Name: direct agroinoculation of maize seedlings by injection with recombinant foxtail mosaic virus and sugarcane mosaic virus infectious clones
Uploaded: 2021-02-27T14:30:00
Duration: 5 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Agroinoculation of Maize Seedlings by Injection with Recombinant Foxtail Mosaic Virus and Sugarcane Mosaic Virus Infectious Clones at JoVE.com

אוניברסיטת איווה סטייט היא חלק מצוות התומך בתוכנית בעלות הברית החרקים של DARPA HR0011-17-2-0053. עבודה זו נתמכה גם על ידי המכון למדעי הצמח של אוניברסיטת איווה, המרכז לביו-הנדסה של אוניברסיטת איווה סטייט, פרויקט NIFA Hatch מספר 3808 של משרד החקלאות האמריקאי, וקרנות מדינת איווה. K.L.H. נתמך באופן חלקי גם על ידי אוניברסיטת איווה המדינה חיזוי צמח פנומיקה בוגר תוכנית הכשרה במימון הקרן הלאומית למדע (DGE #1545453) ועל ידי מענק יוזמה חקלאית ומחקר מזון מס '2019-07318 מהמכון הלאומי למזון וחקלאות של משרד החקלאות. למממנים לא היה כל תפקיד בעיצוב המחקר והאיסוף, הניתוח והפרשנות של הנתונים ובכתיבת כתב היד. כל הדעות, הממצאים והמסקנות או ההמלצות המובעות בחומר זה הן של המחברים ואינן משקפות בהכרח את עמדותיהם של המממנים.
אנו מודים לניק לאוטר (USDA-ARS, איימס, IA) על זרעים של קווים מולדים תירס, כריסטיאן פ מונטס-סארי (אוניברסיטת איווה סטייט) על ביצוע שיבוט FoMV-GFP, וטיילר אוסטין (אוניברסיטת איווה סטייט) על סיוע טכני.

לחוקרים אין ניגודי עניינים לחשוף.

