Name: staining and high-resolution imaging of three-dimensional organoid and spheroid models
Uploaded: 2021-03-27T14:00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل جائزة سانت بالدريك روبرت جيه أرسيسي للابتكار # 604303.

<ol>
	<li>Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+system+methods+and+applications+for+mesenchymal+stem+cells.">Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells.</a> Cells. 8 (12), 1-13 (2019).</li><li>Bartfeld, S., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+organoids+and+their+application+for+medical+research+and+patient+treatment.">Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment.</a> Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).</li><li>Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+multicellular+spheroids+formation.">Advances in multicellular spheroids formation.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 14 (127), (2017).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation.">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1724-1743 (2016).</li><li>Rezanejad, H., Lock, J. H., Sullivan, B. A., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+pancreatic+ductal+organoids+and+whole-mount+immunostaining+of+intact+organoids.">Generation of pancreatic ductal organoids and whole-mount immunostaining of intact organoids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 82 (2019).</li><li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+systems+and+their+applications+in+drug+discovery+and+cell-based+biosensors.">Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).</li><li>McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+and+assessment+of+human+primary+prostate+organoid+culture.">Handling and assessment of human primary prostate organoid culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e59051 (2019).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li><li>Lazzari, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+fluorescence+microscopy+versus+confocal+microscopy:+in+quest+of+a+suitable+tool+to+assess+drug+and+nanomedicine+penetration+into+multicellular+tumor+spheroids.">Light sheet fluorescence microscopy versus confocal microscopy: in quest of a suitable tool to assess drug and nanomedicine penetration into multicellular tumor spheroids.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 142, 195-203 (2019).</li><li>Gabriel, J., Brennan, D., Elisseeff, J. H., Beachley, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+embedding/sectioning+for+parallel+analysis+of+3D+cell+spheroids.">Microarray embedding/sectioning for parallel analysis of 3D cell spheroids.</a> Scientific Reports. 9, 16287 (2019).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

