Name: staining and high-resolution imaging of three-dimensional organoid and spheroid models
Uploaded: 2021-03-27T14:00:00
Duration: 7 min 35 s
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Ce travail a été soutenu par le St Baldrick’s Robert J. Arceci Innovation Award #604303.

<ol>
	<li>Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+system+methods+and+applications+for+mesenchymal+stem+cells.">Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells.</a> Cells. 8 (12), 1-13 (2019).</li><li>Bartfeld, S., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+organoids+and+their+application+for+medical+research+and+patient+treatment.">Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment.</a> Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).</li><li>Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+multicellular+spheroids+formation.">Advances in multicellular spheroids formation.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 14 (127), (2017).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation.">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1724-1743 (2016).</li><li>Rezanejad, H., Lock, J. H., Sullivan, B. A., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+pancreatic+ductal+organoids+and+whole-mount+immunostaining+of+intact+organoids.">Generation of pancreatic ductal organoids and whole-mount immunostaining of intact organoids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 82 (2019).</li><li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+systems+and+their+applications+in+drug+discovery+and+cell-based+biosensors.">Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).</li><li>McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+and+assessment+of+human+primary+prostate+organoid+culture.">Handling and assessment of human primary prostate organoid culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e59051 (2019).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li><li>Lazzari, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+fluorescence+microscopy+versus+confocal+microscopy:+in+quest+of+a+suitable+tool+to+assess+drug+and+nanomedicine+penetration+into+multicellular+tumor+spheroids.">Light sheet fluorescence microscopy versus confocal microscopy: in quest of a suitable tool to assess drug and nanomedicine penetration into multicellular tumor spheroids.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 142, 195-203 (2019).</li><li>Gabriel, J., Brennan, D., Elisseeff, J. H., Beachley, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+embedding/sectioning+for+parallel+analysis+of+3D+cell+spheroids.">Microarray embedding/sectioning for parallel analysis of 3D cell spheroids.</a> Scientific Reports. 9, 16287 (2019).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La culture cellulaire est un outil indispensable pour découvrir les mécanismes biologiques fondamentaux impliqués dans le développement, la fonction, la régénération et la perturbation des tissus et des organes, et la maladie. Bien que la culture cellulaire 2D monocouche ait prédominé, les recherches récentes se sont orientées vers des cultures générant des structures 3D reflétant davantage les réponses cellulaires in vivo, en raison notamment d’une organisation spatiale supplémentaire et de contacts cellule-cellule qui influencent l’expression des gènes et le comportement cellulaire et pourraient ainsi fournir des données plus prédictives7. Néanmoins, de nombreux défis demeurent, notamment le besoin de techniques de coloration et d’imagerie conviviales pour la visualisation microscopique détaillée et l’évaluation de structures 3D complexes aux niveaux cellulaire et subcellulaire. Dans ce contexte, des protocoles détaillés, robustes et complémentaires ont été fournis pour effectuer la coloration et l’imagerie de résolution cellulaire et subcellulaire de modèles de culture cellulaire 3D fixes in vitro allant de 100 μm à plusieurs millimètres.
Cette procédure présente deux stratégies différentes pour traiter une grande variété de tailles et de types de modèles de culture cellulaire 3D in vitro. Le choix de l’un (analyse 3D monture entière) ou de l’autre (analyse de sectionnement 2D) dépendra du modèle utilisé et du problème étudié. L’analyse 3D à monture entière par microscopie confocale permet de visualiser des cellules avec un champ de profondeur allant jusqu’à 200 μm, quelle que soit la taille globale de la structure 3D, tandis que la coupe 2D est applicable aux échantillons de toute taille, mais la visualisation reste dimensionnelle 2D. Vous trouverez ci-dessous quelques suggestions de dépannage et de considérations techniques.
