 uur 's nachts bij 22 °C (~185 fotosynthetisch actieve straling (PAR)) of in een kas onder 16 uur dagen bij 22-25 °C en 8 uur 's nachts bij 22-25 °C (350-400 PAR). OPMERKING: De gevoeligheid voor Agrobacterium varieert tussen maïsgenotypes, wat van invloed is op de slagingspercentages. Bovendien kunnen sommige virale vectoren onverenigbaar zijn met bepaalde maïsgenotypes.</li>
	<li>Geef regelmatig water en bemest eenmaal per week met 15-5-15 vloeibare meststof bij 330 delen per miljoen (PPM).</li>
</ol>3. Bereiding van Agrobacterium
<ol><li>Bereid een dag voor de injectie LB vloeibare media met het juiste antibioticum (rif, gent, kan) en en ent met de Agrobacterium-stam die de gewenste virale constructie draagt. Het wordt aanbevolen om 20 μL glycerolbouillon toe te voegen aan 50 ml LB, wat voldoende bacteriecultuur zou moeten opleveren om >100 planten te enten en naar behoefte kan worden opgeschaald of verlaagd. OPMERKING: Bereid voldoende entmateriaal voor op een uiteindelijke hoeveelheid bacteriële suspensie van ten minste 1 ml bij een optische dichtheid van 600 nm (OD600) van 1,0 voor elke 4-5 planten.</li>
	<li>Schud bij 225 tpm bij 28 °C gedurende 24 uur.</li>
	<li>Pelletbacteriën gedurende 10 min bij 4.000 x g bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg.</li>
	<li>Was de pellet grondig met 1 ml gedeïoniseerd (DI) water door pipetteren of zacht vortexen.</li>
	<li>Herhaal stap 3.3 om bacteriën te pelleteren.</li>
	<li>Resuspend de pellet in 1 ml 10 mM MgSO4-oplossing door pipetteren of zacht vortexen.<ol>
<li>Voeg eventueel 200 μM acetosyringon toe aan de oplossing. Hoewel vaak gebruikt, verbetert acetosyringon alleen het transformatievermogen van sommige Agrobacterium-stammen . De auteurs hebben niet gevonden dat de toevoeging van acetosyringon de efficiëntie in dit protocol beïnvloedt (aanvullende tabel 2). OPMERKING: 10 mM MgSO4-oplossing kan worden gemaakt van een 1 M-stamoplossing met een pH van 6,3, bewaard bij kamertemperatuur. Oplossing vereist waarschijnlijk geen pH-aanpassing.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Meet OD600 van het monster met een spectrofotometer en verdun tot 1,0 OD600 met 10 mM MgSO4-oplossing . OPMERKING: Dit is een veilige stopplaats. Bacteriële suspensie kan tot 5 uur vóór injectie bij kamertemperatuur worden gehouden.</li>
</ol>4. Injectie
OPMERKING: Maïszaailingen van 4-7 dagen oud kunnen worden gebruikt voor injectie. De groeisnelheid van zaailingen wordt sterk beïnvloed door groeiomstandigheden, hoeveelheid PAR (d.w.z. hogere PAR in kas dan in groeikamer) en genotype, onder andere dat moeilijk te beheersen kan zijn in kasomstandigheden. Planten kunnen worden geïnjecteerd zo jong als 4 dagen oud wanneer ze 2-3 cm hoog zijn zonder uitgevouwen bladeren en zo oud als 7 dagen wanneer het onderste afgeronde puntblad wordt uitgebreid. Het succespercentage van deze inentingsmethoden daalt snel naarmate planten ouder worden dan 7 dagen na het zaaien. De injectieplaats is hetzelfde, ongeacht de leeftijd van de zaailingen.
<ol><li>Draag een veiligheidsbril en injecteer de bacteriële suspensie in de zaailingen 2-3 mm boven de coleoptilar node met behulp van een 25G x 5/8 "naald bevestigd aan een 1 ml wegwerpspuit. OPMERKING: De coleoptilar node is waar kroonwortels zich uiteindelijk zullen vormen. Dit is het laagste knooppunt op de plant. Meestal zal er een kleurverandering zijn van groen naar wit op en onder het knooppunt. De injectieplaats ligt net boven het meristeem. Het ontleden van een paar zaailingen in dit stadium kan helpen bij het visualiseren van de locatie van het meristeem en bijgevolg de juiste injectieplaats.</li>
