Name: staining and high-resolution imaging of three-dimensional organoid and spheroid models
Uploaded: 2021-03-27T14:00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de St Baldrick's Robert J. Arceci Innovation Award #604303.

<ol>
	<li>Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+system+methods+and+applications+for+mesenchymal+stem+cells.">Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells.</a> Cells. 8 (12), 1-13 (2019).</li><li>Bartfeld, S., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+organoids+and+their+application+for+medical+research+and+patient+treatment.">Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment.</a> Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).</li><li>Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+multicellular+spheroids+formation.">Advances in multicellular spheroids formation.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 14 (127), (2017).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation.">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1724-1743 (2016).</li><li>Rezanejad, H., Lock, J. H., Sullivan, B. A., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+pancreatic+ductal+organoids+and+whole-mount+immunostaining+of+intact+organoids.">Generation of pancreatic ductal organoids and whole-mount immunostaining of intact organoids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 82 (2019).</li><li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+systems+and+their+applications+in+drug+discovery+and+cell-based+biosensors.">Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).</li><li>McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+and+assessment+of+human+primary+prostate+organoid+culture.">Handling and assessment of human primary prostate organoid culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e59051 (2019).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li><li>Lazzari, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+fluorescence+microscopy+versus+confocal+microscopy:+in+quest+of+a+suitable+tool+to+assess+drug+and+nanomedicine+penetration+into+multicellular+tumor+spheroids.">Light sheet fluorescence microscopy versus confocal microscopy: in quest of a suitable tool to assess drug and nanomedicine penetration into multicellular tumor spheroids.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 142, 195-203 (2019).</li><li>Gabriel, J., Brennan, D., Elisseeff, J. H., Beachley, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+embedding/sectioning+for+parallel+analysis+of+3D+cell+spheroids.">Microarray embedding/sectioning for parallel analysis of 3D cell spheroids.</a> Scientific Reports. 9, 16287 (2019).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Celkweek is een onmisbaar hulpmiddel om fundamentele biologische mechanismen bloot te leggen die betrokken zijn bij weefsel- en orgaanontwikkeling, functie, regeneratie en verstoring, en ziekte. Hoewel monolayered 2D-celcultuur de overhand heeft gehad, is recent onderzoek verschoven naar culturen die 3D-structuren genereren die meer reflecteren op in vivo cellulaire reacties, met name als gevolg van extra ruimtelijke organisatie en cel-celcontacten die genexpressie en cellulair gedrag beïnvloeden en dus meer voorspellende gegevens kunnen opleveren7. Niettemin blijven er veel uitdagingen bestaan, waaronder de behoefte aan gebruiksvriendelijke kleurings- en beeldvormingstechnieken voor gedetailleerde microscopische visualisatie en evaluatie van complexe 3D-structuren op cellulair en subcellulair niveau. In die context zijn gedetailleerde, robuuste en complementaire protocollen verstrekt om kleuring en cellulaire en subcellulaire resolutie beeldvorming uit te voeren van vaste in vitro 3D-celkweekmodellen variërend van 100 μm tot enkele millimeters groot.
Deze procedure presenteert twee verschillende strategieën om om te gaan met een grote verscheidenheid aan maten en soorten in vitro 3D-celkweekmodellen. De keuze van de ene (3D whole-mount analyse) of de andere (2D sectioning analyse) hangt af van het gebruikte model en de onderzochte kwestie. 3D whole-mount analyse door confocale microscopie maakt de visualisatie mogelijk van cellen met een veld van diepte tot 200 μm, ongeacht de totale grootte van de 3D-structuur, terwijl 2D-secties van toepassing zijn op monsters van elke grootte, maar visualisatie blijft 2D-dimensionaal. Hieronder vindt u enkele suggesties voor het oplossen van problemen en technische overwegingen.
