Name: direct agroinoculation of maize seedlings by injection with recombinant foxtail mosaic virus and sugarcane mosaic virus infectious clones
Uploaded: 2021-02-27T14:30:00
Duration: 5 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Agroinoculation of Maize Seedlings by Injection with Recombinant Foxtail Mosaic Virus and Sugarcane Mosaic Virus Infectious Clones at JoVE.com

A Universidade Estadual de Iowa faz parte de uma equipe que apoia o programa Desetos Aliados de Insetos da DARPA HR0011-17-2-0053. Este trabalho também foi apoiado pelo Iowa State University Plant Sciences Institute, Iowa State University Crop Bioengineering Center, USDA NIFA Hatch project number 3808, e State of Iowa Funds. K.L.H. também foi parcialmente apoiado pelo programa de pós-graduação de phenomics da Universidade Estadual de Iowa financiado pela National Science Foundation (DGE #1545453) e pela Agricultural and Food Research Initiative no 2019-07318 do Instituto Nacional de Alimentos e Agricultura do USDA. Os financiadores não tiveram papel na concepção do estudo e coleta, análise e interpretação dos dados e na redação do manuscrito. Quaisquer opiniões, achados e conclusões ou recomendações expressas neste material são dos autores e não refletem necessariamente as opiniões dos financiadores.
Agradecemos a Nick Lauter (USDA-ARS, Ames, IA) pela semente de linhas de milho, Christian F. Montes-Serey (Iowa State University) por fazer o clone FoMV-GFP, e Tyler Austin (Iowa State University) para assistência técnica.

1. Construção plasmid
NOTA: Este protocolo pode ser aplicado a outros vetores virais ou cepas de Agrobacterium , mas isso pode afetar o sucesso geral da inoculação por agroinjeção. Sempre realize etapas de inoculação bacteriana e revestimento em uma coifa de fluxo laminar.
<ol><li>FoMV silenciando construção NOTA: A mídia Luria-Bertani (LB) (Miller) é usada para todos os meios de comunicação, a menos que seja especificado de outra forma. O LÍQUIDO LB é feito suspendendo 25 g de grânulos em 1.000 mL de água destilada e autoclaving por 15 min a 121 °C. A mídia LB sólida é igualmente feita com a adição de 1,5% de ágar antes da autoclavagem. Os antibióticos são adicionados depois que a LB é resfriada a ~60 °C, e a solução é derramada em placas de Petri de 95 x 15 mm. As concentrações de antibióticos a serem utilizados são as seguintes: rifampicina (rif) a 25 μg/mL, gentamicina (gent) a 50 μg/mL e kanamycin (kan) a 50 μg/mL.<ol><li>PCR amplifica fragmentos do gene do milho a serem silenciados (por exemplo, les22 ou pds) usando um primer avançado com um site de restrição PacI e um primer reverso com um site de restrição XbaI. Isso permitirá a ligadura dos fragmentos genéticos no MCS1* do vetor binário FoMV-pCAMBIA1380 na orientação antissamparada. NOTA: Configure o PCR usando um polimerase de DNA de alta fidelidade, primers dianteiros e reversos a 10 μM cada, modelo de DNA plasmid e água, seguindo as especificações de polimerase de DNA. Amplie por 35 ciclos, usando uma temperatura de ressarificação de acordo com a polimerase de DNA e a temperatura de fusão do primer (Tm), e uma extensão de 30 s por quilobase a ser amplificada.</li>
		<li>Realize a purificação do PCR usando um kit de purificação pcr de acordo com as especificações do kit.</li>
		<li>Digerir o produto PCR purificado e o FoMV-EV com as enzimas de restrição XbaI e PacI. Use 1 μg de plasmídeo ou todo o produto PCR purificado, 2 μL de tampão de 10x, 1 μL de enzima de restrição e adicione água para fazer um volume final de reação de 20 μL. Incubar de acordo com a especificação enzimápica.</li>
		<li>Ligate o produto PCR digerido e FoMV-EV juntamente com liga ligase de DNA T4 de acordo com o protocolo do fabricante.</li>
		<li>Transforme o plasmídeo ligado em células E. coli quimicamente competentes usando o método de choque térmico.<ol>
<li>Descongele as células no gelo e adicione 3 μL de plasmid ao tubo. Incubar no gelo por 30 minutos, depois choque térmico para 30 s a 42 °C.</li>
			<li>Coloque no gelo por 5 min, adicione 200 μL de caldo super ótimo com repressão catabólica (SOC) e permita que as células E. coli se recuperem em mídia SOC por 1 h a 37 °C com agitação a 225 rpm.</li>
			<li>Placa na mídia lb seletiva de kanamicina e incubar a 37 °C durante a noite.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Verifique as colônias quanto a clones precisos por sequenciamento Sanger usando os primers FM-5840F e FM-6138R (Tabela Suplementar 1). Envie 250 ng de DNA plasmídeo para uma instalação que realizará sequenciamento Sanger. Para este experimento, amostras foram enviadas para o Centro de DNA da Universidade Estadual de Iowa.</li>