La perte de structures 3D pendant le flux de travail est l’inconvénient le plus courant. Ils peuvent rester adhérents aux embouts et aux tubes, c’est pourquoi les embouts et tubes de prérevêtement avec une solution PBS-BSA à 0,1% sont essentiels. De plus, il est crucial de laisser les structures 3D sédimenter entre les changements de réactifs et d’effectuer tout le pipetage très soigneusement. Comme mentionné dans la procédure, pour toutes les étapes, si la sédimentation de la structure 3D est trop longue, les cellules peuvent être filées doucement à 50 × g pendant 5 min à TA. Selon l’objectif de l’étude, les avantages/inconvénients d’une telle étape de filature doivent être pris en compte car la centrifugation peut compromettre la forme des structures 3D. De plus, il faut veiller à préserver cette morphologie lors de l’étape de fixation car les organoïdes kystiques ont tendance à s’affaisser. La fixation de structures de moins de 400 μm devrait empêcher les changements structurels.
Pour un immunomarquage optimal, la récupération des organoïdes à partir de leurs matrices 3D est une étape cruciale. La matrice 3D peut empêcher une pénétration adéquate des anticorps ou entraîner une coloration de fond élevée en raison d’une liaison non spécifique à la matrice. L’élimination de la MEC peut modifier la morphologie des segments externes des organoïdes (notamment dans le cas de petites protubérances cellulaires s’étendant à partir de structures 3D étudiées) et entraver partiellement les analyses. Pour de telles structures 3D, la matrice peut être conservée tout au long de la procédure; Cependant, les conditions de culture doivent être soigneusement adaptées pour faire pousser des cellules dans une quantité minimale de matrice afin d’éviter une pénétration insuffisante des solutions et des anticorps et d’éviter les étapes successives de lavage visant à réduire le bruit de fond excessif 6,8.
L’étape de dégagement optique décrite dans ce protocole dans la section de coloration 3D de montage entier est pertinente pour l’imagerie de structures 3D jusqu’à 150-200 μm de profondeur au lieu de 50-80 μm sans effacement. Par rapport à d’autres méthodes de compensation qui nécessitent souvent plusieurs semaines et utilisant des agents de compensation toxiques, une étape de nettoyage rapide et sûre publiée précédemment a été utilisée dans ce protocole 4,9. De plus, cette étape de compensation est réversible, et de nouveaux anticorps peuvent être ajoutés à la coloration initiale sans perte de résolution ou de luminosité4. Néanmoins, selon le modèle de culture cellulaire 3D étudié, une profondeur de 150 à 200 μm pourrait ne pas être suffisante pour imager la structure 3D de manière informative, et ce protocole de nettoyage peut provoquer des changements dans la morphologie générale des organoïdes sphériques monocouches avec de grandes lumières4. Les utilisateurs doivent soigneusement concevoir leur expérience et, si nécessaire, optimiser le moment de l’étape de perméabilisation/blocage (pour permettre la pénétration des anticorps et de la solution), l’étape de dégagement (pour pénétrer à plus de 200 μm, les échantillons doivent être totalement effacés) et l’acquisition d’images. Les deux technologies les plus répandues disponibles dans les installations centrales seraient la microscopie à feuille légère et la microscopie confocale. Les utilisateurs devront choisir soigneusement une technologie en fonction de la taille de leurs structures 3D et de leur question biologique10. Cependant, par rapport à la microscopie confocale, la résolution de la microscopie à feuille de lumière obtenue pour de telles structures profondes reste sous-optimale pour obtenir une résolution subcellulaire.
Ici, un processus détaillé et robuste a été rapporté qui est dédié à l’incorporation de paraffine d’échantillons uniques. Fait intéressant, Gabriel et al. ont récemment développé un protocole intégrant des cultures cellulaires 3D dans de la paraffine avec un débit accru. Ils ont utilisé un moule polydiméthylsiloxane (PDMS) pour confiner 96 structures 3D dans un modèle de microréseau dans un seul bloc, offrant de nouvelles perspectives pour les études sur les modèles tumoraux 3D englobant plus de groupes, de points temporels, de conditions de traitement et de répliques11. Cependant, cette méthode nécessite des compétences et des machines étendues, notamment pour la fabrication du prémoule utilisé pour créer les moules PDMS.