زراعة الخلايا هي أداة لا غنى عنها للكشف عن الآليات البيولوجية الأساسية المشاركة في نمو الأنسجة والأعضاء ، والوظيفة ، والتجديد والاضطراب ، والمرض. على الرغم من أن ثقافة الخلايا ثنائية الأبعاد أحادية الطبقة قد سادت ، فقد تحولت الأبحاث الحديثة نحو الثقافات التي تولد هياكل 3D أكثر انعكاسا للاستجابات الخلوية في الجسم الحي ، ويرجع ذلك بشكل خاص إلى التنظيم المكاني الإضافي واتصالات الخلايا الخلوية التي تؤثر على التعبير الجيني والسلوك الخلوي وبالتالي يمكن أن توفر المزيد من البيانات التنبؤية7. ومع ذلك ، لا تزال هناك العديد من التحديات ، بما في ذلك الحاجة إلى تقنيات تلطيخ وتصوير سهلة الاستخدام للتصور المجهري التفصيلي وتقييم هياكل 3D المعقدة على المستويين الخلوي ودون الخلوي. في هذا السياق ، تم توفير بروتوكولات مفصلة وقوية وتكميلية لإجراء تلطيخ وتصوير خلوي وتحت خلوي لنماذج زراعة الخلايا 3D الثابتة في المختبر والتي تتراوح من 100 ميكرومتر إلى عدة ملليمترات في الحجم.
يقدم هذا الإجراء استراتيجيتين مختلفتين للتعامل مع مجموعة كبيرة ومتنوعة من الأحجام والأنواع من نماذج زراعة الخلايا 3D في المختبر. يعتمد اختيار أحدهما (تحليل 3D بالكامل) أو الآخر (تحليل التقسيم 2D) على النموذج المستخدم والمشكلة التي تم التحقيق فيها. يتيح التحليل الكامل ثلاثي الأبعاد بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر تصور الخلايا ذات العمق الممتد حتى 200 ميكرومتر ، بغض النظر عن الحجم الكلي للهيكل ثلاثي الأبعاد ، في حين أن التقسيم ثنائي الأبعاد ينطبق على العينات من أي حجم ، لكن التصور يظل بعديا ثنائي الأبعاد. فيما يلي بعض الاقتراحات لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها والاعتبارات الفنية.
فقدان هياكل 3D أثناء سير العمل هو العيب الأكثر شيوعا. يمكن أن تظل ملتصقة بالنصائح والأنابيب ، وهذا هو السبب في أن أطراف وأنابيب الطلاء المسبق بمحلول PBS-BSA 0.1٪ هو المفتاح. علاوة على ذلك ، من الأهمية بمكان ترك هياكل 3D الرواسب بين تغييرات الكاشف وأداء جميع عمليات السحب بعناية فائقة. كما هو مذكور في الإجراء ، بالنسبة لجميع الخطوات ، إذا كان ترسيب الهيكل ثلاثي الأبعاد طويلا جدا ، فيمكن تدوير الخلايا بلطف عند 50 × جم لمدة 5 دقائق في RT. اعتمادا على الهدف من الدراسة ، ينبغي النظر في مزايا / عيوب مثل هذه الخطوة الغزل كما يمكن أن الطرد المركزي يضر شكل الهياكل 3D. علاوة على ذلك ، يجب توخي الحذر للحفاظ على هذا التشكل أثناء خطوة التثبيت لأن الكائنات العضوية الكيسية تميل إلى الانهيار. يجب أن يمنع تثبيت الهياكل التي يقل حجمها عن 400 ميكرومتر التغييرات الهيكلية.
للحصول على العلامات المناعية المثلى ، يعد استرداد المواد العضوية من مصفوفات 3D خطوة حاسمة. يمكن أن تعيق مصفوفة 3D اختراق الأجسام المضادة الكافية أو تؤدي إلى تلطيخ الخلفية العالية بسبب الارتباط غير المحدد بالمصفوفة. قد تؤدي إزالة ECM إلى تغيير مورفولوجيا الأجزاء الخارجية من المواد العضوية (لا سيما في حالة النتوءات الخلوية الصغيرة الممتدة من هياكل 3D المدروسة) وتعيق التحليلات جزئيا. لمثل هذه الهياكل 3D ، يمكن الاحتفاظ بالمصفوفة طوال الإجراء ؛ ومع ذلك ، يجب تكييف ظروف الثقافة بعناية لنمو الخلايا في الحد الأدنى من المصفوفة لمنع الاختراق غير الكافي للحلول والأجسام المضادة وتجنب خطوات الغسيل المتتالية التي تهدف إلى تقليل ضوضاء الخلفية المفرطة 6,8.
تعتبر خطوة المقاصة البصرية الموضحة في هذا البروتوكول في قسم تلطيخ التركيب الكامل ثلاثي الأبعاد ذات صلة بتصوير الهياكل ثلاثية الأبعاد التي يصل عمقها إلى 150-200 ميكرومتر بدلا من 50-80 ميكرومتر دون تطهير. مقارنة بمنهجيات المقاصة الأخرى التي تتطلب في كثير من الأحيان عدة أسابيع وتستخدم عوامل إزالة سامة ، تم استخدام خطوة إزالة سريعة وآمنة منشورة مسبقا في هذا البروتوكول 4,9. بالإضافة إلى ذلك ، فإن خطوة المقاصة هذه قابلة للعكس ، ويمكن إضافة أجسام مضادة جديدة إلى التلوين الأولي دون فقدان الدقة أو السطوع4. ومع ذلك ، اعتمادا على نموذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد الذي تمت دراسته ، قد لا يكون عمق 150-200 ميكرومتر كافيا لتصوير بنية ثلاثية الأبعاد بطريقة إعلامية ، ويمكن أن يتسبب بروتوكول المقاصة هذا في حدوث تغييرات في التشكل العام للعضويات الكروية أحادية الطبقات ذات اللومن الكبير4. يجب على المستخدمين تصميم تجربتهم بعناية ، وإذا لزم الأمر ، تحسين توقيت خطوة النفاذية / الحجب (للسماح باختراق الأجسام المضادة والمحلول) ، وخطوة المقاصة (لاختراق أعمق من 200 ميكرومتر ، يجب مسح العينات تماما) ، والحصول على الصور. والتكنولوجيات الأكثر انتشارا المتاحة في المرافق الأساسية هما الصفيحة الضوئية والفحص المجهري متحد البؤر. سيحتاج المستخدمون إلى اختيار تقنية بعناية بناء على حجم هياكل 3D الخاصة بهم وسؤالهم البيولوجي10. ومع ذلك ، بالمقارنة مع الفحص المجهري متحد البؤر ، تظل دقة الفحص المجهري للصفائح الضوئية التي تم الحصول عليها لمثل هذه الهياكل العميقة دون المستوى الأمثل للحصول على دقة تحت خلوية.
هنا ، تم الإبلاغ عن عملية مفصلة وقوية مخصصة لتضمين البارافين لعينات واحدة. ومن المثير للاهتمام ، أن Gabriel et al. طورت مؤخرا بروتوكولا يتضمن ثقافات خلايا 3D في البارافين مع زيادة الإنتاجية. استخدموا قالب polydimethylsiloxane (PDMS) لحصر 96 بنية ثلاثية الأبعاد في نمط microarray في كتلة واحدة ، مما يوفر وجهات نظر جديدة للدراسات حول نماذج الورم ثلاثية الأبعاد التي تشمل المزيد من المجموعات والنقاط الزمنية وظروف العلاج وتكرار11. ومع ذلك ، تتطلب هذه الطريقة مهارات وآلات واسعة النطاق ، لا سيما لتصنيع القوالب الأولية المستخدمة لإنشاء قوالب PDMS.
باختصار ، تصف هذه الورقة نهجين مختلفين ومتكاملين وقابلين للتكيف مما يتيح الحصول على معلومات دقيقة وكمية عن التركيب المعماري والخلوي للنماذج الخلوية 3D. كلا المعلمتين ضروريتان لدراسة العمليات البيولوجية مثل عدم التجانس الخلوي داخل الورم ودوره في مقاومة العلاجات.