		<li>Inocular 2 mL de LÍQUIDO LB com a colônia escolhida e incubar a 37 °C durante a noite com agitação a 225 rpm. Extrair DNA plasmídeo da cultura da noite para o dia através de uma preparação de DNA plasmídeo alcalino lysmid 52.</li>
		<li>Transforme o DNA plasmídeo em células de cepa de agrobacterium GV3101 usando o método degelo congelante. Permita que 100 μL de células quimicamente competentes descongelem no gelo, adicionem 1-5 μL de plasmídeo e incubam no gelo por 30 minutos. Coloque em nitrogênio líquido por 1 min e incubar a 37 °C por 3 min. Adicione 1 mL de SOC, deixe se recuperar por 2-3 h a 28 °C com agitação, placa em rif, gent e kan selective LB media e incubar a 28 °C por 2 dias.</li>
		<li>Colônias de tela para a presença de inserção com a colônia PCR. Escolha uma única colônia bacteriana e misture-a em 30 μL de água. Configure uma reação pcr adicionando 12,5 μL de mistura mestre de polimerase, 1,25 μL de cada primer de 10 μM, FM-5840F e FM-6138R, 3 μL da suspensão da colônia bacteriana e água para um volume final de 25 μL. Ciclo 35 vezes com uma temperatura de renasamento de 64 °C e um tempo de extensão de 1 min (1 min para cada kb amplificado).</li>
		<li>Inocular 2-5 mL de LÍQUIDO LB (rif, gent, kan) com a colônia de Agrobacterium correta. Deixe crescer durante a noite a 28 °C com tremor a 225 rpm.</li>
		<li>Misture a cultura da noite para o dia com uma solução de 50% de glicerol 1:1. Armazene a -80 °C para armazenamento a longo prazo.</li>
	</ol></li>
	<li>Construção de expressão FoMV<ol>
<li>O PCR amplifica a sequência de codificação de interesse, incluindo códons de início e parada (por exemplo, GFP) conforme descrito no 1.1.1, adicionando um site de restrição Bsu36I no primer dianteiro e um site de restrição PspOMI no primer reverso para permitir a clonagem direcional na orientação de sentido no MCS2.</li>
		<li>Realize a purificação do PCR usando um kit de purificação pcr de acordo com as especificações do kit.</li>
		<li>Digerir o produto PCR e o FoMV-EV com as enzimas de restrição Bsu36I e PspOMI, conforme descrito em 1.1.3.</li>
		<li>Ligate o produto PCR digerido e FoMV-EV juntamente com liga ligase de DNA T4 de acordo com o protocolo do fabricante.</li>
		<li>Transforme-se em células E. coli quimicamente competentes usando o método de choque térmico como descrito em 1.1.5. Placa na mídia lb seletiva de kanamicina e incubar a 37 °C durante a noite.</li>
		<li>Verifique as colônias para obter clones precisos por sequenciamento Sanger, conforme descrito em 1.1.6 usando os primers 5AmuS2 e 5AmuA2 (Tabela Suplementar 1).</li>
		<li>Inocular 2 mL de LÍQUIDO LB com a colônia escolhida e incubar a 37 °C durante a noite com agitação a 225 RPM. Extrair DNA plasmídeo da cultura da noite para o dia através de uma preparação de DNA plasmídeo alcalino lysmid 52.</li>
		<li>Transforme o DNA plasmídeo em células quimicamente competentes GV3101 usando o método de congelamento, conforme descrito em 1.1.8. Placa em mídia rif, gent e kan seletiva LB e incubar a 28 °C por 2 dias.</li>
		<li>Colônias de tela para a presença de inserção com a colônia PCR usando os primers 5AmuS2 e 5AmuA2.</li>
		<li>Inocular 2-5 mL líquido LB (rif, gent, kan) com a colônia de Agrobacterium correta. Agite durante a noite a 225 rpm a 28 °C.</li>
		<li>Misture a cultura da noite para o dia com uma solução de 50% de glicerol 1:1. Armazene a -80 °C para armazenamento a longo prazo.</li>
	</ol></li>
	<li>Construção de expressão SCMV<ol>
<li>O PCR amplifica o gene de interesse (por exemplo, GFP) excluindo o codon stop como descrito em 1.1.1, incluindo um local de digestão PspOMI no primer dianteiro e um local de digestão SbfI no primer reverso para permitir a clonagem direcional no vetor binário SCMV-pCAMBIA1380. NOTA: A pastilha deve ser clonada na moldura com a poliproteína viral.</li>
		<li>Realize a purificação do PCR usando um kit de purificação pcr de acordo com as especificações do kit.</li>
		<li>Digerir o produto PCR e o SCMV-EV com as enzimas de restrição PspOMI e SbfI, conforme descrito em 1.1.3.</li>
		<li>Ligate o produto PCR digerido e SCMV-EV juntamente com liga ligase de DNA T4 de acordo com o protocolo do fabricante.</li>
