Name: direct agroinoculation of maize seedlings by injection with recombinant foxtail mosaic virus and sugarcane mosaic virus infectious clones
Uploaded: 2021-02-27T14:30:00
Duration: 5 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Agroinoculation of Maize Seedlings by Injection with Recombinant Foxtail Mosaic Virus and Sugarcane Mosaic Virus Infectious Clones at JoVE.com

आयोवा स्टेट यूनिवर्सिटी DARPA के कीट सहयोगियों के कार्यक्रम HR0011-17-2-0053 का समर्थन करने वाली एक टीम का हिस्सा है। इस काम को आयोवा स्टेट यूनिवर्सिटी प्लांट साइंसेज इंस्टीट्यूट, आयोवा स्टेट यूनिवर्सिटी क्रॉप बायोइंजीनियरिंग सेंटर, यूएसडीए निफा हैच प्रोजेक्ट नंबर 3808 और आयोवा फंड्स के राज्य द्वारा भी समर्थित किया गया था। केएलएच को आंशिक रूप से आयोवा स्टेट यूनिवर्सिटी प्रेडिक्टिव प्लांट फेनोमिक्स स्नातक प्रशिक्षण कार्यक्रम द्वारा राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (डीजीई # 1545453) द्वारा वित्त पोषित और यूएसडीए नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ फूड एंड एग्रीकल्चर से कृषि और खाद्य अनुसंधान पहल अनुदान संख्या 2019-07318 द्वारा भी आंशिक रूप से समर्थित किया गया था। अध्ययन और संग्रह, विश्लेषण और डेटा की व्याख्या के डिजाइन और पांडुलिपि लिखने में फंडर्स की कोई भूमिका नहीं थी। इस सामग्री में व्यक्त की गई कोई भी राय, निष्कर्ष, और निष्कर्ष या सिफारिशें लेखकों की हैं और जरूरी नहीं कि फंडर्स के विचारों को प्रतिबिंबित करें।
हम निक Lauter (USDA-ARS, एम्स, IA) मक्का inbred लाइनों के बीज के लिए धन्यवाद, क्रिश्चियन एफ मोंटेस-Serey (आयोवा स्टेट यूनिवर्सिटी) FoMV-GFP क्लोन बनाने के लिए, और टायलर ऑस्टिन (आयोवा स्टेट यूनिवर्सिटी) तकनीकी सहायता के लिए.