على مدى العقود الماضية ، بشر التقدم في بيولوجيا الخلايا الجذعية وتقنيات زراعة 3D في المختبر بثورة في علم الأحياء والطب. أصبحت نماذج الخلايا عالية التعقيد في 3D شائعة جدا لأنها تسمح للخلايا بالنمو والتفاعل مع إطار خارج الخلية المحيط ، مما يلخص عن كثب جوانب الأنسجة الحية بما في ذلك هندستها المعمارية وتنظيم الخلايا وتفاعلاتها ، أو حتى خصائص الانتشار. على هذا النحو ، يمكن أن توفر نماذج زراعة الخلايا 3D رؤى فريدة حول سلوك الخلايا في الأنسجة النامية أو المريضة في المختبر. العضويات والكروية كلاهما هياكل ثلاثية الأبعاد متعددة الخلايا ، تتراوح من عدة ميكرومتر إلى ملليمترات ، وهي الأبرز في الهياكل ثلاثية الأبعاد في المختبر. يمكن استزراع كلاهما داخل سقالة داعمة بما في ذلك (i) الهلاميات المائية المشتقة من الحيوانات (مستخلص الغشاء القاعدي ، الكولاجين) ، النباتات (الجينات / الأغاروز) ، أو توليفها من المواد الكيميائية ، أو (ii) المصفوفات الخاملة التي تحتوي على مسام لتعزيز تكاثر الخلايا ونموها.
يمكن أن تتطور الكائنات العضوية والكروية أيضا دون وجود سقالة داعمة من خلال الاعتماد على الخلايا للتجميع الذاتي في مجموعات. يعتمد هذا على تقنيات مختلفة مثل استخدام مواد غير لاصقة لمنع ارتباط الخلية والتوتر السطحي وقوة الجاذبية (على سبيل المثال ، تقنيات الإسقاط المعلق) ، أو الدوران الدائري المستمر للأوعية (على سبيل المثال ، ثقافة الغزل). في جميع الحالات ، تسهل هذه التقنيات تفاعلات الخلية الخلوية ومصفوفة الخلية للتغلب على قيود ثقافة الخلايا أحادية الطبقة التقليدية1. تم استخدام المصطلحين "organoids" و "spheroids" بالتبادل في الماضي ، ولكن هناك اختلافات رئيسية بين هذين النموذجين لثقافة الخلايا 3D. الكائنات العضوية هي مجموعات خلوية 3D في المختبر مشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات أو الخلايا الجذعية الخاصة بالأنسجة ، حيث تنظم الخلايا نفسها تلقائيا في أسلاف وأنواع خلايا متمايزة والتي تلخص على الأقل بعض وظائف الجهاز محل الاهتمام2. تشتمل الأجسام الكروية على مجموعة واسعة من الهياكل ثلاثية الأبعاد متعددة الخلايا التي تشكلت في ظل ظروف غير ملتصقة ويمكن أن تنشأ من مجموعة كبيرة ومتنوعة من أنواع الخلايا مثل خطوط الخلايا الخالدة أو الخلايا الأولية3. ومن ثم ، فإن الكائنات العضوية المتأصلة في أصول الخلايا الجذعية الجوهرية لها ميل أعلى للتجميع الذاتي والجدوى والاستقرار من الأجسام الكروية.
ومع ذلك ، في جوهرها ، هذان النموذجان عبارة عن هياكل 3D تتكون من خلايا متعددة ، وبالتالي فإن التقنيات التي تم تطويرها لدراستها متشابهة جدا. على سبيل المثال ، تعد أساليب التصوير القوية على مستوى دقة الخلية الواحدة ضرورية للتحقق من التعقيد الخلوي لكل من المواد العضوية والكروية. هنا ، من خلال تلخيص خبرة هذه المجموعة وخبرة القادة في مجال العضويات4 ، تصف هذه الورقة الإجراءات التفصيلية لأداء تلطيخ ثنائي الأبعاد (2D) و 3D بالكامل ، والتصوير ، وتحليل التركيب الخلوي ودون الخلوي والتنظيم المكاني للعضويات والكروية التي تتراوح من 100 ميكرومتر إلى عدة ملليمترات. في الواقع ، يقدم هذا الإجراء نوعين مختلفين ومتكاملين من التلوين واكتساب التصوير لتحليل مجموعة كبيرة ومتنوعة من أحجام وأنواع نماذج زراعة الخلايا 3D في المختبر. يعتمد استخدام أحدهما (تحليل 3D بالكامل) أو الآخر (تحليل قسم 2D) على النموذج المدروس والإجابات المطلوبة. يمكن تطبيق التحليل الكامل ثلاثي الأبعاد بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر ، على سبيل المثال ، لتصور الخلايا في ثقافة ثلاثية الأبعاد يصل عمقها إلى 200 ميكرومتر ، بغض النظر عن الحجم الكلي للهيكل ثلاثي الأبعاد ، في حين أن تحليل أقسام ثنائية الأبعاد يوفر نظرة ثاقبة للعينات من أي حجم ، وإن كان ذلك على مستوى 2D. تم تطبيق هذا الإجراء بنجاح عبر مجموعة متنوعة من المواد العضوية4،5 والأجسام الكروية المشتقة من الخلايا البشرية والفئران ، والتي نشأت من طبقات جرثومية جنينية مختلفة. تظهر نظرة عامة على الإجراء في الشكل 1. يشار إلى المراحل الرئيسية والعلاقات بينها والخطوات الحاسمة والتوقيت المتوقع.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig01.jpg"> الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية على الإجراء. يتم جمع نماذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد في المختبر وتثبيتها ، ثم يتم إعدادها إما لتلطيخ التركيب الكامل ثلاثي الأبعاد (الخيار أ) أو تضمينها في البارافين للتقسيم والتلوين ثنائي الأبعاد (الخيار ب). بالنسبة لتجارب التلوين ثلاثية الأبعاد ، يتم تصنيف الهياكل ثلاثية الأبعاد الثابتة باتباع خطوة التثبيت. يمكن تنفيذ خطوة اختيارية للمسح البصري لتحسين جودة التصوير وعمق الفحص المجهري الضوئي عن طريق تقليل تشتت الضوء أثناء معالجة الصور. يتم التقاط الصور على مجهر متحد البؤر مقلوب أو نظام محتوى عالي متحد البؤر وتحليلها باستخدام البرنامج المناسب. بالنسبة لتضمين البارافين ، تتم معالجة الهياكل ثلاثية الأبعاد مباشرة (الخيار b.1 للهياكل الكبيرة ≥ 400 ميكرومتر) أو تضمينها في هلام (b.2 ؛ هياكل صغيرة ≤ 400 ميكرومتر) للجفاف وتضمين البارافين. ثم يتم قطع كتل البارافين وتلطيخها (تلطيخ نسيجي أو كيميائي مناعي). يتم الحصول على صور لأقسام 2D على ماسح ضوئي رقمي للشرائح أو مجهر مستقيم ويتم تحليلها على منصة تحليل الصور باستخدام التحليل الكمي الرقمي السريع. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig01large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy pad Q Path blue</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes macrostar III Blc couv. Char. x1500</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassette microtwin white</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical hood</td>
			<td>Erlab</td>
			<td>FI82 5585-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips 1000 &#181;L</td>
			<td>Star lab Tip-One</td>
			<td>S1122-1730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Pyramid innovation</td>
			<td>R35002-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottom glass tubes with PTFE lined 2 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11784259</td>