אגרובקטריום הוא כלי חיוני המאפשר טכניקות ביולוגיה מולקולרית רבות במחקר הקשור לצמחים. מחקר זה מספק פרוטוקול אגרואינג'קציה לחיסון וקטורים ויראליים FoMV ו- SCMV ישירות לתוך רקמות תירס עבור יישומי VIGS ו- VOX. המטרה העיקרית היא להגדיל את הקלות ואת התועלת של טכנולוגיות מבוססות וירוס למחקר בצמחי גידול מונוקוט. למרות אגרוינוקולציה ישירה של תירס דווח עבור כמה וירוסים, המחברים אינם מודעים לפרוטוקול מפורט, ואין דוגמאות של VIGS ו VOX יישומים במחקרים אלה19,22.
זה דווח, ואושר בעת פיתוח פרוטוקול זה, כי מיקום ההזרקה הוא גורם מפתח עבור בהצלחה השקת זיהום ויראלי מערכתי באמצעות agroinjection19. באופן עקבי הזרקת המיקום המומלץ על הצמח הוא הניח להיות המשתנה הגדול ביותר, כי המיקום המדויק של meristem בשתילי תירס הוא כמעט בלתי ניתן לגילוי על ידי העין. כדי למזער את השונות הבין-אישית, מומלץ לנתח כמה שתילי תירס עד לריסיסטם כדי לדמיין טוב יותר את מיקומו (איור 3C). המיקום של meristem ביחס לצומת coleoptilar צריך להיות בערך זהה עבור צמחים בגילאי 4-7 ימים. בנוסף, תרגול הזרקה עם נוזל צבוע מספק הדגמה גלויה לעין של האופן שבו ה"אינקולום" ממלא את העלה, ומכיוון שאתר ההזרקה מסומן בצבע, ניתן לאשש את הדיוק של אתר ההזרקה (איור 3G, H). רקמות מריסטמטיות הן הרגישות ביותר לאגרואינג'נטציה, אך הזרקת השעיות אגרובקטריום ישירות לרקמה זו גורמת להשפעות מורפולוגיות בלתי רצויות (איור 6)19. צמחים עם מריסטמים פגומים שורדים, אך הפגמים הנובעים מכך אינם רצויים, ולכן יש להימנע מהזרקה ישירה של רקמה זו.
ישנם מספר משתנים שעשויים להשפיע על ההשקה המוצלחת של זיהום ויראלי מערכתי באמצעות אגרואינג'קציה מכיוון ששלוש מערכות ביולוגיות מורכבות (צמח, וירוס וזן אגרובקטריום) חייבות לקיים אינטראקציה בתיאום. יחסי הגומלין המורכבים האלה עשויים להסתייע בתאים המתחלקים במהירות של האזור המריסטמטי, מה שהופך אותו למיקום אידיאלי לאגרוינוקולציה19. זן אגרובקטריום חייב להיות מסוגל להדביק תאים של רקמות הצמח כדי לספק את T-DNA הנושא את הגנום הנגיפי, והצמח חייב להיות רגיש לנגיף על מנת ליזום שכפול ויראלי וזיהום מערכתי. גנוטיפים של תירס שונים ברגישותם לווירוסים (למשל, Mo17 עמיד בפני FoMV) או זני אגרובקטריום, אך נראה כי הרוב שנבדקו רגישים הן ל- FoMV והן ל- SCMV (טבלה 1 ולטבלה 2)53. לדוגמה, הקו המולד FR1064 ומגוון התירס המתוק גולדן באנטם עשויים להיות רגישים במיוחד הן לאגרובקטריום GV3101 והן לווקטורים מבוססי FoMV.
