Name: staining and high-resolution imaging of three-dimensional organoid and spheroid models
Uploaded: 2021-03-27T14:00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af St Baldrick's Robert J. Arceci Innovation Award #604303.

<ol>
	<li>Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+system+methods+and+applications+for+mesenchymal+stem+cells.">Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells.</a> Cells. 8 (12), 1-13 (2019).</li><li>Bartfeld, S., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+organoids+and+their+application+for+medical+research+and+patient+treatment.">Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment.</a> Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).</li><li>Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+multicellular+spheroids+formation.">Advances in multicellular spheroids formation.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 14 (127), (2017).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation.">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1724-1743 (2016).</li><li>Rezanejad, H., Lock, J. H., Sullivan, B. A., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+pancreatic+ductal+organoids+and+whole-mount+immunostaining+of+intact+organoids.">Generation of pancreatic ductal organoids and whole-mount immunostaining of intact organoids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 82 (2019).</li><li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+systems+and+their+applications+in+drug+discovery+and+cell-based+biosensors.">Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).</li><li>McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+and+assessment+of+human+primary+prostate+organoid+culture.">Handling and assessment of human primary prostate organoid culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e59051 (2019).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li><li>Lazzari, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+fluorescence+microscopy+versus+confocal+microscopy:+in+quest+of+a+suitable+tool+to+assess+drug+and+nanomedicine+penetration+into+multicellular+tumor+spheroids.">Light sheet fluorescence microscopy versus confocal microscopy: in quest of a suitable tool to assess drug and nanomedicine penetration into multicellular tumor spheroids.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 142, 195-203 (2019).</li><li>Gabriel, J., Brennan, D., Elisseeff, J. H., Beachley, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+embedding/sectioning+for+parallel+analysis+of+3D+cell+spheroids.">Microarray embedding/sectioning for parallel analysis of 3D cell spheroids.</a> Scientific Reports. 9, 16287 (2019).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Cellekultur er et uundværligt redskab til at afdække grundlæggende biologiske mekanismer involveret i vævs- og organudvikling, funktion, regenerering og forstyrrelse og sygdom. Selvom monolaget 2D-cellekultur har domineret, har nyere forskning skiftet mod kulturer, der genererer 3D-strukturer, der mere afspejler in vivo-cellulære reaktioner, især på grund af yderligere rumlig organisation og celle-cellekontakter, der påvirker genekspression og cellulær adfærd og dermed kunne give mere prædiktive data7. Ikke desto mindre er der stadig mange udfordringer, herunder behovet for brugervenlige farvnings- og billeddannelsesteknikker til detaljeret mikroskopisk visualisering og evaluering af komplekse 3D-strukturer på cellulært og subcellulært niveau. I den sammenhæng er detaljerede, robuste og komplementære protokoller blevet leveret til at udføre farvning og cellulær og subcellulær opløsningsbilleddannelse af faste in vitro 3D-cellekulturmodeller, der spænder fra 100 μm til flere millimeter i størrelse.
Denne procedure præsenterer to forskellige strategier til at håndtere en lang række størrelser og typer af in vitro 3D-cellekulturmodeller. Valget af den ene (3D-helmonteringsanalyse) eller den anden (2D-sektionsanalyse) afhænger af den anvendte model og det undersøgte problem. 3D-helmonteringsanalyse ved konfokalmikroskopi muliggør visualisering af celler med et dybdefelt på op til 200 μm, uanset den samlede størrelse af 3D-strukturen, mens 2D-sektionering kan anvendes til prøver af enhver størrelse, men visualisering forbliver 2D-dimensionel. Nedenfor er nogle forslag til fejlfinding og tekniske overvejelser.