शोधकर्ताओं के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Agrobacterium एक आवश्यक उपकरण है जो पौधों से संबंधित अनुसंधान में कई आणविक जीव विज्ञान तकनीकों की सुविधा प्रदान करता है। यह अध्ययन VIGS और VOX अनुप्रयोगों के लिए सीधे मक्का के ऊतकों में FoMV और SCMV वायरल वैक्टर को संक्रमित करने के लिए एक agroinjection प्रोटोकॉल प्रदान करता है। मुख्य लक्ष्य मोनोकोट फसल पौधों में अनुसंधान के लिए वायरस-आधारित प्रौद्योगिकियों की आसानी और उपयोगिता को बढ़ाना है। हालांकि कुछ वायरसों के लिए मक्का के प्रत्यक्ष कृषि-आयनीकरण की सूचना दी गई है, लेखकों को एक विस्तृत प्रोटोकॉल के बारे में पता नहीं है, और उन अध्ययनों में VIGS और VOX अनुप्रयोगों का कोई उदाहरण नहीं है19,22।
यह बताया गया है, और इस प्रोटोकॉल को विकसित करते समय पुष्टि की गई थी, कि इंजेक्शन स्थान agroinjection19 के माध्यम से एक प्रणालीगत वायरल संक्रमण को सफलतापूर्वक लॉन्च करने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है। लगातार पौधे पर अनुशंसित स्थान को इंजेक्ट करना सबसे बड़ा चर माना जाता है, क्योंकि मक्का के अंकुरों में मेरिस्टेम की सटीक स्थिति आंखों द्वारा लगभग अज्ञात है। पारस्परिक भिन्नता को कम करने के लिए, मेरिस्टेम के नीचे कुछ मक्का रोपाई को विच्छेदन करने के लिए इसके स्थान (चित्रा 3 सी) को बेहतर ढंग से कल्पना करने की सिफारिश की जाती है। कोलियोप्टिलर नोड के संबंध में मेरिस्टेम की स्थिति 4-7 दिनों की आयु के पौधों के लिए लगभग समान होनी चाहिए। इसके अतिरिक्त, एक रंगे हुए तरल के साथ इंजेक्शन का अभ्यास करना एक आसानी से दिखाई देने वाला प्रदर्शन प्रदान करता है कि "इनोकुलम" पत्ती को कैसे भरता है, और क्योंकि इंजेक्शन साइट को डाई के साथ चिह्नित किया जाता है, इंजेक्शन साइट की सटीकता की पुष्टि की जा सकती है (चित्रा 3 जी, एच)। मेरिस्टेमेटिक ऊतक कृषि इंजेक्शन के लिए सबसे अधिक संवेदनशील होते हैं, लेकिन इस ऊतक में सीधे एग्रोबैक्टीरियम निलंबन को इंजेक्ट करने के परिणामस्वरूप अवांछनीय रूपात्मक प्रभाव होते हैं (चित्रा 6)19। क्षतिग्रस्त मेरिस्टेम वाले पौधे जीवित रहते हैं, लेकिन परिणामस्वरूप दोष अवांछनीय होते हैं, और इस प्रकार, इस ऊतक के प्रत्यक्ष इंजेक्शन से बचा जाना चाहिए।
ऐसे कई चर हैं जो एग्रोइंजेक्शन के माध्यम से एक प्रणालीगत वायरल संक्रमण के सफल प्रक्षेपण को प्रभावित कर सकते हैं क्योंकि तीन जटिल जैविक प्रणालियों (पौधे, वायरस और एग्रोबैक्टीरियम तनाव) को समन्वय में बातचीत करनी चाहिए। इस जटिल इंटरप्ले को मेरिस्टेमेटिक क्षेत्र की तेजी से विभाजित कोशिकाओं द्वारा सहायता प्रदान की जा सकती है, जिससे यह कृषि-इनोकुलेशन 19 के लिए एक आदर्श स्थान बन जाता है। एग्रोबैक्टीरियम तनाव को वायरल जीनोम को ले जाने वाले टी-डीएनए को वितरित करने के लिए पौधे के ऊतकों की कोशिकाओं को संक्रमित करने में सक्षम होना चाहिए, और वायरल प्रतिकृति और प्रणालीगत संक्रमण शुरू करने के लिए पौधे को वायरस के लिए अतिसंवेदनशील होना चाहिए। मक्का जीनोटाइप वायरस के प्रति उनकी संवेदनशीलता में भिन्न होते हैं (उदाहरण के लिए, Mo17 FoMV के लिए प्रतिरोधी है) या Agrobacterium उपभेदों, लेकिन अधिकांश जो परीक्षण किए गए थे, वे FoMV और SCMV (तालिका 1 और तालिका 2) दोनों के लिए अतिसंवेदनशील प्रतीत होते हैं। उदाहरण के लिए, इनब्रीड लाइन FR1064 और स्वीट कॉर्न किस्म गोल्डन बैंटम विशेष रूप से GV3101 Agrobacterium और FoMV-आधारित वैक्टर दोनों के लिए अतिसंवेदनशील हो सकती है।