	<li>Oefen zachte druk uit op de spuit totdat de suspensie de coleoptile vult of zichtbaar is in de krans, afhankelijk van het groeistadium van de planten. Dit is ongeveer 100-200 μL suspensie. OPMERKING: Als het moeilijk is om de suspensie in de zaailing te injecteren, kan de injectieplaats te laag zijn. Matige druk is alles wat nodig zou moeten zijn om de suspensie te injecteren.</li>
	<li>Injecteer alle zaailingen en vervang spuiten en naalden voor elk construct.</li>
</ol>5. Continue plantenverzorging
<ol><li>Verplant de geïnjecteerde zaailingen naar 13 x 13 x 15 cm of grotere potten wanneer ze 7-8 dagen oud zijn.</li>
	<li>Zorg voor groeiomstandigheden (16 uur fotoperiode en één keer per week bemesten).</li>
</ol>6. Bevestiging van infectie (Fenotypisch en RT-PCR)
<ol><li>Fenotypisch scoren planten tussen 14-21 DPI. Laesies van het uitschakelen van de controlegenen laesie bootsen 22 of fytoeen desaturase na op de bladeren en zijn te onderscheiden van FoMV-symptomen. GFP-expressie kan worden gedetecteerd via fluorescerende microscoopbeeldvorming of andere UV-lichtbeeldvorming. OPMERKING: Sommige constructen/virale vectoren kunnen langer duren om symptomen te vertonen of kunnen helemaal geen symptomen vertonen. Hoge lichtomstandigheden verhogen de fenotypen die worden veroorzaakt door het uitschakelen van laesies die 22 en fytoeendesaturase nabootsen. Laesies kunnen minder zichtbaar of afwezig zijn als planten in omstandigheden met minder licht worden gehouden, zoals een groeikamer, maar de werkelijke infectiegraad zoals bepaald door RT-PCR mag niet worden beïnvloed (tabel 1).</li>
	<li>Om de infectie moleculair te bevestigen, monster blad 6 tussen 14-21 DPI en extraheer totaal RNA met behulp van een fenol-chloroform extractie volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Het geëxtraheerde RNA gebruiken als sjabloon om eerste-streng cDNA te genereren.<ol>
<li>Stel de cDNA-reactie in met maximaal 5 μg totaal RNA, 1 μL willekeurige hexameerprimers, 1 μL oligo (dT)18 primers, 1 μL dNTPs, 1 μL reverse transcriptase en water voor een eindvolume van 14,5 μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gebruik primers die zijn ontworpen voor het virale construct en het cDNA als sjabloon, voer PCR uit op elk monster om virale infectie te bevestigen en de integriteit van het gen of genfragment van belang te bepalen zoals beschreven in 1.1.1, behalve cycli te verminderen tot 25 voor FoMV en 30 voor SCMV om valse positieven te voorkomen.<ol>
<li>Gebruik voor FoMV-dempingsconstructies primers FM-5840F en FM-6138R om te versterken over de MCS1*, die het maïsgenfragment bevat. Gebruik voor FoMV-expressieconstructies primers 5AmuS2 en 5AmuA2 om te versterken over de MCS2, die het ingebrachte gen bevat.</li>
		<li>Gebruik voor SCMV-expressieconstructies primers SC745-F en HCProR1 om te versterken over het MCS, dat het ingebrachte gen bevat (aanvullende figuur 3).</li>
		<li>Gebruik voor een endogeen controlegen primers ZmActS en ZmActA, die een mRNA-fragment van maïsactine (GRMZM2G126010) of primers ZmUbiF en ZmUbiR versterken, die een mRNA-fragment van maïspolyubiquitine (GRMZM2G409726_T01) versterken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Visualiseer het PCR-product op een 1% agarosegel met een nucleïnezuurkleuring om de aan- of afwezigheid van virus en gen- of genfragment te bepalen.</li>
</ol>