מספר העלה שנדגם ותזמון הדגימה עבור RT-PCR הוא קריטי להערכה מדויקת של זיהום ויראלי. בדוגמאות המוצגות כאן, מספר העלה נקבע על ידי התחלה בעלה המעוגל הראשון (הידוע בכינויו "עלה האגודל") וספירה כלפי מעלה. העלים נדגמו לאחר שהורחבו והעלה הבא החל לצוץ. עם זאת, אילו עלים אופטימליים לדגימה עשויים להשתנות בהתאם למינים של וירוסים המשמשים, תנאי גדילה וגנוטיפ תירס. לכן, ניסוי קורס זמן ראשוני מומלץ בעת החלת פרוטוקול זה על מערכת וירוסים חדשה כדי לייעל את אסטרטגיית הדגימה ביחס לעלים ותזמון.
המבנה הספציפי המשמש משפיע באופן משמעותי על היעילות של פרוטוקול זה. לדוגמה, הווקטורים הריקים, FoMV-EV ו- SCMV-EV, ו- FoMV-PDS ו- FoMV-LES22, אשר שניהם מכילים תוספות קטנות (313 bp ו- 329 bp, בהתאמה), בדרך כלל מייצרים את האחוזים הגבוהים ביותר של צמחים עם תסמינים ויראליים בניסויים אלה (טבלאות 1 וטבלה 2). עם זאת, וירוסים רקומביננטיים הנושאים תוספות גדולות יותר של GFP ORF (720 bp) ב- FoMV-GFP ו- SCMV-GFP, היו בעלי שיעורי זיהום נמוכים בהרבה בהשוואה לצמחים שהוזרקו עם מבני וקטור או השתקת גנים ריקים. מגמה זו עשויה לנבוע מההשפעות השליליות על הכושר הנגיפי הנגרמות על ידי כמויות הולכות וגדלות של חומר גנטי אקסוגני בגנום הנגיפי. מספר מחקרים הראו כי יציבות ההוספה של וקטורים ויראליים צמחיים תלויה במידה רבה בגודל ההוספה וברצף36,54,55,56,57. בנוסף, היה הבדל בולט באחוז הצמחים שנדבקו בעקבות חיסון עם הווקטור הריק FoMV או SCMV, מה שמרמז על עבודה נוספת הדרושה כדי לייעל פרוטוקול זה עבור SCMV (טבלה 1). תוצאות אלה מצביעות על כך שייתכן שיהיה צורך בפתרון בעיות מסוים בעת פיתוח מבנה, מכיוון שהרצף והאורך של הקטע יכולים להשפיע על היעילות.
בסך הכל, מחקר זה הראה כי agroinjection של שתילי תירס היא שיטת חיסון יעילה עבור שני וירוסים שונים צמח RNA, תצורות וקטור מרובות, ו 11 גנוטיפים של תירס. עבודה זו עם FoMV ו- SCMV, בשילוב עם עבודות קודמות תוך ניצול הזרקה עם וירוס מטל כלורוטי תירס (MCMV) או MSV, מצביעה על כך שאגרוינג'נט מתאים לחיסון שתילי תירס עם שיבוטים זיהומיים של נגיפי RNA ו- DNA19,20,20,21,222. בנוסף, עבודה זו מראה עוד יותר agroinjection היא שיטה בת קיימא עבור וקטורים VIGS ו VOX והוא יכול להיות מיושם על צמחים צעירים כמו ארבעה ימים (טבלה 3). הפרוטוקול המוצג כאן צפוי להיות מותאם בקלות על ידי ביולוגים תירס כדי להקל על מחקר במחקרים גנומיים פונקציונליים מעורבים השתקת גנים חולפים (VIGS) ו overexpression (VOX). Agroinjection יש גם את היכולת להקל על גישות עריכת גנים מבוססות וירוסים (VEdGE) שאחרת היו מוגבלות על ידי הסתמכות על טרנספורמציה של צמחים, פוטנציאל שיפור יעילות העריכה, כמו גם נגישות58,59,60. בהתחשב בזן האגרובקטריום המתאים, גנוטיפים של תירס, וקטורים ויראליים משולבים בקפידה, חיסון על ידי אגרואינג'קציה צפוי להפוך לכלי בעל ערך לניתוחי תפקוד גנים ארעיים בתירס.