			<td>Excellent&#160; for environmental&#160;&#160;&#160; samples,&#160;&#160;&#160; pharmaceuticals and diagnostic reagents. PTFE is designed for the ultimate in product safety. PTFE provides totally inert inner seal and surface facing the sample or product.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish plate 35 mm</td>
			<td>Ibedi</td>
			<td>2018003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal agitation</td>
			<td>N-BIOTEK</td>
			<td>NB-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator prewarmed to 65 &#176;C</td>
			<td>Memmert Incubator</td>
			<td>LAB129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inox molds 15x15</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-1918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides Matsunami TOMO-11/90</td>
			<td>Roche diagnostics</td>
			<td>8082286001</td>
			<td>these slides are used for a better adhesion of sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>HM340E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panoramic scan II</td>
			<td>3dhistech</td>
			<td>2397612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin embedding equipment</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette Pasteur 2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Path flacon 150mL cape blanc x250</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-1308</td>
			<td>Good for environmental&#160;&#160;&#160; samples,&#160;&#160;&#160; pharmaceuticals and diagnostic reagents. Polypropylene (PP) are rigid,&#160; solid, provide excellent&#160; stress&#160; crack&#160; and&#160; impact&#160; resistance and have a&#160; good oil and alcohol barrier and chemical resistance. PE-lined cap is stress crack resistant and offers&#160; excellent&#160; sealing&#160; characteristics.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Set of micropipettors&#160; (p200, p1000)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11877351 (20-200) 11887351(p1000)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPERA PHENIX</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>HH14000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP5 inverted confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LSM780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue cassette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-0228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiomager microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SIP 60549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoblock (kit)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10066588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57648266</td>
			<td>CAUTION: toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin aqueous 1%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT110316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83804.360</td>
			<td>CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.365</td>
			<td>CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin 4%</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>F/40877-36</td>
			<td>CAUTION: Formalin contains formaldehyde which is hazardous. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fructose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gill hematoxylin type II</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>F/CP813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td>CAUTION: Suspected of causing genetic defects.&#160; Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Wax tek III</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS) 1 X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Buffered Saline (TBS) 10X</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>F/00801</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8532</td>
			<td>CAUTION: Triton X&#173;100 is hazardous. Avoid contact with skin and eyes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>534056</td>
			<td>CAUTION: Xylene is toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Clearing solution</td>
			<td>Glycerol-Fructose clearing solution is 60% (vol/w) glycerol and 2.5 M fructose. To prepare 10 mL of this solution, mix 6 mL of glycerol and 4.5 g of fructose. Complete to 10 mL with dH2O. Use a magnetic stirrer overnight. Refractive index = 1.4688 at room temperature (RT: 19&#8211;23 &#176;C). Store at 4 &#176;C in dark for up to 1 month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">PBS-BSA 0,1% solution</td>
			<td>To prepare 0,1% (vol/wt) PBS-BSA 0,1% solution, dissolve 500 mg of BSA in 50 mL of PBS-1X (store at 4&#176;C for up to 2 weeks). And dilute 1mL of this solution into 9mL of PBS-1X. This solution can be used to precoat the tip and centrifugation tube.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Permeabilisation-blocking solution (PB solution)</td>
			<td>The PBSDT blocking solution is PBS-1X supplemented with 0.1% &#8211; 1% Tritonx-100 (depending on the protein localization membrane/nucleus), 1% DMSO, 1% BSA and 1% donkey serum (or from the animal in which the secondary antibodies were raised). This solution can be stored at 4&#176;C for up to 1 month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">PB:PBS-1X &#160;(1:10) solution</td>
			<td>PB:PBS-1X &#160;(1:10) solution is a 10 time diluted PB solution. To prepare 10 mL of this solution dilute 1 mL of PB solution in 9 mL of PBS-1X.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halo software</td>
			<td>Indicalabs</td>
			<td>NM 87114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harmony software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>HH17000010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