De onderzoekers hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Agrobacterium is een essentieel hulpmiddel dat tal van moleculair biologische technieken in plantgerelateerd onderzoek faciliteert. Deze studie biedt een agro-injectieprotocol voor het inenten van FoMV- en SCMV-virale vectoren rechtstreeks in maïsweefsels voor VIGS- en VOX-toepassingen. Het belangrijkste doel is om het gemak en het nut van virusgebaseerde technologieën voor onderzoek in monocot gewasplanten te vergroten. Hoewel directe agroinoculatie van maïs is gemeld voor een paar virussen, zijn de auteurs niet op de hoogte van een gedetailleerd protocol en zijn er geen voorbeelden van VIGS- en VOX-toepassingen in die studies19,22.
Er is gemeld, en werd bevestigd tijdens de ontwikkeling van dit protocol, dat de injectielocatie een belangrijke factor is voor het succesvol lanceren van een systemische virale infectie via agro-injectie19. Het consequent injecteren van de aanbevolen locatie op de plant wordt verondersteld de grootste variabele te zijn, omdat de exacte positie van het meristeem in maïszaailingen vrijwel niet met het oog kan worden gedetecteerd. Om interpersoonlijke variatie te minimaliseren, wordt aanbevolen om een paar maïszaailingen tot aan het meristeem te ontleden om de locatie beter te visualiseren (figuur 3C). De positie van het meristeem ten opzichte van de coleoptilar-knoop zou ongeveer hetzelfde moeten zijn voor planten van 4-7 dagen oud. Bovendien biedt het oefenen van injectie met een geverfde vloeistof een gemakkelijk zichtbare demonstratie van hoe het "entmateriaal" de bladkrans vult, en omdat de injectieplaats is gemarkeerd met kleurstof, kan de nauwkeurigheid van de injectieplaats worden bevestigd (figuur 3G, H). Meristematische weefsels zijn het meest vatbaar voor agro-injectie, maar het injecteren van Agrobacterium-suspensies rechtstreeks in dit weefsel resulteert in ongewenste morfologische effecten (figuur 6)19. Planten met beschadigde meristeem overleven, maar de resulterende defecten zijn ongewenst en daarom moet directe injectie van dit weefsel worden vermeden.
Er zijn verschillende variabelen die van invloed kunnen zijn op de succesvolle lancering van een systemische virale infectie via agro-injectie, omdat drie complexe biologische systemen (plant, virus en Agrobacterium-stam) in coördinatie moeten interageren. Dit complexe samenspel kan worden geholpen door de snel delende cellen van het meristematische gebied, waardoor het een ideale locatie is voor agroinoculatie19. De Agrobacterium-stam moet cellen van de plantenweefsels kunnen infecteren om het T-DNA met het virale genoom af te leveren en de plant moet vatbaar zijn voor het virus om virale replicatie en systemische infectie te initiëren. Maïsgenotypes verschillen in hun gevoeligheid voor virussen (Mo17 is bijvoorbeeld resistent tegen FoMV) of Agrobacterium-stammen, maar de meerderheid die werd getest, lijkt vatbaar te zijn voor zowel FoMV als SCMV (tabel 1 en tabel 2)53. Zo kunnen de inteeltlijn FR1064 en de suikermaïsvariëteit Golden Bantam bijzonder gevoelig zijn voor zowel GV3101 Agrobacterium als FoMV-gebaseerde vectoren.
Het bemonsterde bladnummer en de timing van de bemonstering voor RT-PCR is van cruciaal belang voor een nauwkeurige beoordeling van de virale infectie. In de hier getoonde voorbeelden werd het bladgetal bepaald door te beginnen bij het eerste afgeronde blad (algemeen bekend als het "duimblad") en naar boven te tellen. Bladeren werden bemonsterd zodra ze waren uitgebreid en het volgende blad was begonnen te verschijnen. Welke bladeren optimaal zijn voor bemonstering kan echter variëren op basis van de gebruikte virussoort, groeiomstandigheden en maïsgenotype. Daarom wordt een eerste tijdskuurexperiment aanbevolen bij het toepassen van dit protocol op een nieuw virussysteem om de bemonsteringsstrategie met betrekking tot bladeren en timing te optimaliseren.
De specifieke constructie die wordt gebruikt, heeft een aanzienlijke invloed op de efficiëntie van dit protocol. Bijvoorbeeld, de lege vectoren, FoMV-EV en SCMV-EV, en FoMV-PDS en FoMV-LES22, die beide kleine inserts bevatten (respectievelijk 313 bp en 329 bp), produceren meestal de hoogste percentages planten met virale symptomen in deze experimenten (tabellen 1 en tabel 2). Recombinante virussen met grotere inserts van de GFP ORF (720 bp) in FoMV-GFP en SCMV-GFP hadden echter veel lagere infectiepercentages in vergelijking met planten die werden geïnjecteerd met de lege vector- of gen-uitschakelingsconstructies. Deze trend kan te wijten zijn aan de negatieve effecten op de virale fitheid veroorzaakt door toenemende hoeveelheden exogene genetisch materiaal in het virale genoom. Verschillende studies hebben aangetoond dat de insertstabiliteit van plant virale vectoren grotendeels afhankelijk is van insertgrootte en sequentie36,54,55,56,57. Bovendien was er een opmerkelijk verschil in percentage planten dat geïnfecteerd raakte na inenting met de FoMV- of SCMV-lege vector, wat suggereert dat er extra werk nodig is om dit protocol voor SCMV te optimaliseren (tabel 1). Deze resultaten geven aan dat enige probleemoplossing nodig kan zijn bij het ontwikkelen van een constructie, omdat de volgorde en lengte van het fragment beide de efficiëntie kunnen beïnvloeden.
Over het algemeen heeft deze studie aangetoond dat agro-injectie van maïszaailingen een effectieve inentingsmethode is voor twee verschillende RNA-plantenvirussen, meerdere vectorconfiguraties en 11 genotypen van maïs. Dit werk met FoMV en SCMV, in combinatie met eerdere werken met behulp van injectie met maïschlorotic mottle virus (MCMV) of MSV, geeft aan dat agro-injectie geschikt is voor het inenten van maïszaailingen met infectieuze klonen van zowel RNA- als DNA-virussen19,20,21,22. Bovendien toont dit werk verder aan dat agro-injectie een haalbare methode is voor VIGS- en VOX-vectoren en kan worden toegepast op planten zo jong als vier dagen oud (tabel 3). Het hier gepresenteerde protocol zal naar verwachting gemakkelijk worden aangepast door maïsbiologen om onderzoek in functionele genomicastudies met transient gene silencing (VIGS) en overexpressie (VOX) te vergemakkelijken. Agroinjectie heeft ook de capaciteit om virusgebaseerde genbewerkingsbenaderingen (VEdGE) te vergemakkelijken die anders zouden worden beperkt door afhankelijkheid van planttransformatie, waardoor de bewerkingsefficiëntie en toegankelijkheid mogelijk worden verbeterd58,59,60. Aangezien de juiste Agrobacterium-stam, maïsgenotypes en virale vectoren zorgvuldig worden gecombineerd, wordt verwacht dat inenting door agro-injectie een waardevol hulpmiddel zal worden voor voorbijgaande genfunctieanalyses in maïs.