שיבוטים זיהומיים של וירוסים צמחיים רבים תוכננו להשתקת גנים הנגרמת על ידי וירוסים (VIGS), ביטוי יתר של גנים (VOX), ולאחרונה, עריכת גנים התומכת בווירוסים (VEdGE)1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . כמו מבנים ויראליים חדשים מפותחים, שיטות להדביק בהצלחה רקמות צמח עם וירוסים מותאמים אלה חייבים להיחשב גם. השיטות הנוכחיות להפעלת זיהומי וירוסים בצמחים כוללות הפגזת חלקיקים, חיסון לשפשף של תמלילי RNA במבחנה או שיבוטי DNA, חיסון ניקוב כלי דם, או חיסון אגרובקטריום טומפצ'ין (אגרונוקולציה)5,12,13,14,15,16,17 . לכל אחת משיטות החיסון הללו יש יתרונות וחסרונות אינהרנטיים, הכוללים עלות, צורך בציוד מיוחד והיתכנות בתוך מערכת צמחית-וירוס נתונה. שיטות המשתמשות בחדירה או הזרקה של זני אגרובקטריום המכילים מבני T-DNA בינאריים שנועדו לספק וירוסים רקומביננטיים עדיפים, מכיוון שהם פשוטים וזולים. עם זאת, שיטות אגרוינוקולציה מפורטות עבור מינים מונוקוטילדוניים כגון Zea mays (תירס) חסרים.
אחד הדיווחים הראשונים על אגרוינוקולציה למסירת וירוסים פורסם בשנת 1986, כאשר הגנום של וירוס פסיפס הכרובית (CaMV) הוכנס למבנה T-DNA, והאגרובקטריום שנוצר שנשא מבנה זה היה מחוסן על צמחי לפת18. שיטות נוספות לאגרוינוקולציה פותחו מאז. לדוגמה, במקרה של וירוס פסיפס זנב שועל (FoMV), Nicotiana benthamiana יכול לשמש כפונדקאי ביניים כדי ליצור חלקיקי וירוס בעלים המספקים מקור אינוקולום6. לשפשף את החיסון של תירס באמצעות עלי N. benthamiana נגועים הוא יעיל, מהיר, ופשוט, אבל השימוש של פונדקאי ביניים אינו עובד עבור כל וירוסים מדביקי תירס. וירוס פסיפס קנה סוכר (SCMV), למשל, לא יכול להדביק N. benthamiana, הדורש שימוש במקורות inoculum חלופיים עבור וקטורים נגזר וירוס זה. בשנת 1988, אגרובקטריום המכיל וירוס פס תירס (MSV), וירוס DNA, הוכנס לשתילי תירס על ידי הזרקה (אגרוינג'קציה), הדגמת שיטות חיסון מבוססות אגרובקטריום שימושיות גם עבור מונוקוטים19. למרות הצלחה מוקדמת זו עם אגרוינג'קציה, מעט מחקרים המשתמשים בטכניקה זו בתירס פורסמו, משאירים שאלות פתוחות על הישימות של שיטה זו עבור וירוסי RNA ו- VIGS, VOX ו- VEdGE וקטורים20,21,222. עם זאת, שימוש נרחב של אגרואינג'קציה במין מונוקוט הוא מבטיח, כי גישה כללית זו נוצלה סחלב, אורז, חיטה23,24,25,26,27,28.
פרוטוקול זה היה ממוטב עבור FoMV ו זן אגרובקטריום GV3101 וגם הוחל על וקטור SCMV. FoMV הוא וירוס פוטקסוירוס עם מגוון רחב של מארחים הכולל 56 מינים מונוקוט ודיקוט29. ל-FoMV יש חוש חיובי של 6.2 קילו-בסיס (kb), גנום RNA חד-גדילי המקודד חמישה חלבונים שונים מחמש מסגרות קריאה פתוחות (ORFs)30,31,32,33,34,35. FoMV פותחה בעבר הן לווקטור VIGS והן לווקטור VOX עבור תירס על ידי שילוב שיבוט זיהומי על עמוד שדרה פלסמיד T-DNA6,36,37. הגנום הנגיפי שונה עבור יישומי VIGS על ידי הוספת אתר שיבוט (MCS1*) מיד במורד הזרם של חלבון המעיל (CP) (איור 1A)36. עבור יישומי VOX ו- VEdGE, מקדם ה- CP שוכפל ונוספה אתר שיבוט שני (MCS2) כדי לאפשר הכנסת רצפים של אינטרסים בין ORF 4 ל- CP (איור 1B)6. וקטור ה-FoMV המכיל הן MCS1 והן MCS2 ללא תוספות הוא וקטור ריק FoMV (FoMV-EV) (איור 1).
SCMV הוא וירוס לא קשור שפותח עבור VOX ב- תירס38. הוא חבר במשפחת Potyviridae, אשר כמה חברים תוכננו להביע חלבונים זרים planta39,40,41,41,42,43,44. המגוון המארח של SCMV כולל תירס, דורה, קני סוכר45,46, מה שהופך אותו בעל ערך למחקרים פונקציונליים גנטיים בצמחי היבול העיקריים האלה36,38. SCMV יש חוש חיובי, גנום RNA חד גדילי של כ 10 kb אורך47,48. כדי ליצור את וקטור SCMV VOX, צומת P1/HCPro המבוסס היטב נוצל כאתר הכנסה עבור רצפים הטרולוגיים38. אתר שיבוט זה מלווה בקידוד רצף של אתר מחשוף פרוטאז NIa-Pro, מה שמוביל לייצור חלבונים ללא תלות בפוליפרוטאין SCMV (איור 1C).
פלסמידים T-DNA הנושאים cDNA זיהומיות של וירוסים רקומביננטיים אלה הפכו לזן אגרובקטריום GV3101. GV3101 הוא זן מסוג נופלין, אשר ידועים ביכולתם להעביר T-DNA למינים מונוקוטילדונים, כולל תירס26,28,49. בנוסף, מחקרים קודמים של אגרואינג'קציה השתמשו בזנים C58 או GV3101 הנגזרת שלו, כמו גם 19,20,22,27.
שלושה גני סמן שימשו בפיתוח פרוטוקול זה: שניים להשתקת גנים ואחד לביטוי גנים. קטע 329 בסיס-זוג (bp) מן נגע הגן תירס חיקוי 22 (les22, GRMZM2G044074) שימש לבניית וקטור ההשתקה FoMV-LES22. כאשר les22 מושתק בתירס, כתמים קטנים ועגולים של תאים נמקיים מופיעים לאורך כלי הדם של עלים המתרחבים ומתמזגים לאזורים גדולים של רקמת עלה נמק50. FoMV-PDS, המכיל שבר של 313 bp מהגן דורה פיטואן דטוראז (pds, LOC1110436156, 96% זהות רצף כדי pds תירס, GRMZM2G410515), גורם השתקה של pds בתירס, וכתוצאה מכך פסים קטנים של תאים פוטו מולבנים לאורך כלי הדם של העלים המתארכים לאורך זמן51. רצף הקידוד השלם של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) שימש להדגמת ביטוי חלבון הן עבור FoMV (FoMV-GFP) והן עבור SCMV (SCMV-GFP). ביטוי GFP בעלים הוא בדרך כלל ניתן לזיהוי ביותר ב 14 ימים לאחר החיסון (DPI)6. למרות שהיו מחקרים קודמים ניצול אגרואינג'קציה של וקטורים ויראליים בתירס, ניסויים אלה הראו רק כי agroinjection יכול רק להקל על זיהום ויראלי משיבוט זיהומיות בשתילי תירס ואינם מתרחבים וירוסים רקומביננטיים המיועדים ליישומי VIGS או VOX19,20,21,222. הפרוטוקול המוצג כאן מתבסס על שיטות אגרואינג'קציה קודמות, במיוחד Grismley et al.19. בסך הכל, שיטת agroinjection זו תואמת לווקטורים VIGS ו- VOX, אינה דורשת ציוד מיוחד או מארחים חלופיים כמקורות חיסון, ומפחיתה את הזמן והעלות הכוללים הנדרשים כדי להגדיר ולבצע חיסונים ביחס לשיטות נפוצות אחרות הדורשות ביוליסטיקה או תמלול הפריה חוץ גופית. פרוטוקול זה יאפשר מחקרי גנומיקה פונקציונליים בתירס עם יישומים הכוללים VIGS, VOX ו- VEdGE.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955450</td>
			<td>alternatively, BD 309659</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Corning Science</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1kb+ Ladder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10787018</td>