		<li>Transforme o produto em células E. coli quimicamente competentes usando o método de choque térmico descrito em 1.1.5. Placa na mídia kan seletiva LB e incubar a 37 °C durante a noite.</li>
		<li>Colônias de tela para clones precisos por sequenciamento Sanger como descrito em 1.1.6 usando os primers SC-745F e HCProR1 (Tabela Suplementar 1).</li>
		<li>Inocular 2 mL de LÍQUIDO LB com a colônia escolhida e incubar a 37 °C durante a noite com agitação a 225 rpm. Extrair o DNA plasmídeo da cultura da noite para o dia através de uma preparação de DNA lino lysmid plasmídeo52.</li>
		<li>Transforme o DNA plasmídeo em células quimicamente competentes GV3101 usando o método de congelamento, conforme descrito em 1.1.8. Placa em mídia rif, gent e kan seletiva LB e incubar a 28 °C por 2 dias.</li>
		<li>Colônias de tela para presença de inserção com pcr colônia com os primers SC-745F e HCProR1 como descrito em 1.1.9.</li>
		<li>Inocular 2-5 mL de LÍQUIDO LB (rif, gent, kan) com a colônia de Agrobacterium correta. Agite durante a noite a 225 rpm a 28 °C.</li>
		<li>Misture a cultura da noite para o dia com uma solução de 50% de glicerol 1:1. Armazene a -80 °C para armazenamento a longo prazo.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparação de mudas
<ol><li>Plante 1-2 sementes de milho (milho doce 'Golden Bantam', FR1064, B73, etc.) em meio de cultivo à base de turfa em pequenas pastilhas colocadas dentro de bandejas 4-7 dias antes da injeção. Coloque em uma câmara de crescimento abaixo de 16 h dias a 25 °C e 8h noturnas a 22 °C (~185 radiação fotossintética (PAR)) ou em uma estufa abaixo de 16 h dias a 22-25 °C e 8h noites a 22-25 °C (350-400 PAR). NOTA: A suscetibilidade ao Agrobacterium varia entre os genótipos de milho, afetando as taxas de sucesso. Além disso, alguns vetores virais podem ser incompatíveis com certos genótipos de milho.</li>
	<li>Água regularmente e fertilizar uma vez por semana com 15-5-15 fertilizantes líquidos a 330 partes por milhão (PPM).</li>
</ol>3. Preparação de Agrobacterium
<ol><li>Um dia antes da injeção, prepare a mídia líquida LB com o antibiótico apropriado (rif, gent, kan) e inoculada com a cepa Agrobacterium carregando a construção viral desejada. Recomenda-se adicionar 20 μL de estoque de glicerol em 50 mL de LB, o que deve produzir cultura bacteriana suficiente para inocular >100 plantas e pode ser dimensionado para cima ou para baixo conforme necessário. NOTA: Prepare o inóculo suficiente para ter uma quantidade final de suspensão bacteriana de pelo menos 1 mL a uma densidade óptica de 600 nm (OD600) de 1,0 para cada 4-5 plantas.</li>
	<li>Agite a 225 rpm a 28 °C por 24 h.</li>
	<li>Bactérias de pelotas por 10 min a 4.000 x g em temperatura ambiente. Descarte o supernatante.</li>
	<li>Lave bem a pelota com 1 mL de água desionizada (DI) por tubulação ou vórtice suave.</li>
	<li>Repita o passo 3.3 para a bactéria pellet.</li>
	<li>Resuspenda a pelota em 1 mL de solução MgSO4 de 10 mM por pipetação ou vórtice suave.<ol>
<li>Opcionalmente, adicione acetossyringone de 200 μM à solução. Embora comumente utilizado, acetosyringone só aumenta a capacidade de transformação de algumas cepas de Agrobacterium . Os autores não constataram que a adição de acetosiingona afeta a eficiência neste protocolo (Tabela Suplementar 2). NOTA: A solução MgSO4 de 10 mM pode ser feita a partir de uma solução de estoque de 1 M com um pH de 6,3 armazenados à temperatura ambiente. A solução provavelmente não exigirá ajuste de pH.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Meça OD600 da amostra com um espectrofotômetro e dilua para 1,0 OD600 com solução mgso4 de 10 mM. NOTA: Este é um ponto de parada seguro. A suspensão bacteriana pode ser mantida em temperatura ambiente por até 5 h antes da injeção.</li>
</ol>4. Injeção
NOTA: Podem ser usadas mudas de milho de 4 a 7 dias de idade para injeção. A taxa de crescimento das mudas é muito afetada pelas condições de crescimento, quantidade de PAR (ou seja, par maior em estufa do que na câmara de crescimento) e genótipo, entre outras coisas que podem ser difíceis de controlar em condições de estufa. As plantas podem ser injetadas com até 4 dias de idade quando têm 2-3 cm de altura sem folhas expandidas e tão velhas quanto 7 dias quando a folha de ponta arredondada mais baixa é expandida. A taxa de sucesso desses métodos de inoculação cai rapidamente à medida que as plantas envelhecem além de 7 dias após a semeadura. O local da injeção é o mesmo, não importa a idade das mudas.