Verlies van 3D-structuren tijdens de workflow is het meest voorkomende nadeel. Ze kunnen aan de uiteinden en buizen blijven kleven, daarom is het voorcoaten van tips en buizen met PBS-BSA 0,1% oplossing van cruciaal belang. Bovendien is het cruciaal om de 3D-structuren te laten bezinken tussen reagensveranderingen en om alle pipetteringen zeer zorgvuldig uit te voeren. Zoals vermeld in de procedure, kunnen voor alle stappen, als de sedimentatie van de 3D-structuur te lang is, cellen voorzichtig worden gesponnen met 50 × g gedurende 5 minuten bij RT. Afhankelijk van het doel van de studie, moeten de voor- en nadelen van een dergelijke draaiende stap worden overwogen, omdat centrifugatie de vorm van de 3D-structuren in gevaar kan brengen. Bovendien moet ervoor worden gezorgd dat deze morfologie tijdens de fixatiestap behouden blijft, omdat cystische organoïden de neiging hebben om in te storten. Bevestigingsconstructies met een grootte van minder dan 400 μm moeten structurele veranderingen voorkomen.
Voor optimale immunolabeling is herstel van organoïden uit hun 3D-matrices een cruciale stap. De 3D-matrix kan adequate penetratie van antilichamen belemmeren of leiden tot hoge achtergrondkleuring vanwege niet-specifieke binding aan de matrix. ECM-verwijdering kan de morfologie van de buitenste segmenten van organoïden veranderen (met name in het geval van kleine cellulaire uitsteeksels die zich uitstrekken van bestudeerde 3D-structuren) en analyses gedeeltelijk belemmeren. Voor dergelijke 3D-structuren kan de matrix gedurende de hele procedure worden behouden; de kweekomstandigheden moeten echter zorgvuldig worden aangepast om cellen in een minimale hoeveelheid matrix te laten groeien om onvoldoende penetratie van oplossingen en antilichamen te voorkomen en om opeenvolgende wasstappen te voorkomen die gericht zijn op het verminderen van overmatig achtergrondgeluid 6,8.
De optische clearingstap die in dit protocol wordt beschreven in de 3D whole mount-kleuringssectie is relevant voor de beeldvorming van 3D-structuren tot 150-200 μm diep in plaats van 50-80 μm zonder clearing. In vergelijking met andere clearingmethodologieën die vaak enkele weken nodig hebben en waarbij toxische clearingmiddelen worden gebruikt, is in dit protocol een eerder gepubliceerde snelle en veilige clearingstap gebruikt 4,9. Bovendien is deze opruimstap omkeerbaar en kunnen nieuwe antilichamen worden toegevoegd aan de initiële kleuring zonder verlies van resolutie of helderheid4. Niettemin, afhankelijk van het bestudeerde 3D-celkweekmodel, is een diepte van 150-200 μm mogelijk niet voldoende om de 3D-structuur op een informatieve manier in beeld te brengen, en dit clearingprotocol kan veranderingen veroorzaken in de algemene morfologie van bolvormige, monolayered organoïden met grotelumens 4. Gebruikers moeten hun experiment zorgvuldig ontwerpen en indien nodig de timing van de permeabilisatie / blokkeringsstap optimaliseren (om penetratie van antilichamen en oplossing mogelijk te maken), de clearingstap (om dieper dan 200 μm door te dringen, monsters moeten volledig worden gewist) en beeldacquisitie. De twee meest voorkomende technologieën die beschikbaar zijn in kernfaciliteiten zijn lichtplaat en confocale microscopie. Gebruikers moeten zorgvuldig een technologie kiezen op basis van de grootte van hun 3D-structuren en hun biologische vraag10. In vergelijking met confocale microscopie blijft de resolutie van lichtplaatmicroscopie die wordt verkregen voor dergelijke diepe structuren echter suboptimaal voor het verkrijgen van subcellulaire resolutie.
Hier is een gedetailleerd en robuust proces gerapporteerd dat is gewijd aan paraffine-inbedding van afzonderlijke monsters. Interessant is dat Gabriel et al. onlangs een protocol hebben ontwikkeld dat 3D-celculturen in paraffine insluit met een verhoogde doorvoer. Ze gebruikten een polydimethylsiloxaan (PDMS) -mal om 96 3D-structuren in een microarraypatroon in één blok op te sluiten, waardoor nieuwe perspectieven werden geboden voor studies over 3D-tumormodellen die meer groepen, tijdspunten, behandelingsomstandigheden en replicatiesomvatten 11. Deze methode vereist echter uitgebreide vaardigheden en machines, met name voor de fabricage van de premold die wordt gebruikt om PDMS-mallen te maken.
Samenvattend beschrijft dit artikel twee verschillende, complementaire en aanpasbare benaderingen die het mogelijk maken om nauwkeurige en kwantitatieve informatie te verkrijgen over architecturale en cellulaire samenstelling van 3D-cellulaire modellen. Beide parameters zijn cruciaal voor het bestuderen van biologische processen zoals intratumorale cellulaire heterogeniteit en de rol ervan in resistentie tegen behandelingen.