			<td>For assessing sizes of PCR products</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G x 5/8&#34; PrecisionGlide Needles</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28&#176;C Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Agrobacterium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For E. coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D134406</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A4800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>E-3120</td>
			<td>For making gels to check for virus/insert stability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrobacterium tumefaciens Strain GV3101</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Carries vir plasmid encoding T-DNA transfer machinery, RifR, GmR, from lab stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bsu36I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K1672</td>
			<td>Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit with Dnase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C298</td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5alpha Competent E. coli Cells</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Ligase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K1422</td>
			<td>Rapid DNA Ligation Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenediamine Tetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Peters Fertilizer 15-15-15 Concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat Inserts</td>
			<td>T.O. Plastics</td>
			<td>715357C</td>
			<td>For germinating seeds in trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flats</td>
			<td>T.O. Plastics</td>
			<td>710245C</td>
			<td>For germinating seeds in trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorCam</td>
			<td>Photon Systems Instruments</td>
			<td></td>
			<td>To assess maize plants for GFP expression before microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Electrophoresis Box</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A38</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-500</td>
			<td>For saving frozen stocks of bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Go-Taq, 2X</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144</td>
			<td>for pHing solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>109827</td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin, Monosulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Pots</td>
			<td>Kordlok</td>
			<td>SQL0550</td>
			<td>5x5x4&#34; or bigger.&#160; For transplanting seedlings.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani (LB) Broth, Miller</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>M1245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maize Golden Bantam Sweet Corn Seed</td>
			<td>American Meadows, West Coast Seeds</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maize Inbred Seed</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Our seed comes from our institution, but we are not able to provide this for other researchers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxima H Minus Reverse Transcriptase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EP0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ</td>
			<td>Elga</td>
			<td></td>
			<td>Purelab Ultra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch PCR &#38; DNA Cleanup Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peters Excel 15-5-15 Fertilizer</td>
			<td>ICL Specialty Fertilizers</td>
			<td>G99140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, 95 mm x 15 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875714G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P171</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Our primers were synthesized through our institutional DNA facility or through IDT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PspOMI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>557303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase A</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12091021</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SbfI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For weighing chemicals for media or buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil Substrate</td>
			<td>SunGro Horticulture</td>
			<td>SS#1-F1P</td>
			<td>Sunshine Mix #1/Fafard-1P, any soil mix that maize grows well in is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For measuring OD600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sybr Safe, 10,000X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S33102</td>
			<td>For making gels to check for virus/insert stability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP154</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>15596018</td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh Paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For weighing chemicals for media or buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XbaI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0145</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct agroinoculation of maize seedlings by injection with recombinant foxtail mosaic virus and sugarcane mosaic virus infectious clones

