Name: direct agroinoculation of maize seedlings by injection with recombinant foxtail mosaic virus and sugarcane mosaic virus infectious clones
Uploaded: 2021-02-27T14:30:00
Duration: 5 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Agroinoculation of Maize Seedlings by Injection with Recombinant Foxtail Mosaic Virus and Sugarcane Mosaic Virus Infectious Clones at JoVE.com

Университет штата Айова является частью команды, поддерживающей программу DARPA Insect Allies HR0011-17-2-0053. Эта работа также была поддержана Институтом наук о растениях Университета штата Айова, Центром биоинженерии сельскохозяйственных культур Университета штата Айова, проектом USDA NIFA Hatch No 3808 и фондами штата Айова. K.L.H. также был частично поддержан программой подготовки выпускников Университета штата Айова predictive Plant Phenomics, финансируемой Национальным научным фондом (DGE #1545453), и грантом Сельскохозяйственной и продовольственной исследовательской инициативы No 2019-07318 от Национального института продовольствия и сельского хозяйства Министерства сельского хозяйства США. Спонсоры не играли никакой роли в разработке исследования и сбора, анализа и интерпретации данных, а также в написании рукописи. Любые мнения, выводы, выводы или рекомендации, выраженные в этом материале, являются мнениями авторов и не обязательно отражают взгляды спонсоров.
Мы благодарим Ника Лаутера (USDA-ARS, Ames, IA) за семена инбредных линий кукурузы, Кристиана Ф. Монтес-Сери (Университет штата Айова) за создание клона FoMV-GFP и Тайлера Остина (Университет штата Айова) за техническую помощь.

У исследователей нет конфликтов интересов, которые можно было бы раскрыть.