<ol><li>Usando óculos de segurança, injete a suspensão bacteriana nas mudas 2-3 mm acima do nó coleoptilar usando uma agulha de 25G x 5/8" presa a uma seringa descartável de 1 mL. NOTA: O nó coleoptilar é onde as raízes da coroa eventualmente se formarão. Este é o nó mais baixo da planta. Normalmente, haverá uma mudança de cor de verde para branco dentro e abaixo do nó. O local da injeção é logo acima do meristem. Dissecar algumas mudas nesta fase pode ajudar a visualizar a localização do meristem e, consequentemente, o local de injeção adequado.</li>
	<li>Aplique pressão suave na seringa até que a suspensão encha o coleoptile ou seja visível na prostituta, dependendo do estágio de crescimento das plantas. Isto é aproximadamente 100-200 μL de suspensão. NOTA: Se for difícil injetar a suspensão na muda, o local da injeção pode ser muito baixo. Pressão moderada é tudo o que deve ser necessário para injetar a suspensão.</li>
	<li>Injete todas as mudas, trocando seringas e agulhas para cada construção.</li>
</ol>5. Cuidados contínuos com plantas
<ol><li>Transplante as mudas injetadas para 13 x 13 x 15 cm ou potes maiores quando tiverem 7-8 dias de idade.</li>
	<li>Manter as condições de crescimento (fotoperíodo 16h e fertilização uma vez por semana).</li>
</ol>6. Confirmação da infecção (Fenotipicamente e RT-PCR)
<ol><li>Plantas fenotipicamente pontuadas entre 14-21 DPI. Lesões provenientes do silenciamento da lesão dos genes de controle imitam 22 ou fitoene desaturase podem ser facilmente vistas nas folhas e são distintas dos sintomas do FoMV. A expressão GFP pode ser detectada através de imagens de microscópio fluorescente ou outras imagens de luz UV. NOTA: Alguns construtos/vetores virais podem demorar mais tempo para apresentar sintomas ou podem não apresentar nenhum sintoma. As altas condições de luz aumentam muito os fenótipos causados pelo silenciamento da lesão imitar 22 e desaturar fitoeno. As lesões podem ser menos visíveis ou ausentes se as plantas forem mantidas em condições de luz mais baixas, como uma câmara de crescimento, porém a taxa real de infecção determinada pelo RT-PCR não deve ser afetada (Tabela 1).</li>
	<li>Para confirmar a infecção molecularmente, a folha de amostra 6 entre 14-21 DPI e extrair RNA total usando uma extração fenol-clorofórmio de acordo com a instrução do fabricante.</li>
	<li>Usando o RNA extraído como um modelo para gerar cDNA de primeira linha.<ol>
<li>Configure a reação cDNA com até 5 μg de RNA total, 1 μL de primers hexamer aleatórios, 1 μL de oligo (dT)18 primers, 1 μL de dNTPs, 1 μL de transcriptase reversa e água para um volume final de 14,5 μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Usando primers projetados para a construção viral e o cDNA como modelo, execute PCR em cada amostra para confirmar a infecção viral e determine a integridade do gene ou fragmento genético de interesse conforme descrito em 1.1.1, exceto reduzir os ciclos para 25 para FoMV e 30 para SCMV para evitar falsos positivos.<ol>
<li>Para silenciar construções de silenciamento do FoMV, use primers FM-5840F e FM-6138R para amplificar através do MCS1*, que contém o fragmento genético de milho. Para construções de expressão FoMV, use primers 5AmuS2 e 5AmuA2 para amplificar através do MCS2, que contém o gene inserido.</li>
		<li>Para construções de expressão SCMV, utilize primers SC745-F e HCProR1 para amplificar em todo o MCS, que contém o gene inserido (Figura Suplementar 3).</li>
		<li>Para um gene de controle endógeno, use os primers ZmActS e ZmActA, que amplificam um fragmento de mRNA de ato de milho (GRMZM2G126010) ou primers ZmUbiF e ZmUbiR, que amplificam um fragmento mRNA de poliugenquitina de milho (GRMZM2G409726_T01).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Visualize o produto PCR em um gel de 1% de agarose contendo uma mancha de ácido nucleico para determinar a presença ou ausência de vírus e gene ou fragmento genético.</li>
</ol>

Os pesquisadores não têm conflitos de interesse para divulgar.

A agrobacterium é uma ferramenta essencial que facilita inúmeras técnicas de biologia molecular em pesquisas relacionadas às plantas. Este estudo fornece um protocolo de agroinjeção para inoculação de vetores virais FoMV e SCMV diretamente em tecidos de milho para aplicações VIGS e VOX. O objetivo principal é aumentar a facilidade e a utilidade das tecnologias baseadas em vírus para pesquisas em plantas de monocot. Embora a agroinoculação direta do milho tenha sido relatada para alguns vírus, os autores não estão cientes de um protocolo detalhado, e não há exemplos de aplicações VIGS e VOX nesses estudos19,22.
Foi relatado, e foi confirmado durante o desenvolvimento deste protocolo, que o local da injeção é um fator-chave para o lançamento com sucesso de uma infecção viral sistêmica através da agroinjeção19. A injeção consistente do local recomendado na planta é considerada a maior variável, pois a posição exata do meristem em mudas de milho é virtualmente indetectável pelo olho. Para minimizar a variação interpessoal, é recomendado dissecar algumas mudas de milho até o meristem para melhor visualizar sua localização (Figura 3C). A posição do meristem em relação ao nódulo coleoxtilar deve ser aproximadamente a mesma para plantas de 4 a 7 dias de idade. Além disso, praticar a injeção com um líquido tingido fornece uma demonstração facilmente visível de como o inóculo preenche a da folha, e como o local da injeção é marcado com corante, a precisão do local de injeção pode ser corroborada (Figura 3G,H). Os tecidos meristemáticos são os mais suscetíveis à agroinjeção, mas a injeção de suspensões de Agrobacterium diretamente neste tecido resulta em efeitos morfológicos indesejáveis (Figura 6)19. Plantas com meristems danificados sobrevivem, mas os defeitos resultantes são indesejáveis e, portanto, a injeção direta desse tecido deve ser evitada.