גישות חיסון מבוססות אגרובקטריום נמצאות בשימוש נרחב להכנסת וקטורים ויראליים לרקמות הצמח. מחקר זה מפרט פרוטוקול להזרקת שתילי תירס ליד רקמה מריסטית עם אגרובקטריום הנושא וקטור ויראלי. שיבוטים של וירוס זנב שועל רקומביננטי (FoMV) שתוכננו להשתקת גנים וביטוי גנים שימשו לייעול שיטה זו, והשימוש בה הורחב כדי לכלול וירוס פסיפס קני סוכר רקומביננטי (SCMV) שתוכנן לביטוי גנים. רסיסי גנים או רצפי קידוד של עניין מוכנסים לגנום ויראלי מדבק שונה, אשר שוכפל לתוך PCAMBIA1380 וקטור פלסמיד T-DNA בינארי pCAMBIA1380. המבנים plasmid וכתוצאה מכך הופכים אגרובקטריום tumefaciens זן GV3101. שתילי תירס צעירים כמו 4 ימים ניתן להזריק ליד צומת coleoptilar עם חיידקים resuspended בתמיסת MgSO4. במהלך ההדבקה באגרובקטריום, ה- T-DNA הנושא את הגנום הנגיפי מועבר לתאי תירס, ומאפשר שעתוק של הגנום הנגיפי RNA. כאשר הנגיף רקומביננטי משכפל ומתפשט באופן שיטתי ברחבי הצמח, ניתן להבחין בתסמינים ויראליים ושינויים פנוטיפיים הנובעים מהשתקת הגנים המטרה נגע מחקה 22 (les22) או פיטואן דטוראז (pds) על העלים, או ביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ניתן לזהות עם הארה עם אור UV או מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. כדי לזהות את הנגיף ולהעריך את שלמות ההוספה בו זמנית, RNA מופק מעלי הצמח המוזרק ו- RT-PCR מתבצע באמצעות פריימרים מאגפים את אתר השיבוט המרובה (MCS) הנושא את הרצף המוחדר. פרוטוקול זה שימש ביעילות במספר גנוטיפים תירס והוא יכול בקלות להיות מורחב לווקטורים ויראליים אחרים, ובכך מציע כלי נגיש עבור הקדמה וקטורית ויראלית תירס.