En résumé, cet article décrit deux approches différentes, complémentaires et adaptables permettant l’acquisition d’informations précises et quantitatives sur la composition architecturale et cellulaire des modèles cellulaires 3D. Ces deux paramètres sont cruciaux pour étudier les processus biologiques tels que l’hétérogénéité cellulaire intratumorale et son rôle dans la résistance aux traitements.

Au cours des dernières décennies, les progrès de la biologie des cellules souches et des technologies de culture 3D in vitro ont annoncé une révolution en biologie et en médecine. Les modèles cellulaires de plus grande complexité en 3D sont devenus très populaires car ils permettent aux cellules de se développer et d’interagir avec un cadre extracellulaire environnant, récapitulant étroitement les aspects des tissus vivants, y compris leur architecture, l’organisation cellulaire et les interactions, ou même les caractéristiques de diffusion. En tant que tels, les modèles de culture cellulaire 3D peuvent fournir des informations uniques sur le comportement des cellules dans les tissus en développement ou malades in vitro. Les organoïdes et les sphéroïdes sont tous deux des structures 3D multicellulaires, allant de plusieurs micromètres à quelques millimètres, et sont les structures 3D in vitro les plus importantes. Les deux peuvent être cultivés dans un échafaudage de support, y compris (i) des hydrogels dérivés d’animaux (extrait de membrane basale, collagène), de plantes (alginate/agarose) ou synthétisés à partir de produits chimiques, ou (ii) des matrices inertes contenant des pores pour favoriser la prolifération et la croissance cellulaires.
Les organoïdes et les sphéroïdes peuvent également se développer sans la présence d’un échafaudage de soutien en s’appuyant sur les cellules pour s’auto-assembler en grappes. Cela repose sur différentes techniques telles que l’utilisation de matériaux non adhésifs pour inhiber la fixation des cellules, la tension superficielle et la force gravitationnelle (par exemple, les techniques de goutte suspendue) ou la rotation circulaire constante des vaisseaux (par exemple, la culture de spinner). Dans tous les cas, ces techniques facilitent les interactions cellule-cellule et cellule-matrice pour surmonter les limites de la culture cellulaire monocouche traditionnelle1. Les termes « organoïdes » et « sphéroïdes » ont été utilisés de manière interchangeable dans le passé, mais il existe des différences clés entre ces deux modèles de culture cellulaire 3D. Les organoïdes sont des amas cellulaires 3D in vitro dérivés de cellules souches pluripotentes ou de cellules souches spécifiques aux tissus, dans lesquels les cellules s’auto-organisent spontanément en progéniteurs et types cellulaires différenciés et qui récapitulent au moins certaines fonctions de l’organe d’intérêt2. Les sphéroïdes comprennent une gamme plus large de structures 3D multicellulaires formées dans des conditions non adhérentes et peuvent provenir d’une grande diversité de types cellulaires tels que les lignées cellulaires immortalisées ou les cellules primaires3. Par conséquent, inhérents à leurs origines intrinsèques de cellules souches, les organoïdes ont une propension plus élevée à l’auto-assemblage, à la viabilité et à la stabilité que les sphéroïdes.