staining and high-resolution imaging of three-dimensional organoid and spheroid models

تعد نماذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد (3D) في المختبر ، مثل الكائنات العضوية والكروية ، أدوات قيمة للعديد من التطبيقات بما في ذلك التطوير ونمذجة الأمراض واكتشاف الأدوية والطب التجديدي. لاستغلال هذه النماذج بشكل كامل ، من الأهمية بمكان دراستها على المستويين الخلوي ودون الخلوي. ومع ذلك ، فإن توصيف نماذج زراعة الخلايا 3D في المختبر يمكن أن يكون تحديا تقنيا ويتطلب خبرة محددة لإجراء تحليلات فعالة. هنا ، تقدم هذه الورقة بروتوكولات مفصلة وقوية وتكميلية لأداء التصوير الملطخ والدقة تحت الخلوية لنماذج زراعة الخلايا 3D الثابتة في المختبر والتي تتراوح من 100 ميكرومتر إلى عدة ملليمترات. تنطبق هذه البروتوكولات على مجموعة واسعة من المواد العضوية والكروية التي تختلف في خلاياها الأصلية ومورفولوجيتها وظروف الثقافة. من حصاد هيكل 3D إلى تحليل الصور ، يمكن إكمال هذه البروتوكولات في غضون 4-5 أيام. باختصار ، يتم جمع الهياكل ثلاثية الأبعاد وتثبيتها ، ويمكن بعد ذلك معالجتها إما من خلال تضمين البارافين والتلوين النسيجي / المناعي الكيميائي ، أو مباشرة مناعية وإعدادها للمقاصة البصرية وإعادة البناء ثلاثي الأبعاد (عمق 200 ميكرومتر) بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر.