Tab af 3D-strukturer under arbejdsgangen er den mest almindelige ulempe. De kan forblive klæbende til spidserne og rørene, hvorfor forbelægningsspidser og rør med PBS-BSA 0,1% opløsning er nøglen. Desuden er det afgørende at lade 3D-strukturerne sedimentere mellem reagensændringer og udføre al pipettering meget omhyggeligt. Som nævnt i proceduren kan celler for alle trin, hvis 3D-struktursedimentering er for lang, forsigtigt spindes ved 50 × g i 5 minutter ved RT. Afhængigt af formålet med undersøgelsen bør fordele / ulemper ved et sådant spindetrin overvejes, da centrifugering kan kompromittere formen på 3D-strukturerne. Desuden bør man sørge for at bevare denne morfologi under fikseringstrinnet, fordi cystiske organoider har tendens til at kollapse. Fastgørelse af strukturer under 400 μm i størrelse bør forhindre strukturelle ændringer.
For optimal immunmærkning er genopretning af organoider fra deres 3D-matricer et afgørende skridt. 3D-matrixen kan hindre tilstrækkelig antistofindtrængning eller føre til farvning med høj baggrund på grund af ikke-specifik binding til matrixen. Fjernelse af ECM kan ændre morfologien af de ydre segmenter af organoider (især i tilfælde af små cellulære fremspring, der strækker sig fra studerede 3D-strukturer) og delvist hæmme analyser. For sådanne 3D-strukturer kan matrixen bevares under hele proceduren; Kulturbetingelserne bør dog tilpasses omhyggeligt, så cellerne dyrkes i en minimal matrix, for at undgå utilstrækkelig indtrængning af opløsninger og antistoffer og for at undgå successive vasketrin, der har til formål at reducere overdreven baggrundsstøj 6,8.
Det optiske rydningstrin, der er beskrevet i denne protokol i 3D-farveafsnittet for hele monteringen, er relevant for billeddannelse af 3D-strukturer op til 150-200 μm i dybden i stedet for 50-80 μm uden rydning. Sammenlignet med andre clearingmetoder, der ofte kræver flere uger og anvender giftige clearingmidler, blev der anvendt et tidligere offentliggjort hurtigt og sikkert clearingtrin i denne protokol 4,9. Derudover er dette clearingtrin reversibelt, og nye antistoffer kan tilføjes til den oprindelige farvning uden tab af opløsning eller lysstyrke4. Afhængigt af den undersøgte 3D-cellekulturmodel er en dybde på 150-200 μm muligvis ikke tilstrækkelig til at afbilde 3D-strukturen på en informativ måde, og denne clearingprotokol kan forårsage ændringer i den generelle morfologi af sfæriske, enkeltlagede organoider med store lumen4. Brugere bør omhyggeligt designe deres eksperiment og om nødvendigt optimere timingen af permeabiliserings- / blokeringstrinnet (for at tillade penetration af antistoffer og opløsning), clearingtrinnet (for at trænge dybere end 200 μm skal prøver ryddes fuldstændigt) og billedoptagelse. De to mest udbredte teknologier, der er tilgængelige i kernefaciliteter, ville være lysark og konfokal mikroskopi. Brugere skal omhyggeligt vælge en teknologi baseret på størrelsen af deres 3D-strukturer og deres biologiske spørgsmål10. Sammenlignet med konfokal mikroskopi forbliver lysarkmikroskopiopløsning opnået for sådanne dybe strukturer imidlertid suboptimal til opnåelse af subcellulær opløsning.
Her er der rapporteret om en detaljeret og robust proces, der er dedikeret til paraffinindlejring af enkeltprøver. Interessant nok udviklede Gabriel et al. for nylig en protokol, der indlejrede 3D-cellekulturer i paraffin med en øget gennemstrømning. De brugte en polydimethylsiloxan (PDMS) form til at begrænse 96 3D-strukturer i et mikroarray-mønster i en blok, hvilket gav nye perspektiver til undersøgelser af 3D-tumormodeller, der omfatter flere grupper, tidspunkter, behandlingsbetingelser og replikater11. Denne metode kræver imidlertid omfattende færdigheder og maskiner, især til fremstilling af den forform, der bruges til at skabe PDMS-forme.
Sammenfattende beskriver dette papir to forskellige, komplementære og tilpasningsdygtige tilgange, der muliggør erhvervelse af nøjagtige og kvantitative oplysninger om arkitektonisk og cellulær sammensætning af 3D-cellulære modeller. Begge parametre er afgørende for at studere biologiske processer såsom intratumoral cellulær heterogenitet og dens rolle i resistens over for behandlinger.