Néanmoins, en substance, ces deux modèles sont des structures 3D composées de multiples cellules, et les techniques développées pour les étudier sont donc très similaires. Par exemple, des approches d’imagerie puissantes au niveau de résolution d’une seule cellule sont nécessaires pour sonder la complexité cellulaire des organoïdes et des sphéroïdes. Ici, en résumant l’expertise de ce groupe et celle des leaders dans le domaine des organoïdes4, cet article décrit en détail les procédures pour effectuer la coloration, l’imagerie et les analyses bidimensionnelles (2D) et 3D à montage entier de la composition cellulaire et subcellulaire et de l’organisation spatiale des organoïdes et des sphéroïdes allant de 100 μm à plusieurs millimètres. En effet, cette procédure présente deux types différents et complémentaires de coloration et d’acquisition d’imagerie pour analyser une grande variété de tailles et de types de modèles de culture cellulaire 3D in vitro. L’utilisation de l’un (analyse 3D monture entière) ou de l’autre (analyse de coupe 2D) dépendra du modèle étudié et des réponses recherchées. L’analyse 3D à montage entier par microscopie confocale peut, par exemple, être appliquée pour visualiser des cellules en culture 3D jusqu’à 200 μm de profondeur, quelle que soit la taille globale de la structure 3D, tandis que l’analyse de coupes 2D fournit des informations sur des échantillons de toute taille, bien qu’au niveau 2D. Cette procédure a été appliquée avec succès à une variété d’organoïdes4,5 et de sphéroïdes dérivés de cellules humaines et murines, provenant de différentes couches germinales embryonnaires. La figure 1 présente un aperçu de la procédure. Les grandes étapes, les relations entre elles, les étapes décisives et le calendrier prévu sont indiqués.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig01.jpg"> Figure 1 : Vue d’ensemble schématique de la procédure. Des modèles de culture cellulaire 3D in vitro sont collectés et fixés, puis préparés pour la coloration 3D sur support entier (option a) ou incorporés dans de la paraffine pour la coupe et la coloration 2D (option b). Pour les expériences de coloration 3D à montage entier, les structures 3D fixes sont immunomarquées après l’étape de fixation. Une étape optionnelle de nettoyage optique peut être effectuée pour améliorer la qualité d’imagerie et la profondeur de la microscopie optique en réduisant la diffusion de la lumière pendant le traitement de l’image. Les images sont capturées sur un microscope confocal inversé ou un système confocal à haut contenu et analysées à l’aide du logiciel approprié. Pour l’encastrement à la paraffine, les structures 3D sont directement traitées (option b.1 pour les grandes structures ≥ 400 μm) ou incluses dans un gel (b.2; petites structures ≤ 400 μm) pour la déshydratation et l’incorporation à la paraffine. Les blocs de paraffine sont ensuite coupés et colorés (coloration histologique ou immunochimique). Les images des coupes 2D sont obtenues sur un scanner numérique à lames ou un microscope droit et analysées sur une plate-forme d’analyse d’images à l’aide d’une analyse quantitative numérique rapide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy pad Q Path blue</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes macrostar III Blc couv. Char. x1500</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassette microtwin white</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical hood</td>
			<td>Erlab</td>
			<td>FI82 5585-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips 1000 &#181;L</td>
			<td>Star lab Tip-One</td>
			<td>S1122-1730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Pyramid innovation</td>
			<td>R35002-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottom glass tubes with PTFE lined 2 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11784259</td>
			<td>Excellent&#160; for environmental&#160;&#160;&#160; samples,&#160;&#160;&#160; pharmaceuticals and diagnostic reagents. PTFE is designed for the ultimate in product safety. PTFE provides totally inert inner seal and surface facing the sample or product.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish plate 35 mm</td>
			<td>Ibedi</td>
			<td>2018003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal agitation</td>
			<td>N-BIOTEK</td>
			<td>NB-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator prewarmed to 65 &#176;C</td>
			<td>Memmert Incubator</td>
			<td>LAB129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inox molds 15x15</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-1918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides Matsunami TOMO-11/90</td>
			<td>Roche diagnostics</td>
			<td>8082286001</td>
			<td>these slides are used for a better adhesion of sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>HM340E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panoramic scan II</td>
			<td>3dhistech</td>
			<td>2397612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin embedding equipment</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette Pasteur 2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Path flacon 150mL cape blanc x250</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-1308</td>
			<td>Good for environmental&#160;&#160;&#160; samples,&#160;&#160;&#160; pharmaceuticals and diagnostic reagents. Polypropylene (PP) are rigid,&#160; solid, provide excellent&#160; stress&#160; crack&#160; and&#160; impact&#160; resistance and have a&#160; good oil and alcohol barrier and chemical resistance. PE-lined cap is stress crack resistant and offers&#160; excellent&#160; sealing&#160; characteristics.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Set of micropipettors&#160; (p200, p1000)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11877351 (20-200) 11887351(p1000)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPERA PHENIX</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>HH14000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP5 inverted confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LSM780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue cassette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-0228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiomager microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SIP 60549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoblock (kit)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10066588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57648266</td>