يوفر هذا البروتوكول نظرة عامة على الخطوات الحاسمة للتلطيخ الكامل 2D و 3D ، بالإضافة إلى التصوير والتحليلات الكمية لنماذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد (الشكل 3 والشكل 4). وهو قابل للتطبيق على مجموعة واسعة من نماذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد - من الأجسام الكروية إلى الكائنات العضوية من أنواع أو أنسجة مضيفة مختلفة - ويتيح الحصول على معلومات دقيقة وكمية عن الهندسة المعمارية وتنظيم الخلايا والتفاعلات على المستويات الخلوية ودون الخلوية (الشكل 3 والشكل 4). قد تحتاج المختبرات إلى تحسين التقنيات النسيجية والكيميائية المناعية 2D وتركيزات الأجسام المضادة وفقا لاحتياجاتها الخاصة.
كلتا الطريقتين تسفر عن معلومات بيولوجية قيمة. يوفر التلوين الكامل ثلاثي الأبعاد والفحص المجهري متحد البؤر معلومات مرئية عن التركيب الخلوي والموقع المكاني مع مجال عمق يصل إلى 200 ميكرومتر (الشكل 3B). ومع ذلك ، فإن التقسيم 2D مناسب للهياكل ثلاثية الأبعاد الأكبر حجما للكشف عن السمات المورفولوجية الخلوية التفصيلية في القسم بأكمله من الهياكل ثلاثية الأبعاد التي قد يكون من الصعب ملاحظتها في الموقع بسبب تشتت الضوء الذي يضر بالدقة في عينات أكبر. علاوة على ذلك ، يمكن أن توفر كلتا التقنيتين بيانات كمية. في الواقع ، تسمح الدقة التي تم الحصول عليها بتطبيق خوارزميات التجزئة الخلوية ودون الخلوية لتحديد عدد الخلايا والكشف عن وجود علامات خلوية مختلفة في أنواع فرعية خلوية مختلفة (الشكل 3F والشكل 4). باختصار ، تقنيات التصوير الموصوفة هنا قابلة للتكرار وبسيطة ومتكاملة وتمثل أدوات قيمة لدراسة عدم التجانس الخلوي.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig03.jpg"> الشكل 3: النتائج التمثيلية للتركيب الكامل ثلاثي الأبعاد والتصوير والتحليلات للأقسام البصرية ثلاثية الأبعاد و 2 دي . (أ) صور متحدة البؤر للإنسان (ح) ورم دبقي كروي عالي الدرجة مستزرع لمدة أسبوع وموسوم ب Hoechst (أزرق) و Olig2 (أصفر) وأكتين (أحمر) (هدف مائي 20x). بالنسبة لجميع الصور التي تم الحصول عليها ، تم إنشاء إعدادات المجهر باستخدام عنصر تحكم إيجابي (أعلى) ، ثم تم تصوير عنصر التحكم السلبي باستخدام إعدادات متطابقة للتحكم في نقص التألق في غياب الجسم المضاد الأساسي (أسفل). (ب) تمثيل متعامد 3D كامل التركيب لتلطيخ Ki67 يتم إجراؤه في (ح) الورم الدبقي الكروي عالي الجودة المزروع لمدة أسبوع (إزالة الجلسرين والفركتوز ؛ هدف 20x مائي ، بؤري). (ج) صور متحدة البؤر ل (ح) الورم الدبقي عالي الدرجة الكروي المزروع لمدة أسبوع والموسومة ب Hoechst (أزرق) ، Olig2 (أصفر) ، و Phalloidine-488 (أخضر) (إزالة الجلسرين والفركتوز ؛ هدف مائي 20x). (د) صور متحدة البؤر للأورام الكروية البشرية (ح) العضلية المخططة (أعلى) والفأر (م) خلية القمة العصبية (أسفل) المستزرعة لمدة أسبوع والموسومة ب Hoechst (الأزرق) والأكتين (الأحمر) و Ki67 (الأخضر) ، على التوالي (إزالة الجلسرين والفركتوز ؛ 20x الهدف الجاف). (ه) صور متحدة البؤر ل (ح) ورم دبقي كروي عالي الدرجة مستزرع لمدة أسبوع وموسوم ب Hoechst (أزرق) و Ki67 (أخضر) (إزالة الجلسرين والفركتوز ؛ هدف الماء 40x) (أعلى اليسار). تم إنشاء صور مجزأة على قناة Hoechst والمناطق النووية الإيجابية Ki67 (+) على القناة الخضراء باستخدام برنامج تحليل عالي المحتوى (انظر الشكل التكميلي 1 وجدول المواد) (أسفل). الناتج المعطى هو النسبة المئوية لنوى Ki67 + لكل بنية 3D مجزأة (أعلى اليمين). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig03large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig04.jpg"> الشكل 4: النتائج التمثيلية لتصوير وتحليل المقاطع البصرية ثنائية الأبعاد. (أ ، د) صور مقطع 2D لنموذج خلية ثلاثية الأبعاد (ساركوما عضلية مخططة بشرية مستزرعة لمدة شهر) تم الحصول عليها باستخدام ماسح ضوئي رقمي للشرائح وتحليلها على منصة للتحليل الكمي الرقمي السريع. (أ) تلطيخ H&E والكشف عن الخلايا حسب حجمها. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. (B) يظهر الرسم البياني النسبة المئوية للخلايا < 100 ميكرومتر 2 و > 100 ميكرومتر2 المكتشفة باستخدام برنامج للتحليل الكمي الرقمي السريع (يسار: Halo) أو العد اليدوي (يمين: MC). (C) تلطيخ Ki67 والكشف عن الخلايا وفقا لشدة إشارة 3،3'-diaminobenzidine (DAB). سلبي (أزرق) ، إيجابي ضعيف (أصفر) ، إيجابي (أحمر). شريط المقياس = 500 ميكرومتر. (D) يظهر الرسم البياني النسبة المئوية للخلايا السالبة Ki67 والإيجابية الضعيفة والموجبة. الاختصارات: H&E = الهيماتوكسيلين ويوزين. MC = العد اليدوي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig04large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
الشكل التكميلي 1: نظرة عامة على الخطوات في برنامج تحليل التصوير. تستند التحليلات إلى ارتباط اللبنات الأساسية. كل لبنة بناء تتوافق مع تجزئة الوظيفة ، والحساب ، والارتباط ، وتعريف الإخراج - وتقدم خوارزميات متعددة واختيارات متغيرة لمطابقة العينة البيولوجية التي يتم تصويرها. يوفر البرنامج بروتوكولات تحليل RMS (الحل الجاهز) المتعددة التي يمكن استخدامها وتعديلها بسهولة. يمكن حفظ بروتوكولات تحليل الصور المتكاملة وتطبيقها على مجموعات بيانات مختلفة ومشاركتها بين المستخدمين. باختصار ، يتضمن بروتوكول التحليل تجزئة الكائنات المتسلسلة: كروية ، نوى وأخيرا ، جيوب Ki67 (A488). بعد ذلك ، يتم حساب متوسط شدة جيوب Ki67 لزيادة التمييز بين الأحداث الإيجابية. أخيرا ، يتم اختيار النوى التي تشمل جيوب Ki67 الإيجابية بشكل إيجابي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/Suppl1_Harmony%20analysis_Revised.pdf" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>
الشكل التكميلي 2: نظرة عامة على خطوات إجراء برنامج التحليل الكمي. الخطوة 1. قم بتحميل الملفات باستخدام علامة التبويب دراسات . سيتم فتح الملفات في قسم إجراءات الصورة . الخطوة 2. افتح علامة التبويب التعليقات التوضيحية ، ثم انقر فوق إجراءات الطبقة لتصميم طبقة جديدة في جميع أنحاء الهيكل باستخدام أداة الدائرة لشريط الأدوات. بالنسبة للهياكل غير الدائرية ، يمكن استخدام أداة القلم بدلا من ذلك. الخطوه 3. يمكن استخدام شريط الأدوات لتصميم التعليقات التوضيحية وتصور القياس الكمي باستخدام <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62280/62280eq01.jpg">الأداة. الخطوة 4. افتح علامة التبويب تحليل ، وحدد أفضل الظروف لتحليل العينة (قد تكون هناك حاجة إلى عدة تجارب هنا). الخطوة 4.1. استخدم قسم اختيار البقع لإعداد حالة التلطيخ. في حالة وجود عدة بقع ، يمكن إضافتها وإعادة تسميتها ، ويمكن تعديل اللون الافتراضي . يمكن تحديد الكشف عن التوطين - تلطيخ نووي أو سيتوبلازم. الخطوة 4.2. استخدم قسم اكتشاف الخلايا لإعداد اكتشاف الخلايا . سيكون هذا القسم هو الأهم للتحليل. سيمكن قسم عتبة التباين النووي من اكتشاف جميع النوى. يجب الانتباه في حالة وجود أحجام سكانية متعددة ، يمكن للبرنامج اكتشاف عدة خلايا بدلا من خلية كبيرة فريدة. يمكن استخدام أقسام عدوانية الحجم النووي والتجزئة النووية لتحديد نطاقات حجم الخلايا السكانية. الخطوة 5. وصف حول كيفية تشغيل تحليل العينة. اتبع الخطوات الموضحة في الشكل. سيقوم قسم طبقة التعليقات التوضيحية بتشغيل الإعداد فقط على هذه الشريحة. يمكن تصور القياس الكمي باستخدام <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62280/62280eq01.jpg">الأداة. كرر الخطوات 4.1-5 حتى يتم تحقيق القياس الكمي المناسب. الخطوات 6-6.1. تمكنك هذه الخطوات من رسم شكل باستخدام البرنامج. الخطوة 7. يمكن حفظ رسومات القياس الكمي التي تم الحصول عليها عبر البرنامج. الخطوة 8. يمكن تصدير البيانات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/Suppl2_Halo%20Images_revised.pdf" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models at JoVE.com

Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

هنا ، نقدم بروتوكولات مفصلة وقوية وتكميلية لأداء التصوير الملطخ والدقة تحت الخلوية لنماذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد الثابتة التي تتراوح من 100 ميكرومتر إلى عدة ملليمترات ، مما يتيح تصور مورفولوجيتها وتكوينها من نوع الخلية وتفاعلاتها.

تلطيخ وتصوير عالي الدقة لنماذج عضوية وكروية ثلاثية الأبعاد

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...

يعد توصيف نموذج 3D في المختبر بدقة خلوية ودون خلوية أمرا بالغ الأهمية للاستغلال الكامل ، ولكنه قد يكون صعبا. لذلك ، قدمنا بروتوكولا مجانيا للتصوير الملطخ والدقة تحت الخلوية لنماذج 3D الثابتة في المختبر التي تتراوح من 100 ميكرومتر إلى عدة ملليمترات. هياكل 3D شعاعية ، ويجب التلاعب بها بعناية.قبل سحب العينات ، تحقق من موقع هياكل 3D الخاصة بك داخل الأنبوب لتجنب أي طموح. نظرا لأننا قمنا بتكييف التقنيات الكلاسيكية لتضمين الهياكل الصغيرة مثل الكائنات العضوية أو الكروية ، يمكن أن تساعد التعليمات المرئية المستخدمين لأول مرة على أداء المهمة بسهولة أكبر. ستوضح الإجراء معي لورا فرانكولز ، وهي تقنية معملية من منصة أبحاث علم الأمراض.لتحضير عينات لتلطيخ التثبيت الكامل ثلاثي الأبعاد ، استخدم طرف ماصة واحد ملليلتر مشفر مسبقا باستخدام BSA لإضافة تعليق هيكل ثلاثي الأبعاد ملليلتر واحد إلى أنبوب سعة 500 ميكرولتر من PBS. عندما تستقر الهياكل ثلاثية الأبعاد في قاع الأنبوب ، استبدل PBS بعناية ب 500 ميكرولتر من محلول منع النفاذية لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع تحريض أفقي لطيف بمعدل 30 إلى 50 دورة في الدقيقة. في نهاية الحضانة ، اسمح للهياكل ثلاثية الأبعاد بالرواسب مرة أخرى قبل غسل الهياكل ثلاثية الأبعاد بعناية مرتين في ملليلتر واحد من 0.1٪ PBS مع BSA لمدة ثلاث دقائق لكل غسلة.بعد الغسيل الأخير ، قم بتسمية الهياكل ثلاثية الأبعاد ب 250 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية في PBS لمدة يومين إلى ثلاثة أيام مع تحريض أفقي لطيف عند أربع درجات مئوية. في نهاية الحضانة ، اغسل العينة بخمس غسلات لمدة ثلاث دقائق وغسلتين لمدة 15 دقيقة في ملليلتر واحد من 0.1٪ PBS BSA لكل غسلة. بعد الغسيل الأخير ، قم بتسمية الهياكل ثلاثية الأبعاد ب 250 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المناسب في PBS لمدة 24 ساعة عند أربع درجات مئوية مع تحريض أفقي لطيف محمي من الضوء.في اليوم التالي ، قم بتسمية الهياكل ثلاثية الأبعاد ب 250 ميكرولتر من التركيز المناسب ل Hoechst 3342 لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية مع تحريض أفقي لطيف. في نهاية الحضانة ، اغسل الهياكل ثلاثية الأبعاد خمس مرات لمدة ثلاث دقائق ومرتين لمدة 15 دقيقة في ملليلتر واحد من PBS لكل غسلة كما هو موضح. بعد الغسيل الأخير ، انقل هياكل 3D إلى صفيحة دقيقة من البوليسترين الأسود 96 جيدا ، وأضف برفق 200 ميكرولتر من محلول التطهير على الهياكل ، وتجنب الفقاعات.ثم ضع اللوحة مغطاة بورق الألمنيوم عند أربع درجات مئوية لمدة 48 ساعة على الأقل. لتضمين نماذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد الكبيرة ، استخدم طرف ماصة واحد ملليلتر مطلي ب BSA لنقل الهياكل ثلاثية الأبعاد بعناية إلى أنبوب زجاجي مسطح القاع مع غطاء زجاجة مبطن ب PTFE. بعد استقرار الهياكل ، استبدل PBS بعناية بنسبة 70٪ من الإيثانول لحضانة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.في نهاية الحضانة ، استبدل 70٪ من الإيثانول بملليلتر واحد من محلول eosin Y الجاهز للاستخدام. نفض الغبار عن الأنبوب وتلطيخ الهياكل لمدة 30 دقيقة على الأقل. في نهاية الحضانة ، قم بتجفيف الهياكل بثلاث غسلات متتالية لمدة 30 دقيقة في ملليلتر واحد من الإيثانول بنسبة 100٪ لكل غسلة.بعد الجفاف الأخير ، قم بمسح الهياكل ثلاثية الأبعاد بثلاث غسلات متتالية لمدة 30 دقيقة في ملليلتر واحد من الزيلين لكل غسلة تحت غطاء كيميائي. بعد الغمر الأخير بالزيلين ، ضع قطعة من وسادة الخزعة المنقوعة بالزيلين في حجرة واحدة من شريط نسيج microtwin أبيض ، واستخدم ماصة باستور بلاستيكية مطلية ب BSA بسعة 2 ملليلتر لنقل هياكل 3D إلى الوسادة. قم بتغطية الهياكل ثلاثية الأبعاد بوسادة خزعة أخرى مبللة بالزيلين لتثبيت الهياكل ثلاثية الأبعاد في مكانها وإغلاق الكاسيت.عندما يتم نقل جميع العينات ، ضع الكاسيتات في حمام بارافين 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل وضع الكاسيت في حمام بارافين طازج 65 درجة مئوية طوال الليل. في صباح اليوم التالي ، أضف البارافين السائل إلى قالب تضمين دافئ واحد 65 درجة مئوية لكل عينة ، وضع عينة واحدة مدمجة من البارافين في كل قالب. حرك القوالب برفق حتى تسقط جميع الهياكل ثلاثية الأبعاد إلى القيعان ، واستخدم ملقط ناعم دافئ 65 درجة مئوية لوضع الهياكل ثلاثية الأبعاد في وسط كل قالب.قم بتبريد القالب حتى يشكل البارافين طبقة صلبة رقيقة ، مما يثبت بنية 3D في مكانها. ضع شريط مناديل وأضف البارافين الساخن فوق القالب. قم بإزالة القالب عندما يصلب البارافين تماما.لتضمين نماذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد الصغيرة ، اغسل الهياكل ثلاثية الأبعاد برفق ثلاث مرات في ملليلتر واحد من TBS لكل غسلة. بعد الغسيل الأخير ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من TBS دون لمس الهياكل ، وأضف قطرتين من الكاشف الثاني من مجموعة تضمين البارافين التجارية. امزج بلطف عن طريق النقر ، وأضف قطرتين من الكاشف مع النقر حتى يصلب الجل.استخدم ملقط ناعم لنقل الجل من بئر الكاسيت المجمع مسبقا من المجموعة ، وقم بتجفيف عينة الجل المدمجة بحضانة الإيثانول والزيلين الصاعدة لمدة 30 دقيقة في غطاء الدخان كما هو موضح. بعد غمر الزيلين الأخير ، ضع الكاسيت في حمام بارافين 65 درجة مئوية طوال الليل قبل استخدام ملقط ناعم لنقل عينة البارافين المضمنة إلى وسط قالب تضمين سائل محمل بالبارافين 65 درجة مئوية. ثم قم بتأمين بنية ثلاثية الأبعاد بطبقة أخرى من البارافين كما هو موضح في نماذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد الكبيرة.يوفر تلطيخ جبل كامل ثلاثي الأبعاد والمجهر متحد البؤر معلومات مرئية حول التركيب الخلوي والموقع المكاني لنماذج الثقافة ثلاثية الأبعاد إلى مجال عمق يصل إلى 200 ميكرون. تسمح الدقة العالية التي يمكن الحصول عليها لهياكل 3D باستخدام هذا البروتوكول بتطبيق خوارزميات التجزئة الخلوية ودون الخلوية لتحديد عدد الخلية والكشف عن علامات الخلايا المختلفة داخل أنواع فرعية مختلفة من الخلايا. يمكن تطبيق تحليل حوامل كاملة 3D على الخلايا المرئية التي يصل عمقها إلى 200 ميكرون ، بغض النظر عن الهياكل بأكملها.على العكس من ذلك ، يمكن أن يوفر تحليل قسم 2D نظرة ثاقبة للخلايا من أي حجم.