I løbet af de sidste årtier har fremskridt inden for stamcellebiologi og in vitro 3D-kulturteknologier indvarslet en revolution inden for biologi og medicin. Cellemodeller med højere kompleksitet i 3D er blevet meget populære, da de tillader celler at vokse og interagere med en omgivende ekstracellulær ramme, der nøje rekapitulerer aspekter af levende væv, herunder deres arkitektur, celleorganisation og interaktioner eller endda diffusionsegenskaber. Som sådan kan 3D-cellekulturmodeller give unik indsigt i cellernes adfærd i udviklende eller syge væv in vitro. Organoider og sfæroider er begge multicellulære 3D-strukturer, der spænder fra flere mikrometer til millimeter, og er de mest fremtrædende in vitro 3D-strukturer. Begge kan dyrkes i et støttestillads, herunder (i) hydrogeler afledt af dyr (kældermembranekstrakt, kollagen), planter (alginat / agarose) eller syntetiseres fra kemikalier eller (ii) inerte matricer indeholdende porer for at fremme celleproliferation og vækst.
Organoider og sfæroider kan også udvikle sig uden tilstedeværelse af et understøttende stillads ved at stole på celler til selvmontering i klynger. Dette er afhængig af forskellige teknikker såsom brugen af ikke-klæbende materialer til at hæmme cellefastgørelse, overfladespænding og tyngdekraft (f.eks. Hængende dråbeteknikker) eller konstant cirkulær rotation af kar (f.eks. Spinnerkultur). I alle tilfælde letter disse teknikker celle-celle- og cellematrixinteraktioner for at overvinde begrænsningerne ved traditionel enkeltlagscellekultur1. Udtrykkene "organoider" og "sfæroider" er tidligere blevet brugt om hverandre, men der er vigtige forskelle mellem disse to 3D-cellekulturmodeller. Organoider er in vitro 3D-cellulære klynger afledt af pluripotente stamceller eller vævsspecifikke stamceller, hvor celler spontant selvorganiserer sig i forfædre og differentierede celletyper, og som rekapitulerer i det mindste nogle funktioner i det pågældende organ2. Sfæroider omfatter en bredere vifte af multicellulære 3D-strukturer dannet under ikke-klæbende forhold og kan opstå fra en stor mangfoldighed af celletyper såsom udødeliggjorte cellelinjer eller primære celler3. Derfor har organoider, der er forbundet med deres iboende stamcelleoprindelse, en højere tilbøjelighed til selvmontering, levedygtighed og stabilitet end sfæroider.
Ikke desto mindre er disse to modeller i det væsentlige 3D-strukturer sammensat af flere celler, og de teknikker, der er udviklet til at studere dem, er således meget ens. For eksempel er kraftige billeddannelsesmetoder på enkeltcelleopløsningsniveauet nødvendige for at undersøge den cellulære kompleksitet af både organoider og sfæroider. Her, ved at opsummere denne gruppes ekspertise og ledere inden for organoider4, beskriver dette papir detaljerede procedurer til at udføre todimensionel (2D) og 3D helmonteret farvning, billeddannelse og analyser af den cellulære og subcellulære sammensætning og rumlige organisering af organoider og sfæroider fra 100 μm til flere millimeter. Faktisk præsenterer denne procedure to forskellige og komplementære typer farvning og billeddannelseserhvervelse til analyse af en lang række størrelser og typer af in vitro 3D-cellekulturmodeller. Brugen af den ene (3D helmonteringsanalyse) eller den anden (2D-sektionsanalyse) afhænger af den undersøgte model og de søgte svar. 3D-helmonteret analyse ved konfokalmikroskopi kan f.eks. anvendes til at visualisere celler i 3D-kultur op til 200 μm dybde, uanset 3D-strukturens samlede størrelse, mens analysen af 2D-sektioner giver indsigt i prøver af enhver størrelse, omend på 2D-niveau. Denne procedure er blevet anvendt med succes på tværs af en række organoider4,5 og sfæroider afledt af humane celler og murinceller, der stammer fra forskellige embryonale kimlag. Oversigten over proceduren er vist i figur 1. De store faser, forholdet mellem dem, afgørende skridt og den forventede timing er angivet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig01.jpg"> Figur 1: Skematisk oversigt over proceduren. In vitro 3D-cellekulturmodeller indsamles og fikseres derefter enten forberedt til 3D-helmonteret farvning (mulighed a) eller indlejret i paraffin til 2D-sektionering og farvning (mulighed b). Til 3D-helmonterede farvningseksperimenter immunmærkes faste 3D-strukturer efter fikseringstrinnet. Et valgfrit optisk rensningstrin kan udføres for at forbedre billedkvaliteten og dybden af optisk mikroskopi ved at reducere lysspredning under billedbehandling. Billeder optages på et omvendt konfokalmikroskop eller et konfokal højindholdssystem og analyseres ved hjælp af den relevante software. Til paraffinindlejring behandles 3D-strukturer direkte (mulighed b.1 for store strukturer ≥ 400 μm) eller indgår i en gel (b.2; små strukturer ≤ 400 μm) til dehydrering og paraffinindlejring. Paraffinblokke skæres derefter og farves (histologisk eller immunokemisk farvning). Billeder af 2D-sektioner opnås på en digital diasscanner eller et opretstående mikroskop og analyseres på en billedanalyseplatform ved hjælp af hurtig digital kvantitativ analyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy pad Q Path blue</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes macrostar III Blc couv. Char. x1500</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassette microtwin white</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical hood</td>
			<td>Erlab</td>
			<td>FI82 5585-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips 1000 &#181;L</td>
			<td>Star lab Tip-One</td>
			<td>S1122-1730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Pyramid innovation</td>
			<td>R35002-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottom glass tubes with PTFE lined 2 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11784259</td>