			<td>CAUTION: toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin aqueous 1%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT110316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83804.360</td>
			<td>CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.365</td>
			<td>CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin 4%</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>F/40877-36</td>
			<td>CAUTION: Formalin contains formaldehyde which is hazardous. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fructose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gill hematoxylin type II</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>F/CP813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td>CAUTION: Suspected of causing genetic defects.&#160; Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Wax tek III</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS) 1 X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Buffered Saline (TBS) 10X</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>F/00801</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8532</td>
			<td>CAUTION: Triton X&#173;100 is hazardous. Avoid contact with skin and eyes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>534056</td>
			<td>CAUTION: Xylene is toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Clearing solution</td>
			<td>Glycerol-Fructose clearing solution is 60% (vol/w) glycerol and 2.5 M fructose. To prepare 10 mL of this solution, mix 6 mL of glycerol and 4.5 g of fructose. Complete to 10 mL with dH2O. Use a magnetic stirrer overnight. Refractive index = 1.4688 at room temperature (RT: 19&#8211;23 &#176;C). Store at 4 &#176;C in dark for up to 1 month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">PBS-BSA 0,1% solution</td>
			<td>To prepare 0,1% (vol/wt) PBS-BSA 0,1% solution, dissolve 500 mg of BSA in 50 mL of PBS-1X (store at 4&#176;C for up to 2 weeks). And dilute 1mL of this solution into 9mL of PBS-1X. This solution can be used to precoat the tip and centrifugation tube.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Permeabilisation-blocking solution (PB solution)</td>
			<td>The PBSDT blocking solution is PBS-1X supplemented with 0.1% &#8211; 1% Tritonx-100 (depending on the protein localization membrane/nucleus), 1% DMSO, 1% BSA and 1% donkey serum (or from the animal in which the secondary antibodies were raised). This solution can be stored at 4&#176;C for up to 1 month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">PB:PBS-1X &#160;(1:10) solution</td>
			<td>PB:PBS-1X &#160;(1:10) solution is a 10 time diluted PB solution. To prepare 10 mL of this solution dilute 1 mL of PB solution in 9 mL of PBS-1X.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halo software</td>
			<td>Indicalabs</td>
			<td>NM 87114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harmony software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>HH17000010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

staining and high-resolution imaging of three-dimensional organoid and spheroid models

Les modèles de culture cellulaire tridimensionnelle (3D) in vitro, tels que les organoïdes et les sphéroïdes, sont des outils précieux pour de nombreuses applications, notamment le développement et la modélisation des maladies, la découverte de médicaments et la médecine régénérative. Pour exploiter pleinement ces modèles, il est crucial de les étudier aux niveaux cellulaire et subcellulaire. Cependant, la caractérisation de tels modèles de culture cellulaire 3D in vitro peut être techniquement difficile et nécessite une expertise spécifique pour effectuer des analyses efficaces. Ici, cet article fournit des protocoles détaillés, robustes et complémentaires pour effectuer la coloration et l’imagerie de résolution subcellulaire de modèles de culture cellulaire 3D in vitro fixes allant de 100 μm à plusieurs millimètres. Ces protocoles sont applicables à une grande variété d’organoïdes et de sphéroïdes qui diffèrent par leurs conditions de cellule d’origine, de morphologie et de culture. De la récolte de structures 3D à l’analyse d’images, ces protocoles peuvent être complétés en 4-5 jours. En bref, les structures 3D sont collectées, fixées et peuvent ensuite être traitées soit par incorporation de paraffine et coloration histologique / immunohistochimique, soit directement immunomarquées et préparées pour le nettoyage optique et la reconstruction 3D (profondeur de 200 μm) par microscopie confocale.

Ce protocole fournit une vue d’ensemble des étapes critiques pour la coloration 2D et 3D à monture entière, ainsi que l’imagerie et les analyses quantitatives de modèles de culture cellulaire 3D (Figure 3 et Figure 4). Il est applicable à un large éventail de modèles de culture cellulaire 3D - des sphéroïdes aux organoïdes de différentes espèces ou tissus hôtes - et permet l’acquisition d’informations précises et quantitatives sur l’architecture, l’organisation cellulaire et les interactions aux niveaux cellulaire et subcellulaire (Figure 3 et Figure 4). Les laboratoires peuvent avoir besoin d’optimiser les techniques histologiques et immunohistochimiques 2D et les concentrations d’anticorps en fonction de leurs propres besoins.