Agrobacterium является важным инструментом, который облегчает многочисленные методы молекулярной биологии в исследованиях, связанных с растениями. Это исследование предоставляет протокол агроинъекции для инокуляции вирусных векторов FoMV и SCMV непосредственно в ткани кукурузы для применения VIGS и VOX. Основной целью является повышение простоты и полезности вирусных технологий для исследований в монокотных сельскохозяйственных культурах. Хотя прямая агроинокуляция кукурузы была зарегистрирована для нескольких вирусов, авторы не знают о подробном протоколе, и в этих исследованиях нет примеров применения VIGS и VOX19,22.
Сообщалось и было подтверждено при разработке этого протокола, что место инъекции является ключевым фактором для успешного запуска системной вирусной инфекции через агроинъекцию19. Последовательная инъекция рекомендуемого места на растении считается самой большой переменной, потому что точное положение меристемы в саженцах кукурузы практически не обнаруживается на глаз. Чтобы свести к минимуму межличностные вариации, рекомендуется рассечь несколько саженцев кукурузы до меристемы, чтобы лучше визуализировать ее местоположение (рисунок 3C). Положение меристемы по отношению к колеоптилярному узлу должно быть примерно одинаковым для растений в возрасте 4-7 дней. Кроме того, практика инъекции с окрашенной жидкостью обеспечивает легко видимую демонстрацию того, как «инокулятив» заполняет мутовку листа, и поскольку место инъекции помечено красителем, точность места инъекции может быть подтверждена (рисунок 3G, H). Меристематические ткани наиболее восприимчивы к агроинъекции, но введение суспензий Agrobacterium непосредственно в эту ткань приводит к нежелательным морфологическим эффектам (рисунок 6)19. Растения с поврежденными меристемами выживают, но образовавшиеся дефекты нежелательны, и, таким образом, следует избегать прямых инъекций этой ткани.
Существует несколько переменных, которые могут повлиять на успешный запуск системной вирусной инфекции через агроинъекцию, потому что три сложные биологические системы (растение, вирус и штамм Agrobacterium) должны взаимодействовать в координации. Этому сложному взаимодействию могут способствовать быстро делящиеся клетки меристематической области, что делает ее идеальным местом для агроинокуляции19. Штамм Agrobacterium должен быть в состоянии инфицировать клетки растительных тканей, чтобы доставить Т-ДНК, несущую вирусный геном, и растение должно быть восприимчиво к вирусу, чтобы инициировать вирусную репликацию и системную инфекцию. Генотипы кукурузы различаются по своей восприимчивости к вирусам (например, Mo17 устойчив к FoMV) или штаммам Agrobacterium, но большинство протестированных штаммов, по-видимому, восприимчивы как к FoMV, так и к SCMV (Таблица 1 и Таблица 2)53. Например, инбредная линия FR1064 и сорт сладкой кукурузы Golden Bantam могут быть особенно восприимчивы как к GV3101 Agrobacterium, так и к векторам на основе FoMV.
Количество отобранных листьев и сроки отбора проб для ОТ-ПЦР имеют решающее значение для точной оценки вирусной инфекции. В примерах, показанных здесь, номер листа определяли, начиная с первого округлого листа (широко известного как «лист большого пальца») и отсчитывая вверх. Листья были отобраны после того, как они были расширены, и следующий лист начал появляться. Однако то, какие листья являются оптимальными для отбора проб, может варьироваться в зависимости от используемых видов вируса, условий роста и генотипа кукурузы. Поэтому при применении этого протокола к новой вирусной системе рекомендуется провести эксперимент с начальным временным курсом для оптимизации стратегии отбора проб в отношении листьев и времени.
Используемая специфическая конструкция существенно влияет на эффективность этого протокола. Например, пустые векторы, FoMV-EV и SCMV-EV, а также FoMV-PDS и FoMV-LES22, которые содержат небольшие вставки (313 bp и 329 bp соответственно), обычно производят самый высокий процент растений с вирусными симптомами в этих экспериментах (таблицы 1 и таблица 2). Однако рекомбинантные вирусы, несущие более крупные вставки GFP ORF (720 bp) в FoMV-GFP и SCMV-GFP, имели гораздо более низкие показатели инфицирования по сравнению с растениями, вводимыми с пустым вектором или структурами глушения генов. Эта тенденция может быть связана с негативным воздействием на вирусную пригодность, вызванным увеличением количества экзогенного генетического материала в вирусном геноме. Несколько исследований показали, что стабильность вставки растительных вирусных векторов в значительной степени зависит от размера и последовательности вставки36,54,55,56,57. Кроме того, наблюдалась заметная разница в процентном соотношении растений, которые заражаются после посева пустым вектором FoMV или SCMV, что говорит о том, что для оптимизации этого протокола для SCMV требуется дополнительная работа (таблица 1). Эти результаты указывают на то, что при разработке конструкции может потребоваться некоторое устранение неполадок, поскольку последовательность и длина фрагмента могут влиять на эффективность.
В целом, это исследование показало, что агроинъекция саженцев кукурузы является эффективным методом вакцинации для двух различных РНК-вирусов растений, нескольких векторных конфигураций и 11 генотипов кукурузы. Эта работа с FoMV и SCMV, в сочетании с предыдущими работами, использующими инъекцию вируса хлоротической пятнистости кукурузы (MCMV) или MSV, указывает на то, что агроинъекция подходит для инокуляции саженцев кукурузы инфекционными клонами как РНК, так и ДНК вирусов19,20,21,22. Кроме того, эта работа также показывает, что агроинъекция является жизнеспособным методом для векторов VIGS и VOX и может быть применена к растениям в возрасте четырех дней (таблица 3). Ожидается, что представленный здесь протокол будет легко адаптирован биологами кукурузы для облегчения исследований функциональной геномики, включающих глушение переходных генов (VIGS) и сверхэкспрессию (VOX). Агроинъекция также обладает потенциалом для содействия подходам к редактированию генов на основе вирусов (VEdGE), которые в противном случае были бы ограничены зависимостью от трансформации растений, потенциально повышая эффективность редактирования, а также доступность58,59,60. Учитывая соответствующий штамм Agrobacterium, генотипы кукурузы и вирусные векторы продуманно комбинированы, ожидается, что инокуляция путем агроинъекции станет ценным инструментом для анализа переходной функции генов кукурузы.