Infectieuze klonen van veel plantenvirussen zijn ontworpen voor virus-geïnduceerde gen-uitschakeling (VIGS), genoverexpressie (VOX) en meest recent, virus-enabled gene editing (VEdGE)1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Naarmate nieuwe virale constructies worden ontwikkeld, moeten ook methoden worden overwogen om plantenweefsels met deze gemodificeerde virussen met succes te infecteren. Huidige methoden om virusinfecties in planten te lanceren omvatten deeltjesbombardement, rub-inenting van in vitro RNA-transcripten of DNA-klonen, vasculaire punctie-inenting of Agrobacterium tumefaciens-inenting (agroinoculatie)5,12,13,14,15,16,17 . Elk van deze inentingsmethoden heeft inherente voor- en nadelen, waaronder kosten, behoefte aan gespecialiseerde apparatuur en haalbaarheid binnen een bepaald plant-virussysteem. Methoden die gebruik maken van infiltratie of injectie van Agrobacterium-stammen die binaire T-DNA-constructies bevatten die zijn ontworpen om recombinante virussen af te leveren, hebben de voorkeur, omdat ze eenvoudig en goedkoop zijn. Gedetailleerde agroinoculatiemethoden voor eenzaadlobbige soorten zoals Zea mays (maïs) ontbreken echter.
Een van de eerste rapporten over agroinoculatie voor virusafgifte werd gepubliceerd in 1986, toen het genoom van bloemkoolmozaïekvirus (CaMV) werd ingebracht in een T-DNA-constructie en de resulterende Agrobacterium die dit construct droeg, werd ingewreven op raapplanten18. Aanvullende methoden voor agroinoculatie zijn sindsdien ontwikkeld. In het geval van vossenstaartmozaïekvirus (FoMV) kan Nicotiana benthamiana bijvoorbeeld worden gebruikt als tussengastheer om virusdeeltjes in bladeren te genereren die een entbron vormen6. Wrijfinenting van maïs met behulp van geïnfecteerde N. benthamiana-bladeren is efficiënt, snel en eenvoudig, maar het gebruik van een tussengastheer werkt niet voor alle maïs-infecterende virussen. Suikerrietmozaïekvirus (SCMV) kan bijvoorbeeld N. benthamiana niet infecteren, waardoor het gebruik van alternatieve entbronnen voor vectoren die van dit virus zijn afgeleid, vereist is. In 1988 werd Agrobacterium containing maize streak virus (MSV), een DNA-virus, via injectie (agro-injectie) in maïszaailingen geïntroduceerd, wat aantoont dat agrobacterium-gebaseerde inentingsmethoden ook nuttig zijn voor monocots19. Ondanks dit vroege succes met agro-injectie, zijn er weinig studies gepubliceerd die deze techniek in maïs gebruiken, waardoor er open vragen zijn over de toepasbaarheid van deze methode voor RNA-virussen en VIGS-, VOX- en VEdGE-vectoren20,21,22. Een breed gebruik van agro-injectie bij eenzaadlobbige soorten is echter veelbelovend, omdat deze algemene aanpak is gebruikt in orchideeën, rijst en tarwe23,24,25,26,27,28.
Dit protocol is geoptimaliseerd voor FoMV en Agrobacterium stam GV3101 en is ook toegepast op een SCMV vector. FoMV is een potexvirus met een breed gastheerbereik dat 56 eenzaadlobbige en tweezaadlobbige soorten omvat29. FoMV heeft een 6,2 kilobase (kb) positief zintuig, enkelstrengs RNA-genoom dat codeert voor vijf verschillende eiwitten uit vijf open leesframes (ORF's)30,31,32,33,34,35. FoMV werd eerder ontwikkeld tot zowel een VIGS- als VOX-vector voor maïs door een infectieuze kloon op te nemen in een T-DNA-plasmide-backbone6,36,37. Het virale genoom werd voor VIGS-toepassingen aangepast door toevoeging van een kloonplaats (MCS1*) direct stroomafwaarts van het vachteiwit (CP) (figuur 1A)36. Voor VOX- en VEdGE-toepassingen werd de CP-promotor gedupliceerd en werd een tweede kloonlocatie (MCS2) toegevoegd om het invoegen van interessante sequenties tussen ORF 4 en de CP mogelijk te maken (figuur 1B)6. De FoMV-vector die zowel MCS1 als MCS2 zonder inserts bevat, is FoMV lege vector (FoMV-EV) (figuur 1).
SCMV is een niet-verwant virus dat is ontwikkeld voor VOX in maïs38. Het is een lid van de Potyviridae-familie, waarvan verschillende leden zijn ontworpen om vreemde eiwitten in planta39,40,41,42,43,44 tot expressie te brengen. Het gastheerbereik van SCMV omvat maïs, sorghum en suikerriet45,46, waardoor het waardevol is voor genfunctionele studies in deze belangrijke gewasplanten36,38. SCMV heeft een positief zintuiglijk, enkelstrengs RNA-genoom van ongeveer 10 kb lang47,48. Om de SCMV VOX-vector te maken, werd de gevestigde P1 /HCPro-junctie gebruikt als een insertieplaats voor heterologe sequenties38. Deze kloonplaats wordt gevolgd door sequentiecodering van een NIa-Pro proteasesplitsingsplaats, wat leidt tot de productie van eiwitten die onafhankelijk zijn van het SCMV-polyproteïne (figuur 1C).
T-DNA plasmiden die infectieus cDNA van deze recombinante virussen dragen, zijn omgezet in Agrobacterium stam GV3101. GV3101 is een nopaline-type stam, waarvan bekend is dat ze T-DNA kunnen overbrengen naar eenzaadlobbige soorten, waaronder maïs26,28,49. Bovendien hebben eerdere agro-injectiestudies de stammen C58 of het derivaat GV3101 gebruikt, evenals19,20,22,27.
Bij de ontwikkeling van dit protocol zijn drie markergenen gebruikt: twee voor gen-uitschakeling en één voor genexpressie. Een 329 base-pair (bp) fragment van het maïsgen laesie nabootsen 22 (les22, GRMZM2G044074) werd gebruikt om de dempingsvector FoMV-LES22 te construeren. Wanneer les22 in maïs tot zwijgen wordt gebracht, verschijnen kleine, ronde vlekken van necrotische cellen langs de vasculatuur van bladeren die uitzetten en samensmelten tot grote gebieden necrotisch bladweefsel50. FoMV-PDS, met een 313 bp-fragment van het sorghumgen fyto-etreendesaturase (pds, LOC110436156, 96% sequentie-identiteit naar maïs pds, GRMZM2G410515), induceert uitschakeling van pds in maïs, wat resulteert in kleine strepen van gefotobleekte cellen langs de vasculatuur van de bladeren die in de loop van de tijd verlengen51. De intacte coderende sequentie voor groen fluorescerend eiwit (GFP) werd gebruikt om eiwitexpressie aan te tonen voor zowel FoMV (FoMV-GFP) als SCMV (SCMV-GFP). GFP-expressie in de bladeren is meestal het meest detecteerbaar 14 dagen na inenting (DPI)6. Hoewel er eerdere studies zijn geweest met agro-injectie van virale vectoren in maïs, hebben deze experimenten alleen aangetoond dat agro-injectie virale infectie van een infectieuze kloon in maïszaailingen kan vergemakkelijken en zich niet uitbreidt naar recombinante virussen die zijn ontworpen voor VIGS- of VOX-toepassingen19,20,21,22. Het hier gepresenteerde protocol bouwt voort op eerdere agro-injectiemethoden, met name Grismley et al.19. Over het algemeen is deze agro-injectiemethode compatibel met VIGS- en VOX-vectoren, vereist deze geen gespecialiseerde apparatuur of alternatieve gastheren als entbronnen en vermindert het de totale tijd en kosten die nodig zijn om inentingen op te zetten en uit te voeren ten opzichte van andere gangbare methoden die biolistica of in vitro transcriptie vereisen. Dit protocol zal functionele genomics studies in maïs vergemakkelijken met toepassingen met VIGS, VOX en VEdGE.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955450</td>