वायरल संक्रमण के सटीक मूल्यांकन के लिए नमूना लीफ नंबर और आरटी-पीसीआर के लिए नमूने का समय महत्वपूर्ण है। यहां दिखाए गए उदाहरणों में, पत्ती की संख्या पहले गोल पत्ते (आमतौर पर "अंगूठे की पत्ती" के रूप में जाना जाता है) से शुरू करके और ऊपर की ओर गिनती करके निर्धारित की गई थी। पत्तियों का नमूना लिया गया था जब वे विस्तारित किए गए थे और अगली पत्ती उभरने लगी थी। हालांकि, जो पत्तियां नमूने के लिए इष्टतम हैं, वे उपयोग की जाने वाली वायरस प्रजातियों, विकास की स्थिति और मक्का जीनोटाइप के आधार पर भिन्न हो सकती हैं। इसलिए, पत्तियों और समय के संबंध में नमूना रणनीति को अनुकूलित करने के लिए एक नए वायरस सिस्टम पर इस प्रोटोकॉल को लागू करते समय एक प्रारंभिक समय पाठ्यक्रम प्रयोग की सिफारिश की जाती है।
उपयोग किया गया विशिष्ट निर्माण इस प्रोटोकॉल की दक्षता को काफी प्रभावित करता है। उदाहरण के लिए, खाली वैक्टर, FoMV-EV और SCMV-EV, और FoMV-PDS और FoMV-LES22, जिनमें दोनों छोटे आवेषण (क्रमशः 313 bp और 329 bp) होते हैं, आमतौर पर इन प्रयोगों में वायरल लक्षणों वाले पौधों के उच्चतम प्रतिशत का उत्पादन करते हैं (तालिका 1 और तालिका 2)। हालांकि, FoMV-GFP और SCMV-GFP में GFP ORF (720 bp) के बड़े आवेषण को ले जाने वाले पुनः संयोजक वायरस, खाली वेक्टर या जीन साइलेंसिंग निर्माणों के साथ इंजेक्ट किए गए पौधों की तुलना में बहुत कम संक्रमण दर थी। यह प्रवृत्ति वायरल जीनोम में बहिर्जात आनुवंशिक सामग्री की बढ़ती मात्रा के कारण वायरल फिटनेस पर नकारात्मक प्रभावों के कारण हो सकती है। कई अध्ययनों से पता चला है कि पौधे वायरल वैक्टर की सम्मिलित स्थिरता काफी हद तक सम्मिलित आकार और अनुक्रम 36,54,55,56,57 पर निर्भर करती है। इसके अतिरिक्त, उन पौधों के प्रतिशत में एक उल्लेखनीय अंतर था जो या तो FoMV या SCMV खाली वेक्टर के साथ टीकाकरण के बाद संक्रमित हो जाते हैं, यह सुझाव देते हुए कि SCMV (तालिका 1) के लिए इस प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने के लिए अतिरिक्त काम की आवश्यकता है। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि एक निर्माण विकसित करते समय कुछ समस्या निवारण की आवश्यकता हो सकती है, क्योंकि खंड का अनुक्रम और लंबाई दोनों दक्षता को प्रभावित कर सकते हैं।
कुल मिलाकर, इस अध्ययन से पता चला है कि मक्का के अंकुरों का एग्रोइंजेक्शन दो अलग-अलग आरएनए प्लांट वायरस, कई वेक्टर कॉन्फ़िगरेशन और मक्का के 11 जीनोटाइप के लिए एक प्रभावी टीकाकरण विधि है। FoMV और SCMV के साथ यह काम, मक्का क्लोरोटिक मोटल वायरस (MCMV) या MSV के साथ इंजेक्शन का उपयोग करने वाले पिछले कार्यों के साथ जोड़ा गया है, यह इंगित करता है कि agroinjection आरएनए और डीएनए वायरस दोनों के संक्रामक क्लोन के साथ मक्का रोपाई को टीका लगाने के लिए उपयुक्त है19,20,21,22। इसके अतिरिक्त, यह काम आगे दिखाता है कि एग्रोइंजेक्शन VIGS और VOX वैक्टर के लिए एक व्यवहार्य विधि है और इसे चार दिनों के रूप में युवा पौधों पर लागू किया जा सकता है (तालिका 3)। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल को मक्का जीवविज्ञानियों द्वारा आसानी से अनुकूलित किए जाने की उम्मीद है ताकि कार्यात्मक जीनोमिक्स अध्ययनों में अनुसंधान की सुविधा के लिए क्षणिक जीन साइलेंसिंग (वीआईजीएस) और ओवरएक्सप्रेशन (VOX) शामिल हो। Agroinjection में वायरस-आधारित जीन संपादन दृष्टिकोण (VEdGE) को सुविधाजनक बनाने की क्षमता भी है जो अन्यथा पौधे के परिवर्तन पर निर्भरता से सीमित होगी, संभावित रूप से संपादन दक्षता के साथ-साथ पहुंच में सुधार 58,59,60। उचित एग्रोबैक्टीरियम तनाव को देखते हुए, मक्का जीनोटाइप, और वायरल वैक्टर को सोच-समझकर जोड़ा जाता है, एग्रोइंजेक्शन द्वारा टीकाकरण मक्का में क्षणिक जीन फ़ंक्शन विश्लेषण के लिए एक मूल्यवान उपकरण बनने की उम्मीद है।