Existem várias variáveis que podem impactar o lançamento bem-sucedido de uma infecção viral sistêmica por meio da agroinjeção, pois três sistemas biológicos complexos (estirpe vegetal, vírus e Agrobacterium ) devem interagir na coordenação. Essa interação complexa pode ser auxiliada pelas células que se dividem rapidamente da região meristemática, tornando-a um local ideal para a agroinoculação19. A cepa agrobacterium deve ser capaz de infectar células dos tecidos vegetais para entregar o T-DNA carregando o genoma viral, e a planta deve ser suscetível ao vírus para iniciar a replicação viral e infecção sistêmica. Os genótipos de milho diferem em sua suscetibilidade aos vírus (por exemplo, o Mo17 é resistente às cepas de FoMV) ou Agrobacterium , mas a maioria que foi testada parece ser suscetível tanto ao FoMV quanto ao SCMV (Tabela 1 e Tabela 2)53. Por exemplo, a linha de raça FR1064 e a variedade de milho doce Golden Bantam podem ser particularmente suscetíveis tanto aos vetores GV3101 Agrobacterium quanto à base de FoMV.
O número de folhas amostrados e o tempo de amostragem para RT-PCR são fundamentais para uma avaliação precisa da infecção viral. Nos exemplos aqui apresentados, o número da folha foi determinado começando na primeira folha arredondada (comumente conhecida como "folha do polegar") e contando para cima. As folhas foram amostradas uma vez que foram expandidas e a folha seguinte começou a emergir. No entanto, as folhas são ótimas para a amostragem podem variar de acordo com as espécies de vírus utilizadas, condições de crescimento e genótipo de milho. Portanto, recomenda-se um experimento de curso de tempo inicial ao aplicar este protocolo a um novo sistema de vírus para otimizar a estratégia de amostragem em relação às folhas e ao tempo.
O construto específico utilizado afeta significativamente a eficiência deste protocolo. Por exemplo, os vetores vazios, FoMV-EV e SCMV-EV, e FoMV-PDS e FoMV-LES22, que contêm pequenas pastilhas (313 bp e 329 bp, respectivamente), normalmente produzem os maiores percentuais de plantas com sintomas virais nesses experimentos (Tabelas 1 e Tabela 2). No entanto, os vírus recombinantes que carregam inserções maiores do GFP ORF (720 bp) em FoMV-GFP e SCMV-GFP, apresentaram taxas de infecção muito menores quando comparadas às plantas injetadas com os construtos de vetor vazio ou silenciamento genético. Essa tendência pode ser devido aos impactos negativos sobre a aptidão viral causados pelo aumento de quantidades de material genético exógeno no genoma viral. Vários estudos têm demonstrado que a estabilidade da inserção de vetores virais vegetais depende em grande parte do tamanho da inserção e sequenciar 36,54,55,56,57. Além disso, houve uma diferença notável no percentual de plantas que se infectam após a inoculação com o vetor vazio FoMV ou SCMV, sugerindo que é necessário um trabalho adicional para otimizar este protocolo para SCMV (Tabela 1). Esses resultados indicam que alguns problemas podem ser necessários ao desenvolver uma construção, pois a sequência e o comprimento do fragmento podem afetar a eficiência.
No geral, este estudo mostrou que a agroinjeção de mudas de milho é um método de inoculação eficaz para dois vírus diferentes da planta de RNA, configurações de múltiplos vetores e 11 genótipos de milho. Este trabalho com FoMV e SCMV, emparelhado com trabalhos anteriores utilizando injeção com vírus de mottle clorotic de milho (MCMV) ou MSV, indica que a agroinjeção é adequada para inoculação de mudas de milho com clones infecciosos de vírus de RNA e DNA19,20,21,22. Além disso, este trabalho mostra ainda que a agroinjeção é um método viável para vetores VIGS e VOX e pode ser aplicada a plantas com até quatro dias de idade (Tabela 3). Espera-se que o protocolo aqui apresentado seja prontamente adaptado por biólogos de milho para facilitar a pesquisa em estudos de genômica funcional envolvendo silenciamento genético transitório (VIGS) e superexpressão (VOX). A agroinjeção também tem a capacidade de facilitar abordagens de edição de genes baseadas em vírus (VEdGE) que de outra forma seriam limitadas pela dependência da transformação da planta, potencialmente melhorando a eficiência de edição, bem como a acessibilidade58,59,60. Dada a variedade agrobacterium adequada, genótipos de milho e vetores virais são cuidadosamente combinados, espera-se que a inoculação por agroinjeção se torne uma ferramenta valiosa para análises transitórias da função genética no milho.

Clones infecciosos de muitos vírus vegetais foram projetados para silenciamento genético induzido por vírus (VIGS), superexpressão genética (VOX) e, mais recentemente, edição de genes habilitado para vírus (VEdGE)1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . À medida que novas construções virais são desenvolvidas, métodos para infectar com sucesso tecidos vegetais com esses vírus modificados também devem ser considerados. Os métodos atuais para lançar infecções por vírus em plantas incluem bombardeio de partículas, rub-inoculação de transcrições in vitro de RNA ou clones de DNA, inoculação de punção vascular ou inoculação de tumefaciens agrobacterium (agroinoculação)5,12,13,14,15,16,17 . Cada um desses métodos de inoculação tem vantagens e desvantagens inerentes, que incluem custo, necessidade de equipamentos especializados e viabilidade dentro de um determinado sistema de vírus vegetal. Métodos que utilizam infiltração ou injeção de cepas de Agrobacterium contendo construções binárias de T-DNA projetadas para fornecer vírus recombinantes são preferidos, pois são simples e baratos. No entanto, faltam métodos detalhados de agroindústria para espécies monocotíces, como zea mays (milho).