Инфекционные клоны многих вирусов растений были разработаны для вирус-индуцированного глушения генов (VIGS), гиперэкспрессии генов (VOX) и совсем недавно для редактирования генов с поддержкой вирусов (VEdGE)1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . По мере разработки новых вирусных конструкций необходимо также рассмотреть методы успешного заражения тканей растений этими модифицированными вирусами. Современные методы запуска вирусных инфекций в растениях включают бомбардировку частицами, втирание транскриптов РНК in vitro или клонов ДНК, посев проколов сосудов или посев Agrobacterium tumefaciens (агроинокуляция)5,12,13,14,15,16,17 . Каждый из этих методов вакцинации имеет неотъемлемые преимущества и недостатки, которые включают в себя стоимость, потребность в специализированном оборудовании и осуществимость в рамках данной системы вирусов растений. Методы, которые используют инфильтрацию или инъекцию штаммов Agrobacterium, содержащих бинарные конструкции Т-ДНК, предназначенные для доставки рекомбинантных вирусов, являются предпочтительными, потому что они просты и недороги. Однако подробные методы агроинокуляции для однодольных видов, таких как Zea mays (кукуруза), отсутствуют.
Одно из первых сообщений об агроинокуляции для доставки вируса было опубликовано в 1986 году, когда геном вируса мозаики цветной капусты (CaMV) был вставлен в конструкцию Т-ДНК, и полученная агробактерия, несущая эту конструкцию, была привита растениям репы18. С тех пор были разработаны дополнительные методы агроинокуляции. Например, в случае вируса мозаики лисохвоста (FoMV) Nicotiana benthamiana может быть использована в качестве промежуточного хозяина для генерации вирусных частиц в листьях, которые обеспечивают источник инокулята6. Втирать кукурузу с использованием инфицированных листьев N. benthamiana эффективно, быстро и просто, но использование промежуточного хозяина не работает для всех вирусов, заражающих кукурузу. Например, вирус мозаики сахарного тростника (SCMV) не может заразить N. benthamiana, что требует использования альтернативных источников инокулята для переносчиков, полученных из этого вируса. В 1988 году Agrobacterium, содержащая вирус кукурузной полосы (MSV), ДНК-вирус, была введена в саженцы кукурузы путем инъекции (агроинъекция), демонстрируя методы посева на основе Agrobacterium также полезны для монокотов19. Несмотря на этот ранний успех с агроинъекцией, было опубликовано мало исследований, использующих этот метод в кукурузе, оставляя открытыми вопросы о применимости этого метода к РНК-вирусам и векторам VIGS, VOX и VEdGE20,21,22. Тем не менее, широкое использование агроинъекции в монокотных видах является многообещающим, поскольку этот общий подход был использован в орхидеях, рисе и пшенице23,24,25,26,27,28.
Этот протокол был оптимизирован для Штамма FoMV и Agrobacterium GV3101, а также был применен к вектору SCMV. FoMV является потексвирусом с широким диапазоном хозяев, который включает в себя 56 видов монокотов и дикот29. FoMV имеет 6,2 килобаза (kb) положительного смысла, одноцепочечный геном РНК, который кодирует пять различных белков из пяти открытых кадров чтения (ORFs) 30,31,32,33,34,35. FoMV был ранее разработан как вектор VIGS, так и VOX для кукурузы путем включения инфекционного клона в плазмидную основу Т-ДНК6,36,37. Вирусный геном модифицировали для применения VIGS путем добавления сайта клонирования (MCS1*) непосредственно после белка оболочки (CP) (рисунок 1A)36. Для приложений VOX и VEdGE промоутер CP был продублирован и добавлен второй сайт клонирования (MCS2), чтобы обеспечить вставку интересующих последовательностей между ORF 4 и CP (рисунок 1B)6. Вектор FoMV, содержащий как MCS1, так и MCS2 без вставок, является пустым вектором FoMV (FoMV-EV) (рисунок 1).
SCMV является несвязанным вирусом, который был разработан для VOX в кукурузе38. Он является членом семейства Potyviridae, несколько членов которого были спроектированы для экспрессии чужеродных белков в planta39,40,41,42,43,44. Диапазон хозяев SCMV включает кукурузу, сорго и сахарный тростник45,46, что делает его ценным для генных функциональных исследований в этих основных сельскохозяйственных растениях36,38. SCMV имеет положительный смысл, одноцепочечный геном РНК длиной около 10 кб47,48. Для создания вектора SCMV VOX в качестве места вставки гетерологичных последовательностей использовался хорошо зарекомендовавший себя переход P1/HCPro38. За этим сайтом клонирования следует последовательность, кодирующая участок расщепления протеазы NIa-Pro, что приводит к образованию белков, независимых от полипротеина SCMV (рисунок 1C).
Т-ДНК плазмиды, несущие инфекционную кДНК этих рекомбинантных вирусов, были преобразованы в штамм Agrobacterium GV3101. GV3101 представляет собой штамм нопалинового типа, который, как известно, способен передавать Т-ДНК однодольным видам, включая кукурузу26,28,49. Кроме того, в предыдущих исследованиях агроинъекции использовались штаммы C58 или его производное GV3101, а также 19,20,22,27.
При разработке этого протокола использовались три маркерных гена: два для глушения генов и один для экспрессии генов. Фрагмент пары оснований (bp) 329 из повреждения гена кукурузы, имитирующего 22 (les22, GRMZM2G044074), был использован для построения глушающего вектора FoMV-LES22. Когда les22 заглушается в кукурузе, вдоль сосудистой системы листьев появляются небольшие круглые участки некротических клеток, которые расширяются и сливаются в большие участки некротической ткани листьев50. FoMV-PDS, содержащий фрагмент 313 bp из фитоендесатуразы гена сорго (pds, LOC110436156, 96% идентичности последовательности для кукурузы pds, GRMZM2G410515), индуцирует глушение pds в кукурузе, что приводит к небольшим полосам фотоотбеленных клеток вдоль сосудистой системы листьев, которые удлиняются с течением времени51. Интактная кодирующая последовательность для зеленого флуоресцентного белка (GFP) использовалась для демонстрации экспрессии белка как для FoMV (FoMV-GFP), так и для SCMV (SCMV-GFP). Экспрессия GFP в листьях обычно наиболее обнаруживается через 14 дней после прививки (DPI)6. Хотя были проведены предыдущие исследования с использованием агроинъекции вирусных векторов в кукурузе, эти эксперименты только показали, что агроинъекция может способствовать вирусной инфекции от инфекционного клона в саженцах кукурузы и не распространяется на рекомбинантные вирусы, предназначенные для применения VIGS или VOX19,20,21,22. Представленный здесь протокол основывается на предыдущих методах агроинъекции, в частности Grismley et al.19. В целом, этот метод агроинъекции совместим с векторами VIGS и VOX, не требует специализированного оборудования или альтернативных хозяев в качестве источников инокулята и снижает общее время и стоимость, необходимые для настройки и выполнения прививок по сравнению с другими распространенными методами, которые требуют биолистики или транскрипции in vitro. Этот протокол облегчит исследования функциональной геномики в кукурузе с приложениями с участием VIGS, VOX и VEdGE.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955450</td>