In de afgelopen decennia hebben de ontwikkelingen in stamcelbiologie en in vitro 3D-cultuurtechnologieën een revolutie in de biologie en geneeskunde ingeluid. Celmodellen met een hogere complexiteit in 3D zijn erg populair geworden omdat ze cellen in staat stellen te groeien en te interageren met een omringend extracellulair raamwerk, waarbij aspecten van levende weefsels, waaronder hun architectuur, celorganisatie en interacties, of zelfs diffusiekenmerken, nauw worden samengevat. Als zodanig kunnen 3D-celkweekmodellen unieke inzichten bieden in het gedrag van cellen in zich ontwikkelende of zieke weefsels in vitro. Organoïden en sferoïden zijn beide meercellige 3D-structuren, variërend van enkele micrometers tot millimeters, en zijn de meest prominente in vitro 3D-structuren. Beide kunnen worden gekweekt in een ondersteunende steiger, waaronder (i) hydrogels afgeleid van dieren (keldermembraanextract, collageen), planten (alginaat / agarose), of gesynthetiseerd uit chemicaliën, of (ii) inerte matrices die poriën bevatten om celproliferatie en groei te bevorderen.
Organoïden en sferoïden kunnen zich ook ontwikkelen zonder de aanwezigheid van een ondersteunende steiger door te vertrouwen op cellen om zichzelf in clusters te assembleren. Dit is afhankelijk van verschillende technieken, zoals het gebruik van niet-klevende materialen om celaanhechting, oppervlaktespanning en zwaartekracht te remmen (bijv. hangende valtechnieken), of constante cirkelvormige rotatie van bloedvaten (bijv. Spinnercultuur). In alle gevallen vergemakkelijken deze technieken cel-cel- en celmatrixinteracties om de beperkingen van de traditionele monolaagcelcultuur te overwinnen1. De termen "organoïden" en "sferoïden" zijn in het verleden door elkaar gebruikt, maar er zijn belangrijke verschillen tussen deze twee 3D-celkweekmodellen. Organoïden zijn in vitro 3D cellulaire clusters afgeleid van pluripotente stamcellen of weefselspecifieke stamcellen, waarin cellen zich spontaan organiseren in voorlopers en gedifferentieerde celtypen en die ten minste enkele functies van het orgaan van belang samenvatten2. Sferoïden omvatten een breder scala aan meercellige 3D-structuren gevormd onder niet-adherente omstandigheden en kunnen ontstaan uit een grote diversiteit aan celtypen zoals onsterfelijke cellijnen of primaire cellen3. Vandaar dat organoïden, inherent aan hun intrinsieke stamceloorsprong, een hogere neiging hebben tot zelfassemblage, levensvatbaarheid en stabiliteit dan sferoïden.
Niettemin zijn deze twee modellen in wezen 3D-structuren die zijn samengesteld uit meerdere cellen, en de technieken die zijn ontwikkeld om ze te bestuderen lijken dus erg op elkaar. Krachtige beeldvormingsbenaderingen op het resolutieniveau van één cel zijn bijvoorbeeld nodig voor het onderzoeken van de cellulaire complexiteit van zowel organoïden als sferoïden. Hier, door de expertise van deze groep en die van leiders op het gebied van organoïden4 samen te vatten, beschrijft dit artikel gedetailleerde procedures voor het uitvoeren van tweedimensionale (2D) en 3D whole-mount kleuring, beeldvorming en analyses van de cellulaire en subcellulaire samenstelling en ruimtelijke organisatie van organoïden en sferoïden variërend van 100 μm tot enkele millimeters. Inderdaad, deze procedure presenteert twee verschillende en complementaire soorten kleuring en beeldvormingsacquisitie om een grote verscheidenheid aan maten en soorten in vitro 3D-celkweekmodellen te analyseren. Het gebruik van de ene (3D whole-mount analyse) of de andere (2D sectie analyse) zal afhangen van het bestudeerde model en de gezochte antwoorden. 3D-analyse met volledige mount door confocale microscopie kan bijvoorbeeld worden toegepast om cellen in 3D-cultuur tot 200 μm diep te visualiseren, ongeacht de totale grootte van de 3D-structuur, terwijl de analyse van 2D-secties inzicht biedt in monsters van elke grootte, zij het op 2D-niveau. Deze procedure is met succes toegepast op een verscheidenheid aan organoïden 4,5 en sferoïden afgeleid van menselijke en muizencellen, afkomstig uit verschillende embryonale kiemlagen. Het overzicht van de procedure is weergegeven in figuur 1. De belangrijkste fasen, de relaties tussen hen, beslissende stappen en de verwachte timing worden aangegeven.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig01.jpg"> Figuur 1: Schematisch overzicht van de procedure. In vitro 3D-celkweekmodellen worden verzameld en gefixeerd en vervolgens voorbereid voor 3D-kleuring van de hele montage (optie a) of ingebed in paraffine voor 2D-sectie en kleuring (optie b). Voor 3D-kleuringsexperimenten met hele mounts worden vaste 3D-structuren immuungelabeld na de fixatiestap. Een optionele optische clearingstap kan worden uitgevoerd om de beeldkwaliteit en de diepte van optische microscopie te verbeteren door lichtverstrooiing tijdens beeldverwerking te verminderen. Beelden worden vastgelegd op een omgekeerde confocale microscoop of een confocaal high content systeem en geanalyseerd met behulp van de juiste software. Voor paraffine-inbedding worden 3D-structuren direct verwerkt (optie b.1 voor grote structuren ≥ 400 μm) of opgenomen in een gel (b.2; kleine structuren ≤ 400 μm) voor dehydratie en paraffine-inbedding. Paraffineblokken worden vervolgens gesneden en gekleurd (histologische of immunochemische kleuring). Beelden van 2D-secties worden verkregen op een digitale diascanner of een rechtopstaande microscoop en geanalyseerd op een beeldanalyseplatform met behulp van snelle digitale kwantitatieve analyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy pad Q Path blue</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes macrostar III Blc couv. Char. x1500</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassette microtwin white</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical hood</td>
			<td>Erlab</td>
			<td>FI82 5585-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips 1000 &#181;L</td>
			<td>Star lab Tip-One</td>