			<td>alternatively, BD 309659</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Corning Science</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1kb+ Ladder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10787018</td>
			<td>For assessing sizes of PCR products</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G x 5/8&#34; PrecisionGlide Needles</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28&#176;C Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Agrobacterium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For E. coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D134406</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A4800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>E-3120</td>
			<td>For making gels to check for virus/insert stability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrobacterium tumefaciens Strain GV3101</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Carries vir plasmid encoding T-DNA transfer machinery, RifR, GmR, from lab stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bsu36I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K1672</td>
			<td>Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit with Dnase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C298</td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5alpha Competent E. coli Cells</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Ligase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K1422</td>
			<td>Rapid DNA Ligation Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenediamine Tetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Peters Fertilizer 15-15-15 Concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat Inserts</td>
			<td>T.O. Plastics</td>
			<td>715357C</td>
			<td>For germinating seeds in trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flats</td>
			<td>T.O. Plastics</td>
			<td>710245C</td>
			<td>For germinating seeds in trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorCam</td>
			<td>Photon Systems Instruments</td>
			<td></td>
			<td>To assess maize plants for GFP expression before microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Electrophoresis Box</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A38</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-500</td>
			<td>For saving frozen stocks of bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Go-Taq, 2X</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144</td>
			<td>for pHing solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>109827</td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin, Monosulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Pots</td>
			<td>Kordlok</td>
			<td>SQL0550</td>
			<td>5x5x4&#34; or bigger.&#160; For transplanting seedlings.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani (LB) Broth, Miller</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>M1245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maize Golden Bantam Sweet Corn Seed</td>
			<td>American Meadows, West Coast Seeds</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maize Inbred Seed</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Our seed comes from our institution, but we are not able to provide this for other researchers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxima H Minus Reverse Transcriptase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EP0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ</td>
			<td>Elga</td>
			<td></td>
			<td>Purelab Ultra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch PCR &#38; DNA Cleanup Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peters Excel 15-5-15 Fertilizer</td>
			<td>ICL Specialty Fertilizers</td>
			<td>G99140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, 95 mm x 15 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875714G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P171</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Our primers were synthesized through our institutional DNA facility or through IDT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PspOMI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>557303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase A</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12091021</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SbfI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For weighing chemicals for media or buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil Substrate</td>
			<td>SunGro Horticulture</td>
			<td>SS#1-F1P</td>
			<td>Sunshine Mix #1/Fafard-1P, any soil mix that maize grows well in is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For measuring OD600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sybr Safe, 10,000X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S33102</td>
			<td>For making gels to check for virus/insert stability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP154</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>15596018</td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh Paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For weighing chemicals for media or buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XbaI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0145</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct agroinoculation of maize seedlings by injection with recombinant foxtail mosaic virus and sugarcane mosaic virus infectious clones