Um dos primeiros relatos de agroinoculação para entrega de vírus foi publicado em 1986, quando o genoma do vírus do mosaico de couve-flor (CaMV) foi inserido em uma construção T-DNA, e a Agrobacterium resultante que carregava essa construção foi esfregada em plantas de nabo18. Desde então, foram desenvolvidos métodos adicionais de agroindulação. Por exemplo, no caso do vírus do mosaico de cauda-raposa (FoMV), Nicotiana benthamiana pode ser usada como um hospedeiro intermediário para gerar partículas de vírus em folhas que fornecem uma fonte inóculo6. A inoculação de milho por meio de folhas infectadas de N. benthamiana é eficiente, rápida e simples, mas o uso de um hospedeiro intermediário não funciona para todos os vírus que infectam milho. O vírus do mosaico de cana-de-açúcar (SCMV), por exemplo, não pode infectar n. benthamiana, exigindo o uso de fontes alternativas de inóculo para vetores derivados desse vírus. Em 1988, a Agrobacterium contendo o vírus da raia do milho (MSV), um vírus de DNA, foi introduzida em mudas de milho por injeção (agroinjeção), demonstrando que métodos de inoculação à base de Agrobacterium também são úteis para monocotas19. Apesar desse sucesso precoce com a agroinjeção, poucos estudos utilizando essa técnica em milho foram publicados, deixando em aberto questões sobre a aplicabilidade deste método para vírus RNA e vetores VIGS, VOX e VEdGE20,21,22. No entanto, o amplo uso da agroinjeção em espécies monocotas é promissor, pois essa abordagem geral tem sido utilizada em orquídeas, arroz e trigo23,24,25,26,27,28.
Este protocolo foi otimizado para fomv e agrobacterium strain GV3101 e também foi aplicado a um vetor SCMV. FoMV é um potexvírus com uma ampla gama de hospedeiros que inclui 56 espécies de monocot e dicot29. O FoMV tem um sentido positivo de 6,2 quilobase (kb), genoma de RNA de fio único que codifica cinco proteínas diferentes de cinco quadros de leitura aberto (ORFs)30,31,32,33,34,35. O FoMV foi previamente desenvolvido em um vetor VIGS e VOX para milho, incorporando um clone infeccioso em uma espinha dorsal plasmida de DNA T6,36,37. O genoma viral foi modificado para aplicações VIGS adicionando um local de clonagem (MCS1*) imediatamente a jusante da proteína do casaco (CP) (Figura 1A)36. Para aplicações VOX e VEdGE, o promotor cp foi duplicado e um segundo site de clonagem (MCS2) foi adicionado para permitir a inserção de sequências de interesse entre ORF 4 e o CP (Figura 1B)6. O vetor FoMV contendo MCS1 e MCS2 sem pastilhas é o vetor vazio FoMV (FoMV-EV) (Figura 1).
O SCMV é um vírus não relacionado que foi desenvolvido para VOX no milho38. É membro da família Potyviridae, da qual vários membros foram projetados para expressar proteínas estrangeiras em planta39,40,41,42,43,44. A gama hospedeira de SCMV inclui milho, sorgo e cana-de-açúcar45,46, tornando-o valioso para estudos funcionais genéticos nessas principais plantas agrícolas36,38. O SCMV tem um sentido positivo, genoma de RNA de uma única cadeia de aproximadamente 10 kb de comprimento47,48. Para criar o vetor VOX SCMV, a bem estabelecida junção P1/HCPro foi utilizada como um local de inserção para sequências heterólogas38. Este local de clonagem é seguido por uma sequência codificando um local de decote protease NIa-Pro, levando à produção de proteínas independentes da poliproteína SCMV (Figura 1C).
Plasmídeos de T-DNA que transportam cDNA infeccioso desses vírus recombinantes foram transformados em cepas de Agrobacterium GV3101. GV3101 é uma cepa do tipo nopaline, que é bem conhecida por ser capaz de transferir T-DNA para espécies monocotíces, incluindo milho26,28,49. Além disso, estudos anteriores de agroinjeção utilizaram as cepas C58 ou seu derivado GV3101, bem como 19,20,22,27.