			<td>S1122-1730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Pyramid innovation</td>
			<td>R35002-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottom glass tubes with PTFE lined 2 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11784259</td>
			<td>Excellent&#160; for environmental&#160;&#160;&#160; samples,&#160;&#160;&#160; pharmaceuticals and diagnostic reagents. PTFE is designed for the ultimate in product safety. PTFE provides totally inert inner seal and surface facing the sample or product.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish plate 35 mm</td>
			<td>Ibedi</td>
			<td>2018003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal agitation</td>
			<td>N-BIOTEK</td>
			<td>NB-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator prewarmed to 65 &#176;C</td>
			<td>Memmert Incubator</td>
			<td>LAB129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inox molds 15x15</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-1918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides Matsunami TOMO-11/90</td>
			<td>Roche diagnostics</td>
			<td>8082286001</td>
			<td>these slides are used for a better adhesion of sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>HM340E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panoramic scan II</td>
			<td>3dhistech</td>
			<td>2397612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin embedding equipment</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette Pasteur 2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Path flacon 150mL cape blanc x250</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-1308</td>
			<td>Good for environmental&#160;&#160;&#160; samples,&#160;&#160;&#160; pharmaceuticals and diagnostic reagents. Polypropylene (PP) are rigid,&#160; solid, provide excellent&#160; stress&#160; crack&#160; and&#160; impact&#160; resistance and have a&#160; good oil and alcohol barrier and chemical resistance. PE-lined cap is stress crack resistant and offers&#160; excellent&#160; sealing&#160; characteristics.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Set of micropipettors&#160; (p200, p1000)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11877351 (20-200) 11887351(p1000)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPERA PHENIX</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>HH14000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP5 inverted confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LSM780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue cassette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-0228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiomager microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SIP 60549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoblock (kit)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10066588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57648266</td>
			<td>CAUTION: toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin aqueous 1%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT110316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83804.360</td>
			<td>CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.365</td>
			<td>CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin 4%</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>F/40877-36</td>
			<td>CAUTION: Formalin contains formaldehyde which is hazardous. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fructose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gill hematoxylin type II</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>F/CP813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td>CAUTION: Suspected of causing genetic defects.&#160; Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Wax tek III</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS) 1 X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Buffered Saline (TBS) 10X</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>F/00801</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8532</td>
			<td>CAUTION: Triton X&#173;100 is hazardous. Avoid contact with skin and eyes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>534056</td>
			<td>CAUTION: Xylene is toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Clearing solution</td>
			<td>Glycerol-Fructose clearing solution is 60% (vol/w) glycerol and 2.5 M fructose. To prepare 10 mL of this solution, mix 6 mL of glycerol and 4.5 g of fructose. Complete to 10 mL with dH2O. Use a magnetic stirrer overnight. Refractive index = 1.4688 at room temperature (RT: 19&#8211;23 &#176;C). Store at 4 &#176;C in dark for up to 1 month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">PBS-BSA 0,1% solution</td>
			<td>To prepare 0,1% (vol/wt) PBS-BSA 0,1% solution, dissolve 500 mg of BSA in 50 mL of PBS-1X (store at 4&#176;C for up to 2 weeks). And dilute 1mL of this solution into 9mL of PBS-1X. This solution can be used to precoat the tip and centrifugation tube.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Permeabilisation-blocking solution (PB solution)</td>
			<td>The PBSDT blocking solution is PBS-1X supplemented with 0.1% &#8211; 1% Tritonx-100 (depending on the protein localization membrane/nucleus), 1% DMSO, 1% BSA and 1% donkey serum (or from the animal in which the secondary antibodies were raised). This solution can be stored at 4&#176;C for up to 1 month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">PB:PBS-1X &#160;(1:10) solution</td>
			<td>PB:PBS-1X &#160;(1:10) solution is a 10 time diluted PB solution. To prepare 10 mL of this solution dilute 1 mL of PB solution in 9 mL of PBS-1X.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halo software</td>
			<td>Indicalabs</td>
			<td>NM 87114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harmony software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>HH17000010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