Agrobacterium-gebaseerde inentingsbenaderingen worden veel gebruikt voor het introduceren van virale vectoren in plantenweefsels. Deze studie beschrijft een protocol voor de injectie van maïszaailingen in de buurt van meristematisch weefsel met Agrobacterium die een virale vector draagt. Recombinant vossenstaartmozaïekvirus (FoMV) klonen ontworpen voor gen-uitschakeling en genexpressie werden gebruikt om deze methode te optimaliseren, en het gebruik ervan werd uitgebreid met een recombinant suikerrietmozaïekvirus (SCMV) ontworpen voor genexpressie. Genfragmenten of coderende sequenties van belang worden ingevoegd in een gemodificeerd, infectieus viraal genoom dat is gekloond in de binaire T-DNA plasmide vector pCAMBIA1380. De resulterende plasmideconstructies worden omgezet in Agrobacterium tumefaciens stam GV3101. Maïszaailingen vanaf 4 dagen oud kunnen in de buurt van de coleoptilar-knoop worden geïnjecteerd met bacteriën die zijn geresuspendeerd in MgSO4-oplossing . Tijdens infectie met Agrobacterium wordt het T-DNA dat het virale genoom draagt overgebracht naar maïscellen, waardoor de transcriptie van het virale RNA-genoom mogelijk is. Naarmate het recombinante virus zich repliceert en systemisch door de plant verspreidt, kunnen virale symptomen en fenotypische veranderingen als gevolg van het uitschakelen van de doelgenen laesie nabootsen 22 (les22) of fytoeen desaturase (pds) worden waargenomen op de bladeren, of expressie van groen fluorescerend eiwit (GFP) kan worden gedetecteerd bij verlichting met UV-licht of fluorescentiemicroscopie. Om het virus te detecteren en tegelijkertijd de integriteit van de insert te beoordelen, wordt RNA geëxtraheerd uit de bladeren van de geïnjecteerde plant en wordt RT-PCR uitgevoerd met behulp van primers die de multiple cloning site (MCS) flankeren die de ingebrachte sequentie dragen. Dit protocol is effectief gebruikt in verschillende maïsgenotypes en kan gemakkelijk worden uitgebreid naar andere virale vectoren, waardoor het een toegankelijk hulpmiddel biedt voor de introductie van virale vectoren in maïs.