कई पौधों के वायरस के संक्रामक क्लोन को वायरस-प्रेरित जीन साइलेंसिंग (VIGS), जीन ओवरएक्सप्रेशन (VOX), और हाल ही में, वायरस-सक्षम जीन संपादन (VEdGE)1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 के लिए इंजीनियर किया गया है . जैसा कि नए वायरल निर्माण विकसित किए जाते हैं, इन संशोधित वायरस के साथ पौधे के ऊतकों को सफलतापूर्वक संक्रमित करने के तरीकों पर भी विचार किया जाना चाहिए। पौधों में वायरस संक्रमण शुरू करने के वर्तमान तरीकों में कण बमबारी, इन विट्रो आरएनए टेपों या डीएनए क्लोनों का रगड़-टीका, संवहनी पंचर इनोक्यूलेशन, या एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमफेसिएन्स इनोक्यूलेशन (एग्रोइनोकुलेशन) 5,12,13,14,15,16,17 शामिल हैं . इन टीकाकरण विधियों में से प्रत्येक के अंतर्निहित फायदे और नुकसान हैं, जिनमें लागत, विशेष उपकरणों की आवश्यकता और किसी दिए गए पौधे-वायरस प्रणाली के भीतर व्यवहार्यता शामिल है। पुनः संयोजक वायरस को वितरित करने के लिए डिज़ाइन किए गए बाइनरी टी-डीएनए निर्माणों वाले एग्रोबैक्टीरियम उपभेदों की घुसपैठ या इंजेक्शन का उपयोग करने वाले तरीकों को प्राथमिकता दी जाती है, क्योंकि वे सरल और सस्ती हैं। हालांकि, ज़ीया मेस (मक्का) जैसे मोनोकोटिलेडोनस प्रजातियों के लिए विस्तृत कृषि-इनोकुलेशन विधियों की कमी है।
वायरस वितरण के लिए एग्रोइनोकुलेशन की पहली रिपोर्टों में से एक 1986 में प्रकाशित हुई थी, जब फूलगोभी मोज़ेक वायरस (सीएएमवी) के जीनोम को टी-डीएनए निर्माण में डाला गया था, और इस निर्माण को ले जाने वाले परिणामी एग्रोबैक्टीरियम को शलजम संयंत्रों पर रगड़ दिया गया था। कृषि-इनोकुलेशन के लिए अतिरिक्त तरीके तब से विकसित किए गए हैं। उदाहरण के लिए, फॉक्सटेल मोज़ेक वायरस (FoMV) के मामले में, Nicotiana benthamiana का उपयोग पत्तियों में वायरस कणों को उत्पन्न करने के लिए एक मध्यवर्ती मेजबान के रूप में किया जा सकता है जो एक इनोकुलम स्रोत 6 प्रदान करते हैं। संक्रमित एन बेंथामियाना पत्तियों का उपयोग करके मक्का का रगड़ टीका कुशल, तेज और सरल है, लेकिन एक मध्यवर्ती मेजबान का उपयोग सभी मक्का-संक्रमित वायरस के लिए काम नहीं करता है। उदाहरण के लिए, गन्ना मोज़ेक वायरस (एससीएमवी) एन बेंथामियाना को संक्रमित नहीं कर सकता है, इस वायरस से व्युत्पन्न वैक्टर के लिए वैकल्पिक इनोकुलम स्रोतों के उपयोग की आवश्यकता होती है। 1988 में, एग्रोबैक्टीरियम जिसमें मक्का लकीर वायरस (एमएसवी), एक डीएनए वायरस है, को इंजेक्शन (एग्रोइंजेक्शन) द्वारा मक्का के अंकुरों में पेश किया गया था, एग्रोबैक्टीरियम-आधारित टीकाकरण विधियों का प्रदर्शन भी मोनोकॉट्स 19 के लिए उपयोगी है। Agroinjection के साथ इस प्रारंभिक सफलता के बावजूद, मक्का में इस तकनीक का उपयोग करने वाले कुछ अध्ययन प्रकाशित किए गए हैं, जिससे आरएनए वायरस और VIGS, VOX, और VEdGE वैक्टर 20,21,22 के लिए इस विधि की प्रयोज्यता के बारे में खुले प्रश्न छोड़ दिए गए हैं। हालांकि, मोनोकोट प्रजातियों में कृषि इंजेक्शन का व्यापक उपयोग आशाजनक है, क्योंकि इस सामान्य दृष्टिकोण का उपयोग आर्किड, चावल और गेहूं 23,24,25,26,27,28 में किया गया है।
इस प्रोटोकॉल को FoMV और Agrobacterium स्ट्रेन GV3101 के लिए अनुकूलित किया गया था और इसे एक SCMV वेक्टर पर भी लागू किया गया है। FoMV एक विस्तृत मेजबान रेंज के साथ एक potexvirus है जिसमें 56 मोनोकोट और डिकोट प्रजातियां शामिल हैं29। FoMV में 6.2 किलोबेस (केबी) सकारात्मक भावना, एकल-फंसे हुए आरएनए जीनोम है जो पांच खुले रीडिंग फ्रेम (ओआरएफ) 30,31,32,33,34,35 से पांच अलग-अलग प्रोटीनों को एन्कोड करता है। FoMV को पहले एक टी-डीएनए प्लास्मिड बैकबोन 6,36,37 पर एक संक्रामक क्लोन को शामिल करके मक्का के लिए एक VIGS और VOX वेक्टर दोनों में विकसित किया गया था। वायरल जीनोम को एक क्लोनिंग साइट (MCS1*) को कोट प्रोटीन (CP) (चित्रा 1A) 36 के तुरंत डाउनस्ट्रीम में जोड़कर VIGS अनुप्रयोगों के लिए संशोधित किया गया था। VOX और VEdGE अनुप्रयोगों के लिए, CP प्रमोटर को डुप्लिकेट किया गया था और ORF 4 और CP (चित्रा 1B)6 के बीच ब्याज के अनुक्रमों के सम्मिलन को सक्षम करने के लिए एक दूसरी क्लोनिंग साइट (MCS2) को जोड़ा गया था। FoMV वेक्टर जिसमें MCS1 और MCS2 दोनों शामिल नहीं हैं, FoMV खाली वेक्टर (FoMV-EV) (चित्रा 1) है।
SCMV एक असंबंधित वायरस है जिसे मक्का 38 में VOX के लिए विकसित किया गया है। यह Potyviridae परिवार का एक सदस्य है, जिसमें से कई सदस्यों को planta39,40,41,42,43,44 में विदेशी प्रोटीन व्यक्त करने के लिए इंजीनियर किया गया है। एससीएमवी की मेजबान सीमा में मक्का, ज्वार और गन्ना 45,46 शामिल हैं, जो इन प्रमुख फसल पौधों में जीन कार्यात्मक अध्ययन के लिए मूल्यवान बनाता है36,38। एससीएमवी में एक सकारात्मक भावना है, लंबाई में लगभग 10 केबी का एकल-फंसे हुए आरएनए जीनोम 47,48। SCMV VOX वेक्टर बनाने के लिए, अच्छी तरह से स्थापित P1 / HCPro जंक्शन का उपयोग हेटरोलॉगस अनुक्रम38 के लिए एक सम्मिलन साइट के रूप में किया गया था। इस क्लोनिंग साइट के बाद एक एनआईए-प्रो प्रोटीज क्लीवेज साइट को एन्कोडिंग करने का अनुक्रम किया जाता है, जिससे एससीएमवी पॉलीप्रोटीन (चित्रा 1 सी) से स्वतंत्र प्रोटीन का उत्पादन होता है।