Les deux méthodes fournissent des informations biologiques précieuses. La coloration 3D à montage entier et la microscopie confocale fournissent des informations visuelles sur la composition cellulaire et la position spatiale avec un champ de profondeur allant jusqu’à 200 μm (Figure 3B). Cependant, la coupe 2D est pratique pour les grandes structures 3D afin de révéler des traits morphologiques cellulaires détaillés dans toute la section des structures 3D qui peuvent être autrement difficiles à observer in situ en raison de la diffusion de la lumière qui compromet la résolution dans des échantillons plus grands. De plus, les deux techniques peuvent fournir des données quantitatives. En effet, la résolution obtenue permet l’application d’algorithmes de segmentation cellulaire et subcellulaire pour la quantification du nombre de cellules et la détection de la présence de divers marqueurs cellulaires dans différents sous-types cellulaires (Figure 3F et Figure 4). En résumé, les techniques d’imagerie décrites ici sont reproductibles, simples et complémentaires et représentent des outils précieux pour étudier l’hétérogénéité cellulaire.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig03.jpg"> Figure 3 : Résultats représentatifs pour le montage entier 3D, l’imagerie et les analyses de coupes optiques 3D et 2D. (A) Images confocales de sphéroïdes de gliome humain (h) de haut grade cultivés pendant une semaine et marqués avec Hoechst (bleu), Olig2 (jaune) et Actine (rouge) (objectif d’eau 20x). Pour toutes les images acquises, les réglages du microscope ont été établis à l’aide d’un témoin positif (en haut), puis le contrôle négatif a été imagé en utilisant des paramètres identiques pour contrôler le manque de fluorescence en l’absence d’anticorps primaire (en bas). (B) Représentation orthogonale 3D intégrale de la coloration Ki67 réalisée dans (h) un sphéroïde de gliome de haut grade cultivé pendant une semaine (élimination glycérol-fructose; objectif eau 20x, confocale). (C) Images confocales de (h) gliome sphéroïde de haut grade cultivé pendant une semaine et marqué avec Hoechst (bleu), Olig2 (jaune) et Phalloidine-488 (vert) (élimination glycérol-fructose; objectif 20x eau). (D) Images confocales de sphéroïdes humains (h) rhabdomyosarcomes (en haut) et de souris (m) à cellules de crête neurale (en bas) cultivées pendant une semaine et marquées avec Hoechst (bleu), Actine (rouge) et Ki67 (vert), respectivement (élimination glycérol-fructose; objectif sec 20x). (E) Images confocales de (h) gliome sphéroïde de haut grade cultivé pendant une semaine et étiqueté avec Hoechst (bleu) et Ki67 (vert) (élimination glycérol-fructose; objectif 40x eau) (en haut à gauche). Des images segmentées sur le canal de Hoechst et des régions nucléaires Ki67-positives (+) sur le canal vert ont été générées à l’aide d’un logiciel d’analyse à haut contenu (voir la figure supplémentaire 1 et le tableau des matériaux) (en bas). La sortie donnée est le pourcentage de noyaux Ki67+ par structure 3D segmentée (en haut à droite). Barre d’échelle = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig04.jpg"> Figure 4 : Résultats représentatifs pour l’imagerie et l’analyse de coupes optiques 2D. (A, D) Images de coupe 2D d’un modèle cellulaire 3D (sphéroïdes de rhabdomyosarcome humain cultivés pendant un mois) obtenues avec un scanner numérique de lames et analysées sur une plate-forme d’analyse quantitative numérique rapide. (A) Coloration H&E et détection des cellules en fonction de leur taille. Barre d’échelle = 500 μm. (B) L’histogramme montre le pourcentage de cellules < 100 μm 2 et > 100 μm2 détectées à l’aide d’un logiciel d’analyse quantitative numérique rapide (à gauche : Halo) ou de comptage manuel (à droite : MC). (C) Coloration Ki67 et détection des cellules en fonction de l’intensité de leur signal 3,3'-diaminobenzidine (DAB). Négatif (bleu), faiblement positif (jaune), positif (rouge). Barre d’échelle = 500 μm. (D) L’histogramme montre le