Watch this Scientific Journal Video about Direct Agroinoculation of Maize Seedlings by Injection with Recombinant Foxtail Mosaic Virus and Sugarcane Mosaic Virus Infectious Clones at JoVE.com

Direct Agroinoculation of Maize Seedlings by Injection with Recombinant Foxtail Mosaic Virus and Sugarcane Mosaic Virus Infectious Clones

Een agrobacterium-based injection (agroinjectie) protocol wordt gepresenteerd voor de inenting van vossenstaart mozaïek virus en suikerriet mozaïek virusclones in maïs zaailingen. Inenting op deze manier leidt tot virale infectie, virus-geïnduceerde gen-uitschakeling van markergenen en virale overexpressie van GFP.

Directe agroinoculatie van maïszaailingen door injectie met recombinant vossenstaartmozaïekvirus en suikerrietmozaïekvirus Infectieuze klonen

Agrobacterium-based inoculation approaches are widely used for introducing viral vectors into plant tissues. This study details a protocol for the ...

Dit protocol maakt het mogelijk om virale vectoren rechtstreeks in maïsplanten te inenten die gemakkelijk kunnen worden toegepast in de meeste laboratoriumomgevingen zonder de noodzaak van dure gespecialiseerde apparatuur. Directe inenting elimineert het gebruik van een alternatieve gastheer als entbron, waardoor zowel tijd als middelen worden bespaard. Deze methode kan worden toegepast op extra virale vectoren, maïslijnen en mogelijk andere eenzaadlobbige soorten.Begin met het planten van 1 tot 2 maïszaden in het op turf gebaseerde groeimedium in kleine inzetstukken die in trays worden geplaatst. Plaats de trays in een groeikamer onder 16 uur per dag bij 25 graden Celsius en 8 uur 's nachts bij 22 tot 25 graden Celsius, of in een kas bij 22 tot 25 graden Celsius met 16 uur dagen en 8 uur nachten. Geef planten regelmatig water en bemest eenmaal per week met 15-5-15 vloeibare meststof met een concentratie van 330 delen per miljoen.Bereid agrobacterium voor injectie door de agrobacterium-stam met het gewenste virale construct in LB-media in te enten met antibiotica. Incubeer vervolgens de kolf of buizen bij 28 graden Celsius terwijl u gedurende 24 uur bij 225 RPM schudt. Pellet de volgende dag de bacteriën door centrificatie op 4.000 keer G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en gooi het supernatant weg.Was vervolgens de pellet met één milliliter gedeïoniseerd water. Suspensie de pellet opnieuw in een milliliter magnesiumsulfaatoplossing van 10 millaris en meet de optische dichtheid op 600 nanometer. Stel het vervolgens in op 1.0.Gebruik 4 tot 7 dagen oude maïszaailingen voor het injecteren van agrobacterium. Monteer de spuit en naald. Injecteer de bacteriële suspensie voorzichtig 2-3 millimeter boven de coleoptilulaire knoop totdat deze de coleoptiel vult, of zichtbaar is in de krans, in afwachting van het groeistadium van de planten.Injecteer alle zaailingen en vervang de spuit en naalden voor het injecteren van elk construct. Bevestig fenotypische infectie door laesies te observeren van het uitschakelen van de controlegenen, laesie bootst 22 of fytoeendesaturase op de bladeren na. Gebruik een fluorescentiebeeldvormingsapparaat voor snelle screening van planten en fluorescentiemicroscopie om de aanwezigheid van GFP-expressie te detecteren.Voer genexpressieanalyse uit voor moleculaire detectie van infecties. Extraheer totaal RNA uit bladeren van geïnfecteerde planten 14 tot 21 dagen na infectie en synthetiseerde eerste streng cDNA zoals beschreven in het tekstmanuscript. Voer reverse transcriptase PCR uit om de infectie te bevestigen en de integriteit of het genfragment van belang te bepalen met behulp van specifieke primers die zijn ontworpen voor verschillende virale constructen.Visualiseer het PCR-product