			<td>alternatively, BD 309659</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Corning Science</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1kb+ Ladder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10787018</td>
			<td>For assessing sizes of PCR products</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G x 5/8&#34; PrecisionGlide Needles</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28&#176;C Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Agrobacterium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For E. coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D134406</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A4800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>E-3120</td>
			<td>For making gels to check for virus/insert stability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrobacterium tumefaciens Strain GV3101</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Carries vir plasmid encoding T-DNA transfer machinery, RifR, GmR, from lab stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bsu36I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K1672</td>
			<td>Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit with Dnase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C298</td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5alpha Competent E. coli Cells</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Ligase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K1422</td>
			<td>Rapid DNA Ligation Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenediamine Tetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Peters Fertilizer 15-15-15 Concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat Inserts</td>
			<td>T.O. Plastics</td>
			<td>715357C</td>
			<td>For germinating seeds in trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flats</td>
			<td>T.O. Plastics</td>
			<td>710245C</td>
			<td>For germinating seeds in trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorCam</td>
			<td>Photon Systems Instruments</td>
			<td></td>
			<td>To assess maize plants for GFP expression before microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Electrophoresis Box</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A38</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-500</td>
			<td>For saving frozen stocks of bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Go-Taq, 2X</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144</td>
			<td>for pHing solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>109827</td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin, Monosulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Pots</td>
			<td>Kordlok</td>
			<td>SQL0550</td>
			<td>5x5x4&#34; or bigger.&#160; For transplanting seedlings.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani (LB) Broth, Miller</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>M1245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maize Golden Bantam Sweet Corn Seed</td>
			<td>American Meadows, West Coast Seeds</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maize Inbred Seed</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Our seed comes from our institution, but we are not able to provide this for other researchers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxima H Minus Reverse Transcriptase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EP0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ</td>
			<td>Elga</td>
			<td></td>
			<td>Purelab Ultra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch PCR &#38; DNA Cleanup Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peters Excel 15-5-15 Fertilizer</td>
			<td>ICL Specialty Fertilizers</td>
			<td>G99140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, 95 mm x 15 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875714G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P171</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Our primers were synthesized through our institutional DNA facility or through IDT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PspOMI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>557303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase A</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12091021</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SbfI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For weighing chemicals for media or buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil Substrate</td>
			<td>SunGro Horticulture</td>
			<td>SS#1-F1P</td>
			<td>Sunshine Mix #1/Fafard-1P, any soil mix that maize grows well in is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For measuring OD600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sybr Safe, 10,000X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S33102</td>
			<td>For making gels to check for virus/insert stability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP154</td>
			<td>Alkaline Lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>15596018</td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh Paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For weighing chemicals for media or buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XbaI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0145</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct agroinoculation of maize seedlings by injection with recombinant foxtail mosaic virus and sugarcane mosaic virus infectious clones