इन पुनः संयोजक वायरस के संक्रामक cDNA ले जाने वाले टी-डीएनए प्लास्मिड को एग्रोबैक्टीरियम स्ट्रेन जीवी 3101 में बदल दिया गया है। जीवी 3101 एक नोपालिन प्रकार का तनाव है, जो टी-डीएनए को मोनोकोटिलेडोनस प्रजातियों में स्थानांतरित करने में सक्षम होने के लिए अच्छी तरह से जाना जाता है, जिसमें मक्का 26,28,49 शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, पिछले कृषि इंजेक्शन अध्ययनों ने उपभेदों C58 या इसके व्युत्पन्न GV3101, साथ ही साथ 19,20,22,27 का उपयोग किया है।
इस प्रोटोकॉल के विकास में तीन मार्कर जीन का उपयोग किया गया था: दो जीन मौन के लिए और एक जीन अभिव्यक्ति के लिए। मक्का जीन घाव से एक 329 बेस-पेयर (बीपी) टुकड़ा 22 (les22, GRMZM2G044074) का उपयोग मौन वेक्टर FoMV-LES22 के निर्माण के लिए किया गया था। जब les22 मक्का में चुप हो जाता है, तो नेक्रोटिक कोशिकाओं के छोटे, गोल पैच पत्तियों के वास्कुलचर के साथ दिखाई देते हैं जो नेक्रोटिक पत्ती ऊतक 50 के बड़े क्षेत्रों में फैलते हैं और इकट्ठा होते हैं। FoMV-PDS, ज्वार जीन phytoene desaturase (PDS, LOC110436156, मक्का pds, GRMZM2G410515 के लिए 96% अनुक्रम पहचान) से एक 313 बीपी टुकड़ा युक्त, मक्का में पीडीएस के मौन को प्रेरित करता है, जिसके परिणामस्वरूप पत्तियों के वास्कुलचर के साथ फोटोब्लीच्ड कोशिकाओं की छोटी लकीरें होती हैं जो समय 51 के साथ लंबी होती हैं। ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) के लिए बरकरार कोडिंग अनुक्रम का उपयोग FoMV (FoMV-GFP) और SCMV (SCMV-GFP) दोनों के लिए प्रोटीन अभिव्यक्ति का प्रदर्शन करने के लिए किया गया था। पत्तियों में जीएफपी अभिव्यक्ति आमतौर पर 14 दिनों के बाद इनोक्यूलेशन (डीपीआई) 6 पर सबसे अधिक पता लगाने योग्य होती है। यद्यपि मक्का में वायरल वैक्टर के एग्रोइंजेक्शन का उपयोग करने वाले पिछले अध्ययन किए गए हैं, इन प्रयोगों से केवल यह पता चला है कि एग्रोइंजेक्शन मक्का के रोपाई में एक संक्रामक क्लोन से वायरल संक्रमण की सुविधा प्रदान कर सकता है और VIGS या VOX अनुप्रयोगों के लिए डिज़ाइन किए गए पुनः संयोजक वायरस तक विस्तार नहीं करता है19,20,21,22। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल पिछले कृषि इंजेक्शन विधियों, विशेष रूप से Grismley et al.19 पर बनाता है। कुल मिलाकर, यह कृषि इंजेक्शन विधि VIGS और VOX वैक्टर के साथ संगत है, इनोकुलम स्रोतों के रूप में विशेष उपकरण या वैकल्पिक मेजबानों की आवश्यकता नहीं होती है, और अन्य सामान्य तरीकों के सापेक्ष इनोक्यूलेशन स्थापित करने और प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक समग्र समय और लागत को कम कर देता है जिन्हें बायोलिस्टिक्स या इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन की आवश्यकता होती है। यह प्रोटोकॉल VIGS, VOX, और VEdGE से जुड़े अनुप्रयोगों के साथ मक्का में कार्यात्मक जीनोमिक्स अध्ययन की सुविधा प्रदान करेगा।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955450</td>
			<td>alternatively, BD 309659</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Corning Science</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1kb+ Ladder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10787018</td>
			<td>For assessing sizes of PCR products</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G x 5/8&#34; PrecisionGlide Needles</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28&#176;C Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Agrobacterium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For E. coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D134406</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A4800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>E-3120</td>
			<td>For making gels to check for virus/insert stability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrobacterium tumefaciens Strain GV3101</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Carries vir plasmid encoding T-DNA transfer machinery, RifR, GmR, from lab stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bsu36I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K1672</td>
			<td>Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit with Dnase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C298</td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5alpha Competent E. coli Cells</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Ligase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K1422</td>