Watch this Scientific Journal Video about Direct Agroinoculation of Maize Seedlings by Injection with Recombinant Foxtail Mosaic Virus and Sugarcane Mosaic Virus Infectious Clones at JoVE.com

Direct Agroinoculation of Maize Seedlings by Injection with Recombinant Foxtail Mosaic Virus and Sugarcane Mosaic Virus Infectious Clones

פרוטוקול הזרקה מבוסס אגרובקטריום (אגרובקטריה) מוצג לחיסון של וירוס פסיפס זנב שועל ווירוסי פסיפס קני סוכר לשתילי תירס. חיסון באופן זה מוביל לזיהום ויראלי, השתקת גנים הנגרמת על ידי וירוס של גנים סמן, ו overexpression ויראלי של GFP.

אגרוינוקולציה ישירה של שתילי תירס על ידי הזרקה עם וירוס פסיפס זנב שועל רקומביננטי ווירוס פסיפס קנה סוכר שיבוטים זיהומיות

Agrobacterium-based inoculation approaches are widely used for introducing viral vectors into plant tissues. This study details a protocol for the ...

פרוטוקול זה מאפשר חיסון של וקטורים ויראליים ישירות לתוך צמחי תירס שניתן ליישם בקלות ברוב הגדרות המעבדה ללא צורך בציוד מיוחד יקר. חיסון ישיר מבטל את השימוש במחשב מארח חלופי כמקור אינוקולום, וחוסך זמן ומשאבים כאחד. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על וקטורים ויראליים נוספים, קווי תירס, ואולי מינים מונוקוט אחרים.התחל על ידי שתילת 1 עד 2 זרעי תירס במדיום גידול מבוסס כבול בתוספות קטנות להציב בתוך מגשים. מניחים את המגשים בתא גידול מתחת ל -16 שעות ביום ב 25 מעלות צלזיוס ו 8 שעות לילות ב 22 עד 25 מעלות צלזיוס, או בחממה ב 22 עד 25 מעלות צלזיוס עם 16 שעות ימים ו 8 שעות לילות. באופן קבוע מים צמחים להפרות פעם בשבוע עם 15-5-15 דשן נוזלי ב 330 חלקים למיליון ריכוז.הכן אגרובקטריום להזרקה על ידי חיסון זן אגרובקטריום המכיל את המבנה הנגיפי הרצוי במדיה LB עם אנטיביוטיקה. לאחר מכן, לדגור בקבוקון או צינורות ב 28 מעלות צלזיוס תוך רועד ב 225 סל"ד במשך 24 שעות. למחרת, גלולה את החיידקים על ידי צנטריפוגה ב 4, 000 פעמים G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולהשליך את supernatant.לאחר מכן, לשטוף את הכדור עם מיליליטר אחד של מים deionized. להשעות מחדש את הכדור במיליליטר אחד של 10 מילימולר מגנזיום גופרתי פתרון, ולמדוד את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר. ואז להתאים אותו ל 1.0.השתמש שתילי תירס בני 4 עד 7 ימים להזרקת אגרובקטריום. להרכיב את המזרק והמחט. בעדינות להזריק את ההשעיה החיידקית 2-3 מילימטרים מעל הצומת coleoptilular עד שהוא ממלא את coleoptile, או גלוי ב whorl, ממתין על שלב הצמיחה של הצמחים.הזרקו את כל השתילים והחליפו את המזרק והמחטים להזרקת כל מבנה. אשר זיהום פנוטיפי על ידי התבוננות נגעים מן השתקת הגנים השליטה, נגע לחקות 22 או desaturase פיטואן על העלים. השתמש בהתקן הדמיה פלואורסצנטית להקרנה מהירה של צמחים ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לזהות את נוכחותו של ביטוי GFP.בצע ניתוח ביטוי גנים לגילוי מולקולרי של זיהום. לחלץ RNA הכולל מעלים של צמחים נגועים 14 עד 21 ימים לאחר ההדבקה, ו מסונתז cDNA גדיל הראשון מסונתז כמתואר בכתב היד של הטקסט. בצע תמלול הפוך PCR כדי לאשר זיהום ולקבוע את שלמות הגן או שבר העניין הגנים באמצעות פריימרים ספציפיים המיועדים למבנים ויראליים שונים.דמיינו את מוצר ה-PCR על ג'ל 1%agarose המכיל כתם חומצת גרעין כדי לקבוע את נוכחותם או היעדרם של וירוסים ורסיסי גן או גן. פרוטוקול זה שימש להחדרת וירוסים רקומביננטיים שתוכננו עבור גנים לשתילי תירס. כ -12 ימים לאחר ההזרקה, השתקת פנוטיפים נצפו על עלים כמו נמק והלבנת פוטו.הנוכחות של מבנה בעלים לאחר זיהום זוהתה על ידי התבוננות בביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק תחת פלואורסצנטיות באמצעות מסנן GFP אחר. ביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק עלים נגועים בנגיף זנב שועל הומחשה כאזורים קטנים של פלואורסצנטיות המופצים על פני העלים וככתמים גדולים בווירוס פסיפס קנה סוכר נגועים בעלים. באמצעות ניתוח ביטוי הגנים, זיהום וירוס פסיפס זנב שועל מערכתי אושרה והשתקה גנים או דיכוי של פיטואן דסטוראז ונגע לחקות 22 נצפתה.המבנה השתמש גם ביעילות זיהום מושפעת. במקרה של זיהום וירוס פסיפס זנב שועל, וירוס foxtail פסיפס וקטור ריק, ו foxtail פסיפס וירוס נגע לחקות 22 בדרך כלל היו יעילות הזיהום הגבוהה ביותר ב 53% ו 54% בהתאמה. וירוס פסיפס Foxtail פיטואן desaturase ביעילות נמוכה מעט ב 39%, ו foxtail פסיפס וירוס ירוק פלואורסצנטי חלבון, ביעילות הנמוכה ביותר ב 16%בינתיים, יעילות הזיהום של וירוס קנה סוכר פסיפס חלבון פלואורסצנטי ירוק היה 8% תזמון הסימפטומים יתבססו על וקטור ויראלי קו תירס בשימוש.חוסר פנוטיפ חזותי לא יכול להיות חוסר השתקה או ביטוי. שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם על טכנולוגיות עריכת גנים על ידי שיפור שיטות המסירה עבור RNAs מדריך.