			<td>Excellent&#160; for environmental&#160;&#160;&#160; samples,&#160;&#160;&#160; pharmaceuticals and diagnostic reagents. PTFE is designed for the ultimate in product safety. PTFE provides totally inert inner seal and surface facing the sample or product.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish plate 35 mm</td>
			<td>Ibedi</td>
			<td>2018003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal agitation</td>
			<td>N-BIOTEK</td>
			<td>NB-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator prewarmed to 65 &#176;C</td>
			<td>Memmert Incubator</td>
			<td>LAB129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inox molds 15x15</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-1918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides Matsunami TOMO-11/90</td>
			<td>Roche diagnostics</td>
			<td>8082286001</td>
			<td>these slides are used for a better adhesion of sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>HM340E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panoramic scan II</td>
			<td>3dhistech</td>
			<td>2397612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin embedding equipment</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette Pasteur 2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Path flacon 150mL cape blanc x250</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-1308</td>
			<td>Good for environmental&#160;&#160;&#160; samples,&#160;&#160;&#160; pharmaceuticals and diagnostic reagents. Polypropylene (PP) are rigid,&#160; solid, provide excellent&#160; stress&#160; crack&#160; and&#160; impact&#160; resistance and have a&#160; good oil and alcohol barrier and chemical resistance. PE-lined cap is stress crack resistant and offers&#160; excellent&#160; sealing&#160; characteristics.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Set of micropipettors&#160; (p200, p1000)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11877351 (20-200) 11887351(p1000)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPERA PHENIX</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>HH14000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP5 inverted confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LSM780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue cassette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-0228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiomager microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SIP 60549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoblock (kit)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10066588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57648266</td>
			<td>CAUTION: toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin aqueous 1%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT110316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83804.360</td>
			<td>CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.365</td>
			<td>CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin 4%</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>F/40877-36</td>
			<td>CAUTION: Formalin contains formaldehyde which is hazardous. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fructose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gill hematoxylin type II</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>F/CP813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td>CAUTION: Suspected of causing genetic defects.&#160; Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Wax tek III</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS) 1 X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Buffered Saline (TBS) 10X</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>F/00801</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8532</td>
			<td>CAUTION: Triton X&#173;100 is hazardous. Avoid contact with skin and eyes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>534056</td>
			<td>CAUTION: Xylene is toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Clearing solution</td>
			<td>Glycerol-Fructose clearing solution is 60% (vol/w) glycerol and 2.5 M fructose. To prepare 10 mL of this solution, mix 6 mL of glycerol and 4.5 g of fructose. Complete to 10 mL with dH2O. Use a magnetic stirrer overnight. Refractive index = 1.4688 at room temperature (RT: 19&#8211;23 &#176;C). Store at 4 &#176;C in dark for up to 1 month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">PBS-BSA 0,1% solution</td>
			<td>To prepare 0,1% (vol/wt) PBS-BSA 0,1% solution, dissolve 500 mg of BSA in 50 mL of PBS-1X (store at 4&#176;C for up to 2 weeks). And dilute 1mL of this solution into 9mL of PBS-1X. This solution can be used to precoat the tip and centrifugation tube.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Permeabilisation-blocking solution (PB solution)</td>
			<td>The PBSDT blocking solution is PBS-1X supplemented with 0.1% &#8211; 1% Tritonx-100 (depending on the protein localization membrane/nucleus), 1% DMSO, 1% BSA and 1% donkey serum (or from the animal in which the secondary antibodies were raised). This solution can be stored at 4&#176;C for up to 1 month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">PB:PBS-1X &#160;(1:10) solution</td>
			<td>PB:PBS-1X &#160;(1:10) solution is a 10 time diluted PB solution. To prepare 10 mL of this solution dilute 1 mL of PB solution in 9 mL of PBS-1X.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halo software</td>
			<td>Indicalabs</td>
			<td>NM 87114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harmony software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>HH17000010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