Подходы к инокуляции на основе агробактерий широко используются для введения вирусных векторов в ткани растений. В этом исследовании подробно описан протокол инъекции саженцев кукурузы вблизи меристематической ткани с Agrobacterium, несущим вирусный вектор. Для оптимизации этого метода были использованы клоны рекомбинантного вируса мозаики лисохвоста (FoMV), разработанные для глушения генов и экспрессии генов, и его использование было расширено, чтобы включить рекомбинантный вирус мозаики сахарного тростника (SCMV), разработанный для экспрессии генов. Фрагменты генов или кодирующие последовательности, представляющие интерес, вставляются в модифицированный инфекционный вирусный геном, который был клонирован в бинарный Т-ДНК плазмидный вектор pCAMBIA1380. Полученные плазмидные конструкции трансформируются в штамм Agrobacterium tumefaciens GV3101. Саженцы кукурузы в возрасте от 4 дней можно вводить вблизи колеоптилярного узла с бактериями, повторно суспендированными в растворе MgSO4. Во время заражения Agrobacterium Т-ДНК, несущая вирусный геном, переносится в клетки кукурузы, что позволяет транскрипцировать геном вирусной РНК. Поскольку рекомбинантный вирус реплицируется и системно распространяется по всему растению, на листьях могут наблюдаться вирусные симптомы и фенотипические изменения, возникающие в результате глушения поражений генов-мишеней 22 (les22) или фитоендесатуразы (pds), или экспрессия зеленого флуоресцентного белка (GFP) может быть обнаружена при освещении ультрафиолетовым светом или флуоресцентной микроскопией. Для обнаружения вируса и оценки целостности вставки одновременно из листьев вводимого растения извлекают РНК и проводят ОТ-ПЦР с использованием праймеров, фланкирующих множественный сайт клонирования (MCS), несущий вставленную последовательность. Этот протокол эффективно используется в нескольких генотипах кукурузы и может быть легко распространен на другие вирусные векторы, тем самым предлагая доступный инструмент для внедрения вирусных векторов в кукурузу.