staining and high-resolution imaging of three-dimensional organoid and spheroid models

In vitro driedimensionale (3D) celkweekmodellen, zoals organoïden en sferoïden, zijn waardevolle hulpmiddelen voor vele toepassingen, waaronder ontwikkelings- en ziektemodellering, medicijnontdekking en regeneratieve geneeskunde. Om deze modellen volledig te benutten, is het cruciaal om ze op cellulair en subcellulair niveau te bestuderen. Het karakteriseren van dergelijke in vitro 3D-celkweekmodellen kan echter technisch uitdagend zijn en vereist specifieke expertise om effectieve analyses uit te voeren. Hier biedt dit artikel gedetailleerde, robuuste en complementaire protocollen voor het uitvoeren van kleuring en subcellulaire resolutie beeldvorming van vaste in vitro 3D-celkweekmodellen variërend van 100 μm tot enkele millimeters. Deze protocollen zijn van toepassing op een breed scala aan organoïden en sferoïden die verschillen in hun cel-van-oorsprong, morfologie en kweekomstandigheden. Van het oogsten van 3D-structuren tot beeldanalyse, deze protocollen kunnen binnen 4-5 dagen worden voltooid. In het kort worden 3D-structuren verzameld, gefixeerd en vervolgens verwerkt door paraffine-inbedding en histologische / immunohistochemische kleuring, of direct immunoactief gelabeld en voorbereid voor optische clearing en 3D-reconstructie (200 μm diepte) door confocale microscopie.