staining and high-resolution imaging of three-dimensional organoid and spheroid models

In vitro tredimensionelle (3D) cellekulturmodeller, såsom organoider og sfæroider, er værdifulde værktøjer til mange applikationer, herunder udvikling og sygdomsmodellering, lægemiddelopdagelse og regenerativ medicin. For fuldt ud at udnytte disse modeller er det afgørende at studere dem på cellulære og subcellulære niveauer. Karakterisering af sådanne in vitro 3D-cellekulturmodeller kan dog være teknisk udfordrende og kræver specifik ekspertise for at udføre effektive analyser. Her giver dette papir detaljerede, robuste og komplementære protokoller til at udføre farvning og subcellulær opløsningsbilleddannelse af faste in vitro 3D-cellekulturmodeller, der spænder fra 100 μm til flere millimeter. Disse protokoller gælder for en lang række organoider og sfæroider, der adskiller sig i deres oprindelsescelle, morfologi og kulturbetingelser. Fra 3D-strukturhøst til billedanalyse kan disse protokoller afsluttes inden for 4-5 dage. Kort fortalt opsamles, fastgøres 3D-strukturer og kan derefter behandles enten gennem paraffinindlejring og histologisk/immunohistokemisk farvning eller direkte immunmærket og forberedt til optisk clearing og 3D-rekonstruktion (200 μm dybde) ved konfokal mikroskopi.