Research

JoVE Journal

Biology

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

عالية الدقة قياس سلوك رائحة يحركها يرقات ذبابة الفاكهة في

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

الخلية العصبية من الثقافات Aplysia عن التصوير عالية الدقة من المخاريط النمو

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the IÃƒâ€šÃ‚Â·Cryo Kit

الماوس حفظ بالبرودة والانتعاش الحيوانات المنوية باستخدام · لقد كرو كيت

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

عزل الخلايا الظهارية الثديية من ثلاثي الأبعاد الخلايا المختلطة الجسم الشبه الكروي ثقافة المشارك

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

عامين والتصوير الثلاثي الابعاد لايف خلية من البروتينات DNA الاستجابة الأضرار

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

على المدى الطويل، عالية الدقة الفاصل الزمني متحد البؤر التصوير من<em&gt; الطفلق ل arabidopsis</em&gt; البشرة خلال إنبات

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

باستخدام التصوير المقطعي عالي الدقة لتصور البنية الثلاثية وظيفة الأوعية الدموية النباتية

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

نظام الثقافة الماوس الجنين الأمعاء الجامعة ل<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; التلاعب في مسارات إشارات وتصوير لايف ثلاثي الأبعاد التنمية الزغبة

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

الحنق التصوير في الهلاميات المائية ثلاثية الأبعاد

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

عالية الدقة التصوير الوقت الفاصل بين وتحليل الآلي للأنيبيب حيوية في المعيشة السري الإنسان خلايا الوريد غشائي

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...