Três genes marcadores foram usados no desenvolvimento deste protocolo: dois para silenciamento genético e um para expressão genética. Um fragmento de 329 pares de base (bp) da lesão do gene do milho imita 22 (les22, GRMZM2G044074) foi usado para construir o vetor de silenciamento FoMV-LES22. Quando les22 é silenciado em milho, pequenas manchas redondas de células necróticas aparecem ao longo da vasculatura de folhas que se expandem e se fundem em grandes áreas de tecido necrosado da folha50. FoMV-PDS, contendo um fragmento de 313 bp do gene de sorgo fitoene desaturase (pds, LOC110436156, 96% de sequência de identidade para pds de milho, GRMZM2G410515), induz o silenciamento de pds em milho, resultando em pequenas faixas de células fotobleachadas ao longo da vasculatura das folhas que alongam ao longo do tempo51. A sequência de codificação intacta para proteína fluorescente verde (GFP) foi usada para demonstrar expressão proteica tanto para FoMV (FoMV-GFP) quanto para SCMV (SCMV-GFP). A expressão GFP nas folhas é tipicamente mais detectável aos 14 dias após a inoculação (DPI)6. Embora tenha havido estudos anteriores utilizando a agroinjeção de vetores virais no milho, esses experimentos só mostraram que a agroinjeção pode facilitar a infecção viral de um clone infeccioso em mudas de milho e não se expandir para vírus recombinantes projetados para aplicações VIGS ou VOX19,20,21,22. O protocolo aqui apresentado baseia-se em métodos anteriores de agroinjeção, particularmente Grismley et al.19. No geral, este método de agroinjeção é compatível com vetores VIGS e VOX, não requer equipamentos especializados ou hosts alternativos como fontes inóculos, e diminui o tempo e o custo total necessários para configurar e realizar inoculações em relação a outros métodos comuns que requerem biolística ou transcrição in vitro. Este protocolo facilitará estudos de genômica funcional em milho com aplicações envolvendo VIGS, VOX e VEdGE.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955450</td>
			<td>alternatively, BD 309659</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Corning Science</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1kb+ Ladder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10787018</td>
			<td>For assessing sizes of PCR products</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G x 5/8&#34; PrecisionGlide Needles</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28&#176;C Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Agrobacterium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For E. coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D134406</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A4800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>E-3120</td>
			<td>For making gels to check for virus/insert stability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrobacterium tumefaciens Strain GV3101</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Carries vir plasmid encoding T-DNA transfer machinery, RifR, GmR, from lab stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bsu36I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K1672</td>
			<td>Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit with Dnase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C298</td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5alpha Competent E. coli Cells</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Ligase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K1422</td>
			<td>Rapid DNA Ligation Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenediamine Tetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Peters Fertilizer 15-15-15 Concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat Inserts</td>
			<td>T.O. Plastics</td>
			<td>715357C</td>
			<td>For germinating seeds in trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flats</td>
			<td>T.O. Plastics</td>
			<td>710245C</td>
			<td>For germinating seeds in trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorCam</td>
			<td>Photon Systems Instruments</td>
			<td></td>
			<td>To assess maize plants for GFP expression before microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Electrophoresis Box</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A38</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-500</td>
			<td>For saving frozen stocks of bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Go-Taq, 2X</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144</td>
			<td>for pHing solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>109827</td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin, Monosulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Pots</td>
			<td>Kordlok</td>
			<td>SQL0550</td>
			<td>5x5x4&#34; or bigger.&#160; For transplanting seedlings.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani (LB) Broth, Miller</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>M1245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maize Golden Bantam Sweet Corn Seed</td>
			<td>American Meadows, West Coast Seeds</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maize Inbred Seed</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Our seed comes from our institution, but we are not able to provide this for other researchers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxima H Minus Reverse Transcriptase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EP0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ</td>
			<td>Elga</td>
			<td></td>
			<td>Purelab Ultra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch PCR &#38; DNA Cleanup Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peters Excel 15-5-15 Fertilizer</td>
			<td>ICL Specialty Fertilizers</td>
			<td>G99140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, 95 mm x 15 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875714G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P171</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Our primers were synthesized through our institutional DNA facility or through IDT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PspOMI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>557303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase A</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12091021</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SbfI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For weighing chemicals for media or buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil Substrate</td>
			<td>SunGro Horticulture</td>
			<td>SS#1-F1P</td>
			<td>Sunshine Mix #1/Fafard-1P, any soil mix that maize grows well in is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For measuring OD600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sybr Safe, 10,000X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S33102</td>
			<td>For making gels to check for virus/insert stability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP154</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>15596018</td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh Paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For weighing chemicals for media or buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XbaI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0145</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct agroinoculation of maize seedlings by injection with recombinant foxtail mosaic virus and sugarcane mosaic virus infectious clones

As abordagens de inoculação baseadas em agrobacterium são amplamente utilizadas para introduzir vetores virais em tecidos vegetais. Este estudo detalha um protocolo para a injeção de mudas de milho perto do tecido meristemático com Agrobacterium carregando um vetor viral. Clones de mosaico de cauda de raposa recombinante (FoMV) projetados para silenciamento genético e expressão genética foram usados para otimizar este método, e seu uso foi expandido para incluir um vírus de mosaico de cana recombinante (SCMV) projetado para expressão genética. Fragmentos genéticos ou sequências de codificação de interesse são inseridos em um genoma viral modificado e infeccioso que foi clonado no vetor binário T-DNA plasmid pCAMBIA1380. As construções plasmídeos resultantes são transformadas em tumefaciens agrobacterium tumefaciens strain GV3101. Mudas de milho com até 4 dias de idade podem ser injetadas perto do nó coleoptilar com bactérias resuspended na solução MgSO4. Durante a infecção pelo Agrobacterium, o T-DNA que carrega o genoma viral é transferido para células de milho, permitindo a transcrição do genoma rna viral. À medida que o vírus recombinante se replica e se espalha sistematicamente por toda a planta, sintomas virais e alterações fenotípicas resultantes do silenciamento da lesão dos genes-alvo imitam 22 (les22) ou fitoene desaturase (pds) podem ser observados nas folhas, ou expressão de proteína fluorescente verde (GFP) pode ser detectada após a iluminação com luz UV ou microscopia de fluorescência. Para detectar o vírus e avaliar a integridade da inserção simultaneamente, o RNA é extraído das folhas da planta injetada e o RT-PCR é conduzido usando primers flanqueando o local de clonagem múltipla (MCS) carregando a sequência inserida. Este protocolo tem sido usado efetivamente em vários genótipos de milho e pode ser facilmente expandido para outros vetores virais, oferecendo assim uma ferramenta acessível para introdução de vetores virais no milho.