Denne protokol giver et overblik over de kritiske trin for 2D- og 3D-helmonteret farvning samt billeddannelse og kvantitative analyser af 3D-cellekulturmodeller (figur 3 og figur 4). Det kan anvendes til en bred vifte af 3D-cellekulturmodeller - fra sfæroider til organoider fra forskellige værtsarter eller væv - og muliggør erhvervelse af nøjagtige og kvantitative oplysninger om arkitektur, celleorganisation og interaktioner på cellulære og subcellulære niveauer (figur 3 og figur 4). Laboratorier kan være nødt til at optimere 2D histologiske og immunhistokemiske teknikker og antistofkoncentrationer i henhold til deres egne behov.
Begge metoder giver værdifuld biologisk information. 3D helmonteret farvning og konfokal mikroskopi giver visuel information om cellulær sammensætning og rumlig position med et dybdefelt på op til 200 μm (figur 3B). Imidlertid er 2D-sektionering praktisk for større 3D-strukturer til at afsløre detaljerede cellulære morfologiske træk i hele sektionen af 3D-strukturer, der ellers kan være udfordrende at observere in situ på grund af lysspredning, der kompromitterer opløsningen i større prøver. Desuden kan begge teknikker give kvantitative data. Faktisk tillader den opnåede opløsning anvendelse af cellulære og subcellulære segmenteringsalgoritmer til kvantificering af antallet af celler og påvisning af tilstedeværelsen af forskellige cellemarkører i forskellige cellulære undertyper (figur 3F og figur 4). Sammenfattende er de billeddannelsesteknikker, der er beskrevet her, reproducerbare, enkle og komplementære og repræsenterer værdifulde værktøjer til at studere cellulær heterogenitet.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig03.jpg"> Figur 3: Repræsentative resultater for 3D hele montering, billeddannelse og analyser af 3D og 2D optiske sektioner. (A) Konfokale billeder af mennesker h) sfærisk sfæroid af høj kvalitet gliom, der dyrkes i en uge og er mærket med Hoechst (blå), Olig2 (gul) og Actin (rød) (20x vandmål). For alle erhvervede billeder blev mikroskopindstillinger etableret ved hjælp af en positiv kontrol (øverst), og derefter blev den negative kontrol afbildet ved hjælp af identiske indstillinger for at kontrollere manglen på fluorescens i fravær af primært antistof (bund). (B) Ortogonal 3D helmonteret repræsentation af Ki67-farvning udført i (h) højkvalitets gliomsfæroid dyrket i en uge (glycerol-fruktoserensning; 20x vandmål, konfokal). (C) Konfokale billeder af h) højkvalitets gliomsfæroid dyrket i en uge og mærket med Hoechst (blå), Olig2 (gul) og phalloidin-488 (grøn) (glycerol-fruktoserensning; 20x vandmål). (D) Konfokale billeder af sfæroider dyrket i henholdsvis Hoechst (blå), Actin (rød) og Ki67 (grøn) (glycerol-fruktoserensning; 20x tørt mål). (E) Konfokale billeder af h) højkvalitets gliomsfæroid dyrket i en uge og mærket med Hoechst (blå) og Ki67 (grøn) (glycerol-fruktoserensning; 40x vandmål) (øverst til venstre). Segmenterede billeder på Hoechst-kanalen og Ki67-positive (+) nukleare regioner på den grønne kanal blev genereret ved hjælp af software til analyse med højt indhold (se supplerende figur 1 og materialetabel) (nederst). Det angivne output er procentdelen af Ki67+ kerner pr. segmenteret 3D-struktur (øverst til højre). Skalabjælke = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig04.jpg"> Figur 4: Repræsentative resultater for billeddannelse og analyser af optiske 2D-sektioner. (A, D) 2D-sektionsbilleder af en 3D-cellemodel (humane rhabdomyosarcoma sfæroider dyrket i en måned) opnået med en digital diasscanner og analyseret på en platform til hurtig digital kvantitativ analyse. (A) H&E-farvning og detektion af celler i henhold til deres størrelse. Skalabjælke = 500 μm. (B) Histogram viser procentdelen af celler < 100 μm 2 og > 100 μm2 detekteret ved hjælp af software til hurtig digital kvantitativ analyse (venstre: Halo) eller manuel tælling (højre: MC). C) Ki67-farvning og detektion af celler i henhold til intensiteten af deres 3,3'-diaminobenzidinsignal (DAB). Negativ (blå), svagt positiv (gul), positiv (rød). Skalabjælke = 500 μm. (D) Histogram viser procentdelen af Ki67-negative, svagt positive og positive celler. Forkortelser: H&E = hæmatoxylin og eosin; MC = manuel optælling. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Supplerende figur 1: Oversigt over trinnene i billedanalysesoftwaren. Analyserne er baseret på sammenhængen mellem byggesten. Hver byggesten svarer til en funktionssegmentering, beregning, tilknytning, outputdefinition - og tilbyder flere algoritmer og variable valg, der matcher den biologiske prøve, der afbildes. Softwaren giver flere RMS (Ready Made Solution) analyseprotokoller, der let kan bruges og ændres. Integrerede billedanalyseprotokoller kan gemmes, anvendes på forskellige datasæt og deles mellem brugere. Kort fortalt indebærer analyseprotokollen sekventiel objektsegmentering: sfæroide, kerner og endelig Ki67-lommer (A488). Derefter beregnes den gennemsnitlige intensitet af Ki67-lommerne for yderligere at diskriminere de positive begivenheder. Endelig vælges kerner, der omfatter Ki67-positive lommer, positivt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/Suppl1_Harmony%20analysis_Revised.pdf" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende figur 2: Oversigt over proceduretrinnene i den kvantitative analysesoftware. Trin 1. Upload filerne ved hjælp af fanen Studier . Filer åbnes i afsnittet Billedhandlinger . Trin 2. Åbn fanen Anmærkninger , og klik derefter på Laghandlinger for at designe et nyt lag rundt om strukturen ved hjælp af cirkelværktøjet på værktøjslinjen. For ikke-cirkulære strukturer kan penværktøjet bruges i stedet. Trin 3. Værktøjslinjen kan bruges til at designe annoteringer og visualisere kvantificeringen med værktøjet <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62280/62280eq01.jpg">. Trin 4. Åbn fanen Analyse , og vælg de bedste betingelser for analyse af prøven (flere forsøg kan være nødvendige her). Trin 4.1. Brug afsnittet Valg af pletter til at konfigurere farvningstilstanden. I tilfælde af flere pletter kan disse tilføjes og omdøbes, og den virtuelle farve kan ændres. Lokaliseringsdetekteringen kan specificeres - nuklear eller cytoplasmafarvning. Trin 4.2. Brug sektionen Celleregistrering til at konfigurere celleregistreringen. Dette afsnit vil være det vigtigste for analysen. Afsnittet Tærskelværdi for kernekontrast gør det muligt at detektere alle kerner. Der skal tages hensyn til, at hvis der er flere befolkningsstørrelser, kan softwaren registrere flere celler i stedet for en unik stor. Sektioner om nuklear størrelse og nuklear segmentering aggressivitet kan bruges til at kvantificere befolkningsintervaller for cellestørrelse. Trin 5. Beskrivelse af, hvordan prøveanalyse køres. Følg trinene vist i figuren. Sektionen Annotationslag kører kun indstillingen på dette dias. Kvantificeringen kan visualiseres ved hjælp af <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62280/62280eq01.jpg">værktøjet. Trin 4.1-5 gentages, indtil der er opnået en passende kvantificering. Trin 6-6.1. Disse trin giver dig mulighed for at tegne en figur ved hjælp af softwaren. Trin 7. Kvantificeringsgrafik opnået via software kan gemmes. Trin 8. Data kan eksporteres. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/Suppl2_Halo%20Images_revised.pdf" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models at JoVE.com

Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

Her leverer vi detaljerede, robuste og komplementære protokoller til at udføre farvning og subcellulær opløsningsbilleddannelse af faste tredimensionelle cellekulturmodeller, der spænder fra 100 μm til flere millimeter, hvilket muliggør visualisering af deres morfologi, celletypesammensætning og interaktioner.

Farvning og billeddannelse i høj opløsning af tredimensionelle organoid- og sfæroidmodeller

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...

Karakterisering af 3D in vitro-modeller ved cellulær og subcellulær opløsning er afgørende for den fulde udnyttelse, men kan være udfordrende. Derfor har vi leveret gratis protokol til farvning og subcellulær opløsningsbilleddannelse af faste 3D in vitro-modeller, der spænder fra 100 mikrometer til flere millimeter. 3D-strukturer er radiale og bør manipuleres omhyggeligt.Før pipettering skal du kontrollere placeringen af dine 3D-strukturer i røret for at undgå enhver aspiration. Da vi har tilpasset klassiske teknikker til indlejring af små strukturer som organoider eller sfæroider, kan visualiserede instruktioner hjælpe førstegangsbrugere med at udføre opgaven lettere. Laura Francols, en laboratorietekniker fra Pathology Research Platform, demonstrerer proceduren sammen med mig.For at forberede prøver til 3D-helmonteret farvning skal du bruge en milliliter pipettespids, der er forudkodet med BSA, til at tilføje en milliliter 3D-struktursuspension til et 500 mikroliter rør PBS. Når 3D-strukturerne har lagt sig til bunden af røret, skal PBS forsigtigt udskiftes med 500 mikroliter permeabiliseringsblokerende opløsning i en times inkubation ved stuetemperatur med blid vandret omrøring ved 30 til 50 omdrejninger pr. Minut. Ved inkubationens afslutning skal 3D-strukturerne sedimenteres igen, før 3D-strukturerne vaskes forsigtigt to gange i en milliliter 0,1% PBS suppleret med BSA i tre minutter pr. vask.Efter den sidste vask mærkes 3D-strukturerne med 250 mikroliter primært antistof i PBS i to til tre dage med blid vandret omrøring ved fire grader Celsius. Ved inkubationens afslutning vaskes prøven med fem tre minutter og to 15 minutters vask i en milliliter 0,1% PBS BSA pr. vask. Efter den sidste vask mærkes 3D-strukturerne med 250 mikroliter af det passende sekundære antistof i PBS i 24 timer ved fire grader Celsius med blid vandret omrøring beskyttet mod lys.Næste dag mærkes 3D-konstruktionerne med 250 mikroliter af den passende koncentration af Hoechst 3342 i en to timers inkubation ved fire grader Celsius med let vandret omrøring. Ved afslutningen af inkubationen vaskes 3D-strukturerne fem gange i tre minutter og to gange i 15 minutter i en milliliter PBS pr. vask som vist. Efter den sidste vask overføres 3D-strukturerne til en 96 brønd sort polystyrenmikroplade, og tilsæt forsigtigt 200 mikroliter rydningsopløsning på strukturerne, undgå bobler.Placer derefter pladen dækket med aluminiumsfolie ved fire grader Celsius i mindst 48 timer. For at integrere store 3D-cellekulturmodeller skal du bruge en BSA-belagt pipettespids på en milliliter til forsigtigt at overføre 3D-strukturerne til et fladbundet glasrør med et PTFE-foret flaskedæksel. Når strukturerne er bundfældet, skal PBS forsigtigt udskiftes med 70% ethanol i en 30 minutters inkubation ved stuetemperatur.Ved afslutningen af inkubationen udskiftes 70% ethanol med en milliliter klar til brug eosin Y-opløsning. Svip røret og pletter strukturerne i mindst 30 minutter. Ved afslutningen af inkubationen dehydreres strukturerne med tre på hinanden følgende 30 minutters vask i en milliliter 100% ethanol pr. Vask.Efter den sidste dehydrering skal du rydde 3D-strukturerne med tre på hinanden følgende 30 minutters vask i en milliliter xylen pr. Vask under en kemisk hætte. Efter den sidste xylennedsænkning placeres et stykke xylengennemblødt biopsipudeplads i et rum i en