Dit protocol biedt een overzicht van de kritieke stappen voor 2D- en 3D-kleuring van de hele montage, evenals beeldvorming en kwantitatieve analyses van 3D-celkweekmodellen (figuur 3 en figuur 4). Het is van toepassing op een breed scala aan 3D-celkweekmodellen - van sferoïden tot organoïden van verschillende gastheersoorten of weefsels - en maakt het mogelijk om nauwkeurige en kwantitatieve informatie te verkrijgen over architectuur, celorganisatie en interacties op cellulair en subcellulair niveau (figuur 3 en figuur 4). Laboratoria moeten mogelijk 2D histologische en immunohistochemische technieken en antilichaamconcentraties optimaliseren volgens hun eigen behoeften.
Beide methoden leveren waardevolle biologische informatie op. 3D-kleuring van de hele montage en confocale microscopie bieden visuele informatie over cellulaire samenstelling en ruimtelijke positie met een scherpte van diepte tot 200 μm (figuur 3B). 2D-secties zijn echter handig voor grotere 3D-structuren om gedetailleerde cellulaire morfologische kenmerken in het hele gedeelte van 3D-structuren te onthullen die anders een uitdaging kunnen zijn om in situ te observeren vanwege lichtverstrooiing die de resolutie in grotere monsters in gevaar brengt. Bovendien kunnen beide technieken kwantitatieve gegevens opleveren. De verkregen resolutie maakt inderdaad de toepassing van cellulaire en subcellulaire segmentatiealgoritmen mogelijk voor de kwantificering van het aantal cellen en de detectie van de aanwezigheid van verschillende celmarkers in verschillende cellulaire subtypen (figuur 3F en figuur 4). Samenvattend zijn de hier beschreven beeldvormingstechnieken reproduceerbaar, eenvoudig en complementair en vertegenwoordigen ze waardevolle hulpmiddelen voor het bestuderen van cellulaire heterogeniteit.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig03.jpg"> Figuur 3: Representatieve resultaten voor 3D-hele mount, beeldvorming en analyses van 3D- en 2D-optische secties. (A) Confocale beelden van menselijke (h) hoogwaardige glioomsferoïde gekweekt gedurende een week en gelabeld met Hoechst (blauw), Olig2 (geel) en Actine (rood) (20x waterobjectief). Voor alle verkregen beelden werden microscoopinstellingen vastgesteld met behulp van een positieve controle (boven) en vervolgens werd de negatieve controle in beeld gebracht met identieke instellingen om het gebrek aan fluorescentie te beheersen in afwezigheid van primair antilichaam (onder). (B) Orthogonale 3D-weergave van Ki67-kleuring uitgevoerd in (h) hoogwaardige glioma-sferoïde gekweekt gedurende een week (glycerol-fructose-clearing; 20x waterobjectief, confocaal). (C) Confocale beelden van (h) hoogwaardige glioom sferoïde gekweekt gedurende een week en gelabeld met Hoechst (blauw), Olig2 (geel) en Phalloidine-488 (groen) (glycerol-fructose clearing; 20x waterdoelstelling). (D) Confocale beelden van menselijke (h) rabdomyosarcoom (boven) en muis (m) neurale crest cell (onderste) sferoïden gekweekt gedurende een week en gelabeld met Hoechst (blauw), Actine (rood) en Ki67 (groen), respectievelijk (glycerol-fructose clearing; 20x droog doel). (E) Confocale beelden van (h) hoogwaardige glioom sferoïde gekweekt gedurende een week en gelabeld met Hoechst (blauw) en Ki67 (groen) (glycerol-fructose clearing; 40x water objectief) (linksboven). Gesegmenteerde beelden op het Hoechst-kanaal en Ki67-positieve (+) nucleaire regio's op het groene kanaal werden gegenereerd met behulp van high-content analysesoftware (zie aanvullende figuur 1 en tabel met materialen) (onder). De gegeven output is het percentage Ki67+ kernen per gesegmenteerde 3D-structuur (rechtsboven). Schaalbalk = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig04.jpg"> Figuur 4: Representatieve resultaten voor beeldvorming en analyses van 2D optische secties. (A, D) 2D-sectiebeelden van een 3D-celmodel (menselijke rhabdomyosarcoom-sferoïden gekweekt gedurende een maand) verkregen met een digitale diascanner en geanalyseerd op een platform voor snelle digitale kwantitatieve analyse. (A) H&E-kleuring en detectie van cellen op basis van hun grootte. Schaalbalk = 500 μm. (B) Histogram toont percentage cellen < 100 μm2 en > 100 μm2 gedetecteerd met behulp van software voor snelle digitale kwantitatieve analyse (links: Halo) of handmatig tellen (rechts: MC). (C) Ki67 kleuring en detectie van cellen op basis van de intensiteit van hun 3,3'-diaminobenzidine (DAB) signaal. Negatief (blauw), zwak positief (geel), positief (rood). Schaalbalk = 500 μm. (D) Histogram toont percentage Ki67-negatieve, zwak positieve en positieve cellen. Afkortingen: H&E = hematoxyline en eosine; MC = handmatig tellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullende figuur 1: Overzicht van de stappen in de software voor beeldvormingsanalyse. Analyses zijn gebaseerd op de associatie van bouwstenen. Elke bouwsteen die overeenkomt met een functiesegmentatie, berekening, associatie, uitvoerdefinitie en biedt meerdere algoritmen en variabele selecties die overeenkomen met het biologische monster dat wordt afgebeeld. De software biedt meerdere RMS (Ready Made Solution) analyseprotocollen die eenvoudig kunnen worden gebruikt en aangepast. Geïntegreerde beeldanalyseprotocollen kunnen worden opgeslagen, toegepast op verschillende gegevenssets en worden gedeeld tussen gebruikers. In het kort impliceert het analyseprotocol sequentiële objectsegmentatie: sferoïde, kernen en ten slotte Ki67-pockets (A488). Vervolgens wordt de gemiddelde intensiteit van de Ki67-pockets berekend om de positieve gebeurtenissen verder te discrimineren. Ten slotte worden kernen die Ki67-positieve pockets omvatten positief geselecteerd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/Suppl1_Harmony%20analysis_Revised.pdf" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende figuur 2: Overzicht van de procedurestappen van de kwantitatieve analysesoftware. Stap 1. Upload de bestanden via het tabblad Studies . Bestanden worden geopend in het gedeelte Afbeeldingsacties . Stap 2. Open het tabblad Annotaties en klik vervolgens op Laagacties om een nieuwe laag rondom de structuur te ontwerpen met behulp van het cirkelgereedschap van de werkbalk. Voor niet-cirkelvormige structuren kan in plaats daarvan het pengereedschap worden gebruikt. Stap 3. De werkbalk kan worden gebruikt om annotaties te ontwerpen en de kwantificering met de <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62280/62280eq01.jpg">tool te visualiseren. Stap 4. Open het tabblad Analyse en selecteer de beste omstandigheden voor de analyse van het monster (hier kunnen verschillende onderzoeken nodig zijn). Stap 4.1. Gebruik het gedeelte Vlekselectie om de kleuringsconditie in te stellen. In het geval van meerdere vlekken kunnen deze worden toegevoegd en hernoemd en kan de virtuele kleur worden gewijzigd. De lokalisatiedetectie kan gespecificeerd-nucleair of cytoplasmakleuring zijn. Stap 4.2. Gebruik de sectie Celdetectie om de celdetectie in te stellen. Dit gedeelte zal het belangrijkst zijn voor de analyse. De sectie Nucleaire contrastdrempel maakt detectie van alle kernen mogelijk. Er moet aandacht worden besteed aan het geval er meerdere populatiegroottes zijn, de software kan meerdere cellen detecteren in plaats van een unieke grote. Nucleaire grootte en nucleaire segmentatie agressiviteit secties kunnen worden gebruikt om celgrootte populatiebereiken te kwantificeren. Stap 5. Beschrijving van het uitvoeren van voorbeeldanalyse. Volg de stappen in de afbeelding. In de sectie Annotatielaag wordt de instelling alleen op deze dia uitgevoerd. De kwantificering kan worden gevisualiseerd met behulp van de <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62280/62280eq01.jpg">tool. Herhaal stap 4.1-5 totdat de juiste kwantificering is bereikt. Stappen 6-6.1. Met deze stappen kunt u een figuur tekenen met behulp van de software. Stap 7. Kwantificeringsgrafieken verkregen via software kunnen worden opgeslagen. Stap 8. Gegevens kunnen worden geëxporteerd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/Suppl2_Halo%20Images_revised.pdf" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models at JoVE.com

Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

Hier bieden we gedetailleerde, robuuste en complementaire protocollen voor het uitvoeren van kleuring en subcellulaire resolutie beeldvorming van vaste driedimensionale celkweekmodellen variërend van 100 μm tot enkele millimeters, waardoor de visualisatie van hun morfologie, celtypesamenstelling en interacties mogelijk wordt.

Kleuring en beeldvorming met hoge resolutie van driedimensionale organoïde en sferoïde modellen

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...

Het karakteriseren van 3D in vitro model op cellulaire en subcellulaire resolutie is cruciaal voor de volledige exploitatie, maar kan een uitdaging zijn. Daarom hebben we een aanvullend protocol verstrekt voor de kleuring en subcellulaire resolutie beeldvorming van vaste 3D in vitro modellen variërend van 100 micrometer tot enkele millimeters. 3D-structuren zijn radiaal en moeten zorgvuldig worden gemanipuleerd.Controleer voordat u pipettert de locatie van uw 3D-structuren in de buis om elke aspiratie te voorkomen. Omdat we klassieke technieken hebben aangepast voor het inbedden van kleine structuren zoals organoïden of sferoïden, kunnen gevisualiseerde instructies gebruikers helpen de taak gemakkelijker uit te voeren. Laura Francols demonstreert de procedure met mij, een labtechnoloog van het Pathology Research Platform.Om monsters voor te bereiden op 3D-kleuring van de hele montage, gebruikt u een pipetpunt van één milliliter die vooraf is gecodeerd met BSA om een 3D-structuursuspensie van één milliliter toe te voegen aan een buis van PBS van 500 microliter. Wanneer de 3D-structuren zich op de bodem van de buis hebben gevestigd, vervangt u de PBS zorgvuldig door 500 microliter permeabilisatieblokkeringsoplossing gedurende een incubatie van een uur bij kamertemperatuur met zachte horizontale agitatie bij 30 tot 50 omwentelingen per minuut. Laat aan het einde van de incubatie de 3D-structuren opnieuw bezinken voordat u de 3D-structuren twee keer zorgvuldig wast in één milliliter van 0,1% PBS aangevuld met BSA gedurende drie minuten per wasbeurt.Na de laatste wasbeurt labelt u de 3D-structuren met 250 microliter primair antilichaam in PBS gedurende twee tot drie dagen met zachte horizontale agitatie bij vier graden Celsius. Was het monster aan het einde van de incubatie met vijf wasbeurten van drie minuten en twee wasbeurten van 15 minuten in één milliliter van 0,1% PBS BSA per wasbeurt. Na de laatste wasbeurt labelt u de 3D-structuren met 250 microliter van het juiste secundaire antilichaam in PBS gedurende 24 uur bij vier graden Celsius met zachte horizontale agitatie beschermd tegen licht.Label de volgende dag de 3D-structuren met 250 microliter van de juiste concentratie Hoechst 3342 gedurende een incubatie van twee uur bij vier graden Celsius met zachte horizontale agitatie. Was aan het einde van de incubatie de 3D-structuren vijf keer gedurende drie minuten en twee keer gedurende 15 minuten in één milliliter PBS per wasbeurt, zoals gedemonstreerd. Breng na de laatste wasbeurt de 3D-structuren over op een 96-goed zwarte polystyreenmicroplaat en voeg voorzichtig 200 microliter opruimoplossing toe aan de structuren, waardoor bubbels worden vermeden.Plaats vervolgens de plaat bedekt met aluminiumfolie op vier graden Celsius gedurende ten minste 48 uur. Om grote 3D-celkweekmodellen in te bedden, gebruikt u een BSA-gecoate pipetpunt van één milliliter om de 3D-structuren zorgvuldig over te brengen naar een glazen buis met vlakke bodem met een PTFE-gevoerde flesdop. Nadat de structuren zijn bezonken, vervangt u de PBS zorgvuldig door 70% ethanol gedurende een incubatie van 30 minuten bij kamertemperatuur.Vervang aan het einde van de incubatie de 70% ethanol door één milliliter gebruiksklare eosine Y-oplossing. Veeg met de buis en bevlek de structuren gedurende ten minste 30 minuten. Aan het einde van de incubatie droogt u de structuren uit met drie opeenvolgende wasbeurten van 30 minuten in één milliliter van 100% ethanol per wasbeurt.Na de laatste uitdroging, verwijder de 3D-structuren met drie opeenvolgende wasbeurten van 30 minuten in één milliliter xyleen per wasbeurt onder een chemische kap. Na de laatste xyleen onderdompeling, plaats een stuk xyleen gedrenkt biopsie pad in een compartiment van een witte microtwin weefselcassette, en gebruik een BSA gecoate twee milliliter plastic