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Direct Agroinoculation of Maize Seedlings by Injection with Recombinant Foxtail Mosaic Virus and Sugarcane Mosaic Virus Infectious Clones

Um protocolo de injeção à base de agrobacterium (agroinjeção) é apresentado para a inoculação do vírus do mosaico de rabo-de-raposa e do vírus do mosaico de cana-de-açúcar em mudas de milho. A inoculação dessa forma leva à infecção viral, silenciamento genético induzido por vírus de genes marcadores e superexpressão viral de GFP.

Agroinoculação direta de Mudas de Milho por Injeção com Vírus mosaico de rabo-de-cavalo recombinante e clones infecciosos do vírus do mosaico de cana-de-açúcar

Agrobacterium-based inoculation approaches are widely used for introducing viral vectors into plant tissues. This study details a protocol for the ...

Este protocolo permite a inoculação de vetores virais diretamente em plantas de milho que podem ser facilmente aplicadas na maioria das configurações de laboratório sem a necessidade de qualquer equipamento especializado caro. A inoculação direta elimina o uso de um host alternativo como fonte inóculo, economizando tempo e recursos. Este método poderia ser aplicado a vetores virais adicionais, linhas de milho e potencialmente outras espécies monocot.Comece plantando de 1 a 2 sementes de milho no meio de cultivo à base de turfa em pequenas pastilhas colocadas dentro das bandejas. Coloque as bandejas em uma câmara de crescimento abaixo de 16 horas por dia a 25 graus Celsius e noites de 8 horas a 22 a 25 graus Celsius, ou em uma estufa de 22 a 25 graus Celsius com 16 horas diárias e 8 horas noturnas. Regar regularmente plantas e fertilizar uma vez por semana com 15-5-15 fertilizantes líquidos a 330 partes por milhão de concentração.Prepare a agrobacterium para injeção, inoculando a cepa de agrobacterium contendo a construção viral desejada em meios LB com antibióticos. Em seguida, incubar o frasco ou tubos a 28 graus Celsius enquanto treme a 225 RPM por 24 horas. No dia seguinte, pelota as bactérias por centrificação a 4.000 vezes G por 10 minutos em temperatura ambiente e descarte o sobrenante.Em seguida, lave a pelota com um mililitro de água deionizada. Suspenda a pelota em um mililitro de solução de sulfato de magnésio milimão e meça a densidade óptica em 600 nanômetros. Em seguida, ajuste-o para 1.0.Use mudas de milho de 4 a 7 dias para injetar agrobacterium. Monte a seringa e a agulha. Injete suavemente a suspensão bacteriana 2-3 milímetros acima do nó coleoptilular até que ele encha o coleoptile, ou seja visível na prostituta, pendente no estágio de crescimento das plantas.Injete todas as mudas e troque a seringa e as agulhas para injetar cada construto. Confirme a infecção fenotípica observando lesões de silenciar os genes de controle, lesão imita 22 ou desaturação de fitoeno nas folhas. Use um dispositivo de imagem de fluorescência para triagem rápida de plantas e microscopia de fluorescência para detectar a presença da expressão GFP.Realize a análise de expressão genética para detecção molecular de infecção. Extrair RNA total de folhas de plantas infectadas 14 a 21 dias após a infecção, e sintetizar o primeiro ramal de fio, conforme descrito no manuscrito do texto. Realize a transcriptase reversa PCR para confirmar a infecção e determinar a integridade do gene ou fragmento de interesse genético usando primers específicos projetados para diferentes construções virais.Visualize o produto PCR em um gel de 1%agarose contendo uma mancha de ácido nucleico para determinar a presença ou ausência de vírus e gene ou fragmento genético. Este protocolo foi usado para inserir vírus recombinantes projetados para o gene em mudas de milho. Aproximadamente 12 dias após a injeção, foram observados fenótipos silenciados nas folhas como necrose e fotobleaching.A presença de construto nas folhas após a infecção foi detectada observando a expressão de proteína fluorescente verde sob uma fluorescência usando um filtro GFP diferente. A expressão de proteína fluorescente verde nas folhas infectadas pelo vírus do mosaico de cauda-raposa foi visualizada como pequenas áreas pontuadas de fluorescência distribuídas pelas folhas e como grandes manchas nas folhas infectadas pelo vírus do mosaico de cana-de-açúcar. Utilizando a análise de expressão genética, foi confirmada a infecção sistêmica pelo vírus do mosaico de cauda de raposa e o silenciamento ou supressão genética da desaturação de fitoeno e da lesão imita 22.O construto também utilizou eficiência de infecção influenciada. No caso da infecção pelo vírus do mosaico de rabo-de-raposa, o vírus do mosaico de rabo-de-raposa e a lesão do vírus do mosaico foxtail imitam 22 tipicamente as maiores eficiências de infecção em 53% e 54%, respectivamente. O vírus do mosaico foxtail se desatura uma eficiência ligeiramente menor em 39% e a proteína fluorescente verde do vírus do mosaico foxtail, com a menor eficiência em 16% Enquanto isso, a eficiência da infecção da proteína fluorescente verde do vírus do mosaico de cana-de-açúcar foi de 8% O tempo e os sintomas serão baseados no vetor viral e na linha de milho utilizada.A falta de um fenótipo visual pode não significar falta de silenciamento ou expressão. Este método também pode ser aplicado às tecnologias de edição de genes, melhorando os métodos de entrega para guias RNAs.

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