Watch this Scientific Journal Video about Direct Agroinoculation of Maize Seedlings by Injection with Recombinant Foxtail Mosaic Virus and Sugarcane Mosaic Virus Infectious Clones at JoVE.com

Direct Agroinoculation of Maize Seedlings by Injection with Recombinant Foxtail Mosaic Virus and Sugarcane Mosaic Virus Infectious Clones

Представлен протокол инъекций (агроинъекция) на основе Agrobacterium для посева вируса мозаики лисохвоста и вируса мозаики сахарного тростника в саженцы кукурузы. Инокуляция таким образом приводит к вирусной инфекции, вызванному вирусом глушению генов-маркеров и вирусной сверхэкспрессии GFP.

Прямая агроинокуляция саженцев кукурузы путем инъекции рекомбинантного вируса мозаики лисохвоста и инфекционного клона вируса мозаики сахарного тростника

Agrobacterium-based inoculation approaches are widely used for introducing viral vectors into plant tissues. This study details a protocol for the ...

Этот протокол позволяет прививать вирусные векторы непосредственно в растения кукурузы, которые могут быть легко применены в большинстве лабораторных условий без необходимости использования какого-либо дорогостоящего специализированного оборудования. Прямая инокуляция исключает использование альтернативного хозяина в качестве источника инокулята, экономя как время, так и ресурсы. Этот метод может быть применен к дополнительным вирусным векторам, линиям кукурузы и, возможно, другим однодольным видам.Начните с посадки 1-2 семян кукурузы в питательную среду на торфяной основе в небольшие вставки, размещенные внутри лотков. Поместите лотки в камеру роста под 16-часовыми днями при 25 градусах Цельсия и 8-часовыми ночами при 22-25 градусах Цельсия или в теплице при 22-25 градусах Цельсия с 16-часовыми днями и 8-часовыми ночами. Регулярно поливайте растения и удобряйте раз в неделю 15-5-15 жидкими удобрениями в концентрации 330 частей на миллион.Подготовьте агробактерию к инъекции, привив антибиотиками штамм агробактерии, содержащий нужную вирусную конструкцию, в ЛБ-среде. Затем высиживают колбу или трубки при 28 градусах Цельсия при встряхивании при 225 об/мин в течение 24 часов. На следующий день гранулируют бактерии путем центрификации в 4000 раз г в течение 10 минут при комнатной температуре и выбрасывают супернатант.Затем промыть гранулу одним миллилитром деионизированной воды. Повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре 10-миллиметрового раствора сульфата магния и измерьте оптическую плотность на 600 нанометрах. Затем отрегулируйте его до 1.0.Используйте саженцы кукурузы возрастом от 4 до 7 дней для инъекции агробактерий. Соберите шприц и иглу. Осторожно вводят бактериальную суспензию на 2-3 миллиметра выше колеоптикулярного узла, пока она не заполнит колеоптиль или не будет видна в мутовке, ожидая на стадии роста растений.Введите все саженцы и замените шприц и иглы для инъекции каждой конструкции. Подтвердить фенотипическую инфекцию, наблюдая поражения от глушения контрольных генов, имитирующих поражение 22 или фитоендесатуразы на листьях. Используйте устройство флуоресцентной визуализации для быстрого скрининга растений и флуоресцентную микроскопию для обнаружения присутствия экспрессии GFP.Выполните анализ экспрессии генов для молекулярного обнаружения инфекции. Извлекают общую РНК из листьев зараженных растений через 14-21 день после заражения и синтезируют первую цепь кДНК, как описано в тексте рукописи. Выполните ПЦР с обратной транскриптазой для подтверждения инфекции и определения целостности гена или интересующего фрагмента гена с использованием специфических праймеров, предназначенных для различных вирусных конструкций.