Pasteur pipet om de 3D-structuren op de pad over te brengen. Bedek de 3D-structuren met een ander met xyleen doordrenkt biopsiepad om de 3D-structuren op hun plaats te houden en sluit de cassette.Wanneer alle monsters zijn overgebracht, plaatst u de cassettes gedurende 30 minuten in een paraffinebad van 65 graden Celsius voordat u de cassettes 's nachts in een vers paraffinebad van 65 graden Celsius plaatst. Voeg de volgende ochtend vloeibare paraffine toe aan een 65 graden Celsius verwarmde ingesloten ingesloten schimmel per monster en plaats een paraffine ingebed monster in elke mal. Roer de mallen voorzichtig totdat alle 3D-structuren naar de bodem vallen en gebruik 65 graden Celsius verwarmde fijne tangen om de 3D-structuren in het midden van elke mal te plaatsen.Koel de schimmel totdat de paraffine een dunne stevige laag vormt, waardoor de 3D-structuur op zijn plaats wordt vastgezet. Plaats een tissuecassette en voeg hete paraffine toe aan de vorm. Verwijder de schimmel wanneer de paraffine volledig is gestold.Om kleine 3D-celkweekmodellen in te bedden, wast u de 3D-structuren voorzichtig drie keer in één milliliter TBS per wasbeurt. Verwijder na de laatste wasbeurt zoveel mogelijk TBS zonder de structuren aan te raken en voeg twee druppels reagens twee toe uit een commerciële paraffine-inbeddingskit. Meng zachtjes door te tikken en voeg twee druppels reagens één toe met tikken totdat de gel stolt.Gebruik een fijne tang om de gel over te brengen uit de put van de voorgemonteerde cassette uit de kit en droog het gel ingebedde monster uit met 30 minuten oplopende ethanol- en xyleenincubaties in een zuurkast zoals aangegeven. Na de laatste xyleen-onderdompeling plaatst u de cassette 's nachts in een paraffinebad van 65 graden Celsius voordat u een fijne tang gebruikt om het in de paraffine ingebedde monster over te brengen naar het midden van een vloeibare paraffine geladen 65 graden Celsius verwarmde inbeddingsvorm. Beveilig vervolgens de 3D-structuur met nog een laag paraffine zoals gedemonstreerd voor de grote 3D-celkweekmodellen.Driedimensionale kleuring van de hele montering en confocale microscopie bieden visuele informatie over de cellulaire samenstelling en ruimtelijke positie van de 3D-cultuurmodellen tot een gebied van diepte van maximaal 200 micron. De hoge resolutie die kan worden verkregen voor 3D-structuren met behulp van dit protocol maakt de toepassing van cellulaire en subcellulaire segmentatiealgoritmen mogelijk voor kwantificering van het celnummer en de detectie van verschillende celmarkers binnen verschillende celsubtypen. 3D whole mounts-analyse kan worden toegepast op gevisualiseerde cellen tot 200 micron diep, ongeacht de hele structuur.Integendeel, 2D-sectieanalyse kan inzicht geven in cellen van elke grootte.

Research

JoVE Journal

Biology

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Hoge-resolutie Meting van Geur-Driven gedrag in Drosophila Larven

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronale celkweken van Aplysia voor High-Resolution Imaging van Groei Cones

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the IÃƒâ€šÃ‚Â·Cryo Kit

Muis Sperma Cryopreservatie en herstel met behulp van de I · Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

Isolatie van Borst epitheelcellen van drie-dimensionale Mixed-cel Spheroid Co-cultuur

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Twee-en drie-dimensionale live cell imaging van DNA schade respons Eiwitten

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Lange termijn, hoge resolutie Confocale Time Lapse Imaging van<em&gt; Arabidopsis Cotyledon</em&gt; Epidermis Bij het ontkiemen

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

Met behulp van hoge resolutie Computed Tomography om de driedimensionale structuur en functie van Plant vaatstelsel Visualiseer

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Muis Foetale Hele Darm Cultuur System voor<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Manipulatie van signaalwegen en Driedimensionale Live-Imaging van Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

FRET Imaging in Driedimensionale Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Hoge-resolutie time-lapse beeldvorming en geautomatiseerde analyse van de dynamiek van microtubuli in Living humane navelstreng endotheelcellen

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...