			<td>Rapid DNA Ligation Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenediamine Tetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Peters Fertilizer 15-15-15 Concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat Inserts</td>
			<td>T.O. Plastics</td>
			<td>715357C</td>
			<td>For germinating seeds in trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flats</td>
			<td>T.O. Plastics</td>
			<td>710245C</td>
			<td>For germinating seeds in trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorCam</td>
			<td>Photon Systems Instruments</td>
			<td></td>
			<td>To assess maize plants for GFP expression before microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Electrophoresis Box</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A38</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-500</td>
			<td>For saving frozen stocks of bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Go-Taq, 2X</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144</td>
			<td>for pHing solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>109827</td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin, Monosulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Pots</td>
			<td>Kordlok</td>
			<td>SQL0550</td>
			<td>5x5x4&#34; or bigger.&#160; For transplanting seedlings.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani (LB) Broth, Miller</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>M1245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maize Golden Bantam Sweet Corn Seed</td>
			<td>American Meadows, West Coast Seeds</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maize Inbred Seed</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Our seed comes from our institution, but we are not able to provide this for other researchers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxima H Minus Reverse Transcriptase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EP0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ</td>
			<td>Elga</td>
			<td></td>
			<td>Purelab Ultra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch PCR &#38; DNA Cleanup Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peters Excel 15-5-15 Fertilizer</td>
			<td>ICL Specialty Fertilizers</td>
			<td>G99140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, 95 mm x 15 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875714G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P171</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Our primers were synthesized through our institutional DNA facility or through IDT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PspOMI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>557303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase A</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12091021</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SbfI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For weighing chemicals for media or buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil Substrate</td>
			<td>SunGro Horticulture</td>
			<td>SS#1-F1P</td>
			<td>Sunshine Mix #1/Fafard-1P, any soil mix that maize grows well in is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For measuring OD600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sybr Safe, 10,000X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S33102</td>
			<td>For making gels to check for virus/insert stability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP154</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>15596018</td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh Paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For weighing chemicals for media or buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XbaI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0145</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct agroinoculation of maize seedlings by injection with recombinant foxtail mosaic virus and sugarcane mosaic virus infectious clones