Визуализируйте продукт ПЦР на 1% агарозном геле, содержащем пятно нуклеиновой кислоты, чтобы определить наличие или отсутствие вируса и гена или фрагмента гена. Этот протокол использовался для вставки рекомбинантных вирусов, спроектированных для гена, в саженцы кукурузы. Примерно через 12 дней после инъекции на листьях наблюдались фенотипы глушения в виде некроза и фотоотбеливания.Наличие конструкции в листьях после заражения было обнаружено путем наблюдения экспрессии зеленого флуоресцентного белка под флуоресценцией с использованием другого фильтра GFP. Экспрессия зеленого флуоресцентного белка в зараженных вирусом лисохвостах листьев была визуализирована как небольшие пунктатные участки флуоресценции, распределенные по листьям, и как большие пятна в зараженных вирусом мозаики сахарного тростника листьях. С помощью анализа экспрессии генов была подтверждена системная инфекция вируса мозаики лисохвоста и наблюдалось глушение генов или подавление фитоендесатуразы и имитации поражения 22.Используемая конструкция также повлияла на эффективность инфекции. В случае заражения вирусом мозаики лисохвоста пустой вектор вируса мозаики лисохвоста и поражения вирусом мозаики лисохвоста 22 обычно имели самую высокую эффективность заражения - 53% и 54% соответственно. Вирус мозаики foxtail phytoene desaturase при несколько более низкой эффективности на 39% и вирус мозаики foxtail зеленый флуоресцентный белок, при самой низкой эффективности в 16% Между тем, эффективность заражения вирусом мозаики сахарного тростника зеленого флуоресцентного белка составила 8% Сроки и симптомы будут основаны на вирусном векторе и используемой линии кукурузы.Отсутствие визуального фенотипа не может означать отсутствие глушения или экспрессии. Этот метод также может быть применен к технологиям редактирования генов путем улучшения методов доставки направляющих РНК.

Research

JoVE Journal

Biology

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Vaccinia вирусной инфекции и временной анализ вируса экспрессия генов: часть 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Vaccinia вирусной инфекции и временной анализ вируса экспрессия генов: часть 2

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Vaccinia вирусной инфекции и временной анализ вируса экспрессия генов: часть 3

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

Техника одновременно визуализировать вирус-специфических CD8 + T-клетки и инфицированные вирусом клетки В месте</em

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences

Мозаика данио рерио трансгенез для оценки Enhancer Последовательности

The completion of the human genome sequence, along with that of many other species, has highlighted the challenge of ascribing specific function to non ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

Прямая доставка MIF Morpholinos Into данио рерио отоцист путем инъекций и Электропорация влияет на внутреннее развитие уха

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

Химически заблокирован антител Microarray для мультиплексный высокой пропускной профилирования конкретных гликозилирования белков в сложных образцов

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

MultiBac белкового комплекса добывающей платформы на EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

Томатный / GFP-ФЛП / FRT Метод живых изображений мозаики взрослых<em&gt; Дрозофилы</em&gt; клетки фоторецепторов

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination

Экспрессия и очистка вирусоподобных частиц для вакцинации

Virus-like particles (VLPs) and subviral particles (SVPs) are an alternative approach to viral vaccine design that offers the advantages of increased ...