op een 1% agarosegel met een nucleïnezuurvlek om de aan- of afwezigheid van virus en gen- of genfragment te bepalen. Dit protocol werd gebruikt om recombinante virussen die zijn ontworpen voor gen in maïszaailingen in te brengen. Ongeveer 12 dagen na injectie werden uitschakelingsfenotypen op bladeren waargenomen als necrose en een fotobleaching.De aanwezigheid van construct in bladeren na infectie werd gedetecteerd door groene fluorescerende eiwitexpressie onder fluorescentie te observeren met behulp van een ander GFP-filter. Groene fluorescerende eiwitexpressie in met vossenstaartmozaïekvirus geïnfecteerde bladeren werd gevisualiseerd als kleine punctate gebieden van fluorescentie verdeeld over de bladeren en als grote vlekken in met suikerrietmozaïekvirus geïnfecteerde bladeren. Met behulp van de genexpressieanalyse werd systemische vossenstaartmozaïekvirusinfectie bevestigd en werd gen-uitschakeling of onderdrukking van fytoeendesaturase en laesie-nabootsing 22 waargenomen.De constructie gebruikte ook beïnvloede infectie-efficiëntie. In het geval van vossenstaartmozaïekvirusinfectie hadden vossenstaartmozaïekvirus lege vector en vossenstaartmozaïekviruslaesie nabootsing 22 meestal de hoogste infectie-efficiëntie bij respectievelijk 53% en 54%. Vossenstaartmozaïekvirus fytoeen desaturase met een iets lagere efficiëntie bij 39% en vossenstaartmozaïekvirus groen fluorescerend eiwit, bij het laagste rendement bij 16%Ondertussen was de infectie-efficiëntie van suikerrietmozaïekvirus groen fluorescerend eiwit 8%Timing en symptomen zullen gebaseerd zijn op de gebruikte virale vector en maïslijn.Gebrek aan een visueel fenotype betekent mogelijk niet een gebrek aan uitschakeling of expressie. Deze methode kan ook worden toegepast op genbewerkingstechnologieën door de toedieningsmethoden voor gids-RNA's te verbeteren.

Research

JoVE Journal

Biology

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Vaccinia virus infectie en Temporele Analyse van de Virus Gene Expression: Deel 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Vaccinia virus infectie en Temporele Analyse van de Virus Gene Expression: Deel 2

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Vaccinia virus infectie en Temporele Analyse van de Virus Gene Expression: Deel 3

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

Een techniek om tegelijkertijd Visualiseer virus-specifieke CD8 + T-cellen en virus-geïnfecteerde cellen In situ</em

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences

Mozaïek zebravis Transgenese voor het evalueren van Enhancer Sequences

The completion of the human genome sequence, along with that of many other species, has highlighted the challenge of ascribing specific function to non ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

Directe levering van MAV Morpholinos Into the zebravis Otocyst door injectie en elektroporatie van invloed op binnenoor Ontwikkeling

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

Chemisch-geblokkeerde Antilichaam Microarray voor multiplexverzending High-throughput Profilering van specifiek eiwit glycosylering in Complex Samples

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

De MultiBac Protein Complex Production Platform in het EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

De Tomaat / GFP-FLP / FRT Methode voor Live Imaging van Mozaïek Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotoreceptorcellen

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination

Expressie en zuivering van virusachtige deeltjes voor vaccinatie

Virus-like particles (VLPs) and subviral particles (SVPs) are an alternative approach to viral vaccine design that offers the advantages of increased ...