Research

JoVE Journal

Biology

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Vaccinia זיהום בנגיף וניתוח הזמני של ביטוי גנים וירוס: חלק 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Vaccinia זיהום בנגיף וניתוח הזמני של ביטוי גנים וירוס: חלק 2

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Vaccinia זיהום בנגיף וניתוח הזמני של ביטוי גנים וירוס: חלק 3

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

טכניקה במקביל דמיינו ספציפיות וירוס CD8 + T ו-תאים הנגועים בווירוס תאים באתרו</em

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences

דג הזברה פסיפס Transgenesis להערכת רצפים Enhancer

The completion of the human genome sequence, along with that of many other species, has highlighted the challenge of ascribing specific function to non ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

משלוח ישיר של MIF Morpholinos Into Otocyst דג הזברה על ידי הזרקת electroporation משפיעה על פיתוח האוזן הפנימית

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

נוגדן microarray כימי חסומים פרופיל תפוקה גבוהה מרובב של Glycosylation חלבון מסוים בדגימות מורכבות

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

פלטפורמת הפקת MultiBac החלבון המורכבת בEMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

העגבניות / GFP-FLP / FRT שיטת ההדמיה חיה של פסיפס למבוגרים בלבד<em&gt; דרוזופילה</em&gt; תאי קולטי אור

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination

ביטוי וטיהור של חלקיקים דמויי וירוס עבור חיסון

Virus-like particles (VLPs) and subviral particles (SVPs) are an alternative approach to viral vaccine design that offers the advantages of increased ...