hvid mikrotwinvævskassette, og brug en BSA-belagt to milliliter plastpasteurpipette til at overføre 3D-strukturerne til puden. Dæk 3D-strukturerne med en anden xylengennemblødt biopsipude, for at holde 3D-strukturerne på plads og luk kassetten.Når alle prøver er overført, anbringes kassetterne i et 65 grader Celsius paraffinbad i 30 minutter, før kassetterne anbringes i et frisk 65 grader Celsius paraffinbad natten over. Næste morgen tilsættes flydende paraffin til en 65 grader Celsius opvarmet indlejringsform pr. Prøve, og læg en paraffinindlejret prøve i hver form. Omrør forsigtigt formene, indtil alle 3D-strukturer falder til bunden, og brug 65 grader Celsius opvarmede fine tang til at placere 3D-strukturerne i midten af hver form.Afkøl formen, indtil paraffinen danner et tyndt fast lag, der fastgør 3D-strukturen på plads. Placer en vævskassette og tilsæt varm paraffin over formen. Fjern formen, når paraffinen er helt størknet.For at integrere små 3D-cellekulturmodeller skal du forsigtigt vaske 3D-strukturerne tre gange i en milliliter TBS pr. Vask. Efter den sidste vask fjernes så meget TBS som muligt uden at røre ved strukturerne, og der tilsættes to dråber reagens to fra et kommercielt paraffinindlejringssæt. Bland forsigtigt ved at banke, og tilsæt to dråber reagens, den ene med bankning, indtil gelen størkner.Brug fine tang til at overføre gelen fra brønden i den færdigsamlede kassette fra sættet, og dehydrer den gelindlejrede prøve med 30 minutters stigende ethanol- og xyleninkubationer i en stinkhætte som angivet. Efter den sidste xylennedsænkning anbringes kassetten i et 65 grader Celsius paraffinbad natten over, inden du bruger fine tang til at overføre den paraffinindlejrede prøve i midten af en flydende paraffinbelastet 65 grader Celsius opvarmet indlejringsform. Fastgør derefter 3D-strukturen med endnu et lag paraffin, som demonstreret for de store 3D-cellekulturmodeller.Tredimensionel helmonteret farvning og konfokal mikroskopi giver visuel information om 3D-kulturmodellernes cellulære sammensætning og rumlige position til et dybdefelt på op til 200 mikron. Den høje opløsning, der kan opnås for 3D-strukturer ved hjælp af denne protokol, tillader anvendelse af cellulære og subcellulære segmenteringsalgoritmer til kvantificering af cellenummeret og påvisning af forskellige cellemarkører inden for forskellige celleundertyper. 3D hele monteringsanalyse kan anvendes på visualiserede celler op til 200 mikron i dybden, uanset hele strukturerne.Tværtimod kan 2D-sektionsanalyse give indsigt i celler af enhver størrelse.

Research

JoVE Journal

Biology

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the IÃƒâ€šÃ‚Â·Cryo Kit

Mus Sperm Kryopræservering og Recovery bruger I · Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

Isolering af brystepitelceller celler fra tre-dimensionel Blandet-celle klumpformet Co-kultur

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

To-og tre-dimensionelle Live-Cell Imaging af DNA skade responset Proteiner

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Langsigtet, høj opløsning Konfokal Time Lapse Imaging af<em&gt; Arabidopsis Kimblad</em&gt; Epidermis under spiring

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

Brug High Resolution Computed Tomography at visualisere de tredimensionelle struktur og funktion af dyrs vaskulatur

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Mus Føtal Hele Tarm Kultur System for<em&gt; Ex vivo</em&gt; Manipulation af signaleringsforløb og Tre-dimensionel Live-Imaging af Villus Udvikling

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

FRET Imaging i Tre-dimensionelle Hydrogeler

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Høj opløsning Time-lapse Imaging og Automatiseret analyse af mikrotubulusdynamik i levende menneske navlestrengsveneendotelceller

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...