एग्रोबैक्टीरियम-आधारित इनोक्यूलेशन दृष्टिकोण का व्यापक रूप से पौधे के ऊतकों में वायरल वैक्टर पेश करने के लिए उपयोग किया जाता है। इस अध्ययन में एक वायरल वेक्टर ले जाने वाले एग्रोबैक्टीरियम के साथ मेरिस्टेमेटिक ऊतक के पास मक्का के अंकुरों के इंजेक्शन के लिए एक प्रोटोकॉल का विवरण दिया गया है। जीन मौन और जीन अभिव्यक्ति के लिए इंजीनियर पुनः संयोजक फॉक्सटेल मोज़ेक वायरस (FoMV) क्लोन का उपयोग इस विधि को अनुकूलित करने के लिए किया गया था, और जीन अभिव्यक्ति के लिए इंजीनियर एक पुनः संयोजक गन्ना मोज़ेक वायरस (SCMV) को शामिल करने के लिए इसके उपयोग का विस्तार किया गया था। जीन के टुकड़े या ब्याज के कोडिंग अनुक्रमों को एक संशोधित, संक्रामक वायरल जीनोम में डाला जाता है जिसे बाइनरी टी-डीएनए प्लास्मिड वेक्टर pCAMBIA1380 में क्लोन किया गया है। परिणामस्वरूप प्लास्मिड निर्माणों Agrobacterium tumefaciens तनाव GV3101 में परिवर्तित कर रहे हैं. 4 दिन पुराने के रूप में युवा के रूप में मक्का रोपाई MgSO4 समाधान में resuspended बैक्टीरिया के साथ coleoptilar नोड के पास इंजेक्ट किया जा सकता है। एग्रोबैक्टीरियम के साथ संक्रमण के दौरान, वायरल जीनोम को ले जाने वाले टी-डीएनए को मक्का की कोशिकाओं में स्थानांतरित कर दिया जाता है, जिससे वायरल आरएनए जीनोम के प्रतिलेखन की अनुमति मिलती है। जैसा कि पुनः संयोजक वायरस प्रतिकृति और व्यवस्थित रूप से पूरे पौधे में फैलता है, वायरल लक्षण और फेनोटाइपिक परिवर्तन लक्ष्य जीन घाव की नकल 22 (les22) या phytoene desaturase (पीडीएस) के मौन के परिणामस्वरूप पत्तियों पर देखा जा सकता है, या हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) की अभिव्यक्ति यूवी प्रकाश या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ रोशनी पर पता लगाया जा सकता है। वायरस का पता लगाने और एक साथ सम्मिलित करने की अखंडता का आकलन करने के लिए, आरएनए को इंजेक्ट किए गए पौधे की पत्तियों से निकाला जाता है और आरटी-पीसीआर को कई क्लोनिंग साइट (एमसीएस) को सम्मिलित अनुक्रम को ले जाने वाले प्राइमरों का उपयोग करके आयोजित किया जाता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग कई मक्का जीनोटाइप में प्रभावी ढंग से किया गया है और आसानी से अन्य वायरल वैक्टरों में विस्तारित किया जा सकता है, जिससे मक्का में वायरल वेक्टर परिचय के लिए एक सुलभ उपकरण की पेशकश की जा सकती है।

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Direct Agroinoculation of Maize Seedlings by Injection with Recombinant Foxtail Mosaic Virus and Sugarcane Mosaic Virus Infectious Clones

एक Agrobacterium आधारित इंजेक्शन (agroinjection) प्रोटोकॉल foxtail मोज़ेक वायरस और गन्ना मोज़ेक virusclones मक्का रोपाई में टीका लगाने के लिए प्रस्तुत किया जाता है। इस तरह से टीकाकरण वायरल संक्रमण, मार्कर जीन के वायरस-प्रेरित जीन मौन, और जीएफपी के वायरल ओवरएक्सप्रेशन की ओर जाता है।

पुनः संयोजक Foxtail मोज़ेक वायरस और गन्ना मोज़ेक वायरस संक्रामक क्लोन के साथ इंजेक्शन द्वारा मक्का रोपाई के प्रत्यक्ष Agroinoculation

Agrobacterium-based inoculation approaches are widely used for introducing viral vectors into plant tissues. This study details a protocol for the ...

यह प्रोटोकॉल सीधे मक्का के पौधों में वायरल वैक्टर के टीकाकरण की अनुमति देता है जिसे किसी भी महंगे विशेष उपकरण की आवश्यकता के बिना अधिकांश प्रयोगशाला सेटिंग्स में आसानी से लागू किया जा सकता है। प्रत्यक्ष टीकाकरण एक इनोकुलम स्रोत के रूप में एक वैकल्पिक मेजबान के उपयोग को समाप्त करता है, जिससे समय और संसाधन दोनों की बचत होती है। इस विधि को अतिरिक्त वायरल वैक्टर, मक्का लाइनों और संभावित रूप से अन्य मोनोकोट प्रजातियों पर लागू किया जा सकता है।ट्रे के अंदर रखे गए छोटे आवेषण में पीट-आधारित बढ़ते माध्यम में 1 से 2 मक्का के बीज रोपण से शुरू करें। ट्रे को 16 घंटे के तहत एक विकास कक्ष में 25 डिग्री सेल्सियस पर और 8 घंटे की रातों को 22 से 25 डिग्री सेल्सियस पर, या ग्रीनहाउस में 22 से 25 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के दिनों और 8 घंटे की रातों के साथ रखें। नियमित रूप से पौधों को पानी दें और सप्ताह में एक बार 15-5-15 तरल उर्वरक के साथ 330 भागों प्रति मिलियन एकाग्रता पर निषेचित करें।एंटीबायोटिक दवाओं के साथ एलबी मीडिया में वांछित वायरल निर्माण युक्त agrobacterium तनाव को टीका लगाने के द्वारा इंजेक्शन के लिए agrobacterium तैयार करें। फिर, फ्लास्क या ट्यूबों को 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, जबकि 24 घंटे के लिए 225 आरपीएम पर हिलाते हुए। अगले दिन, कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 4, 000 बार जी पर सेंट्रिफिकेशन द्वारा बैक्टीरिया को गोली मारें और supernatant को त्याग दें।फिर, विआयनीकृत पानी के एक मिलीलीटर के साथ गोली को धोएं। 10 मिलीमोलर मैग्नीशियम सल्फेट समाधान के एक मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें, और 600 नैनोमीटर पर ऑप्टिकल घनत्व को मापें। फिर इसे 1.0 पर समायोजित करें।एग्रोबैक्टीरियम को इंजेक्ट करने के लिए 4 से 7 दिन पुरानी मक्का की रोपाई का उपयोग करें। सिरिंज और सुई इकट्ठा करें। धीरे से बैक्टीरियल निलंबन को कोलियोप्टिलर नोड के ऊपर 2-3 मिलीमीटर इंजेक्ट करें जब तक कि यह कोलियोप्टाइल को भर नहीं देता है, या पौधों के विकास चरण पर लंबित, whorl में दिखाई देता है।सभी रोपाई इंजेक्ट करें और प्रत्येक निर्माण को इंजेक्ट करने के लिए सिरिंज और सुइयों को बदलें। नियंत्रण जीन को शांत करने से घावों को देखकर फेनोटाइपिक संक्रमण की पुष्टि करें, घाव की नकल 22 या पत्तियों पर फाइटोएन डिसेचुरेस। जीएफपी अभिव्यक्ति की उपस्थिति का पता लगाने के लिए पौधों और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी की त्वरित स्क्रीनिंग के लिए एक प्रतिदीप्ति इमेजिंग डिवाइस का उपयोग करें।संक्रमण के आणविक पता लगाने के लिए जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण करें। संक्रमण के 14 से 21 दिनों के बाद संक्रमित पौधों की पत्तियों से कुल आरएनए निकालें, और पाठ पांडुलिपि में वर्णित पहले स्ट्रैंड सीडीएनए को संश्लेषित करें। संक्रमण की पुष्टि करने के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज पीसीआर करें और विभिन्न वायरल निर्माणों के लिए डिज़ाइन किए गए विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग करके जीन की अखंडता या जीन के जीन टुकड़े को निर्धारित करें।वायरस और जीन या जीन टुकड़े की उपस्थिति या अनुपस्थिति को निर्धारित करने के लिए एक न्यूक्लिक एसिड दाग युक्त 1% agarose जेल पर पीसीआर उत्पाद की कल्पना करें। इस प्रोटोकॉल का उपयोग मक्का के अंकुरों में जीन के लिए इंजीनियर पुनः संयोजक वायरस डालने के लिए किया गया था। इंजेक्शन के लगभग 12 दिनों के बाद, परिगलन और एक फोटोब्लीचिंग के रूप में पत्तियों पर मौन फेनोटाइप देखे गए थे।संक्रमण के बाद पत्तियों में निर्माण की उपस्थिति एक अलग जीएफपी फिल्टर का उपयोग करके एक प्रतिदीप्ति के तहत हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति को देखकर पता लगाया गया था। फॉक्सटेल मोज़ेक वायरस संक्रमित पत्तियों में हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति को पत्तियों में वितरित प्रतिदीप्ति के छोटे पंक्टेट क्षेत्रों के रूप में और गन्ने के मोज़ेक वायरस संक्रमित पत्तियों में बड़े पैच के रूप में देखा गया था। जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण का उपयोग करते हुए, प्रणालीगत फॉक्सटेल मोज़ेक वायरस संक्रमण की पुष्टि की गई थी और जीन मौन या फाइटोएन डेसैटुरेज और घाव की नकल 22 का दमन देखा गया था।निर्माण ने प्रभावित संक्रमण दक्षता का भी उपयोग किया। फॉक्सटेल मोज़ेक वायरस संक्रमण के मामले में, फॉक्सटेल मोज़ेक वायरस खाली वेक्टर, और फॉक्सटेल मोज़ेक वायरस घाव की नकल 22 में आमतौर पर क्रमशः 53% और 54% पर उच्चतम संक्रमण क्षमता थी। फॉक्सटेल मोज़ेक वायरस फाइटोएन डेसैटुरेज 39% पर थोड़ी कम दक्षता पर और फॉक्सटेल मोज़ेक वायरस ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन, 16% पर सबसे कम दक्षता पर इस बीच, गन्ना मोज़ेक वायरस ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन की संक्रमण दक्षता 8% समय थी और लक्षण वायरल वेक्टर और मक्का लाइन पर आधारित होंगे।एक दृश्य फेनोटाइप की कमी का मतलब मौन या अभिव्यक्ति की कमी नहीं हो सकती है। इस विधि को गाइड आरएनए के लिए वितरण विधियों में सुधार करके जीन संपादन प्रौद्योगिकियों पर भी लागू किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Biology

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

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चेचक वायरस के संक्रमण और वायरस जीन एक्सप्रेशन के टेम्पोरल विश्लेषण: भाग 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

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Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

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A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

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इसके साथ ही वायरस विशिष्ट CD8 + टी कोशिकाओं और वायरस से संक्रमित कोशिकाओं कल्पना के लिए एक तकनीक स्वस्थानी में</em

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences

मोज़ेक बढ़ाने दृश्यों का मूल्यांकन के लिए Zebrafish Transgenesis

The completion of the human genome sequence, along with that of many other species, has highlighted the challenge of ascribing specific function to non ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

इंजेक्शन और electroporation द्वारा Zebrafish Otocyst में MIF Morpholinos के प्रत्यक्ष डिलिवरी भीतरी कान विकास को प्रभावित करता है

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

रासायनिक अवरुद्ध जटिल नमूने में मल्टिप्लेक्स उच्च throughput विशिष्ट प्रोटीन ग्लाइकोसिलेशन की रूपरेखा के लिए एंटीबॉडी माइक्रोएरे

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

EMBL में MultiBac प्रोटीन परिसर उत्पादन प्लेटफार्म

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

मोजाइक सेक्स का लाइव इमेजिंग के लिए टमाटर / GFP-FLP / FRT विधि<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination

अभिव्यक्ति और टीकाकरण के लिए वायरस कणों की तरह की शुद्धि

Virus-like particles (VLPs) and subviral particles (SVPs) are an alternative approach to viral vaccine design that offers the advantages of increased ...