pourcentage de cellules Ki67-négatives, faiblement positives et positives. Abréviations : H & E = hématoxyline et éosine; MC = comptage manuel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Figure supplémentaire 1 : Vue d’ensemble des étapes du logiciel d’analyse d’imagerie. Les analyses sont basées sur l’association de blocs de construction. Chaque bloc de construction correspondant à une fonction - segmentation, calcul, association, définition de sortie - et offre plusieurs algorithmes et sélections de variables pour correspondre à l’échantillon biologique en cours d’image. Le logiciel fournit plusieurs protocoles d’analyse RMS (Ready Made Solution) qui peuvent facilement être utilisés et modifiés. Les protocoles d’analyse d’images intégrés peuvent être enregistrés, appliqués à différents jeux de données et partagés entre les utilisateurs. En bref, le protocole d’analyse implique une segmentation séquentielle des objets : sphéroïdes, noyaux et enfin, poches Ki67 (A488). Ensuite, l’intensité moyenne des poches de Ki67 est calculée pour discriminer davantage les événements positifs. Enfin, les noyaux englobant les poches positives Ki67 sont sélectionnés positivement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/Suppl1_Harmony%20analysis_Revised.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire 2 : Vue d’ensemble des étapes de procédure du logiciel d’analyse quantitative. Étape 1. Téléchargez les fichiers à l’aide de l’onglet Études . Les fichiers seront ouverts dans la section Actions d’image . Étape 2. Ouvrez l’onglet Annotations , puis cliquez sur Actions de calque pour concevoir un nouveau calque tout autour de la structure à l’aide de l’outil cercle de la barre d’outils. Pour les structures non circulaires, l’outil Stylo peut être utilisé à la place. Étape 3. La barre d’outils peut être utilisée pour concevoir des annotations et visualiser la quantification avec l’outil <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62280/62280eq01.jpg">. Étape 4. Ouvrez l’onglet Analyse et sélectionnez les meilleures conditions pour l’analyse de l’échantillon (plusieurs essais peuvent être nécessaires ici). Étape 4.1. Utilisez la section Sélection des taches pour configurer l’état de coloration. En cas de plusieurs taches, celles-ci peuvent être ajoutées et renommées, et la couleur virtuelle peut être modifiée. La détection de localisation peut être spécifiée-coloration nucléaire ou cytoplasme. Étape 4.2. Utilisez la section Détection de cellule pour configurer la détection de cellule . Cette section sera la plus importante pour l’analyse. La section Seuil de contraste nucléaire permettra la détection de tous les noyaux. Il faut faire attention au cas où il y aurait plusieurs tailles de population, le logiciel peut détecter plusieurs cellules au lieu d’une grande unique. Les sections Taille nucléaire et Agressivité de segmentation nucléaire peuvent être utilisées pour quantifier les fourchettes de taille de population cellulaire. Étape 5. Description de l’exécution de l’analyse des échantillons. Suivez les étapes indiquées dans la figure. La section Calque d’annotation exécutera le paramètre uniquement sur cette diapositive. La quantification peut être visualisée à l’aide de l’outil <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62280/62280eq01.jpg">. Répétez les étapes 4.1 à 5 jusqu’à ce que la quantification appropriée soit atteinte. Étapes 6-6.1. Ces étapes vous permettent de dessiner une figure à l’aide du logiciel. Étape 7. Les graphiques de quantification obtenus via un logiciel peuvent être enregistrés. Étape 8. Les données peuvent être exportées. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/Suppl2_Halo%20Images_revised.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

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Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

Ici, nous fournissons des protocoles détaillés, robustes et complémentaires pour effectuer la coloration et l’imagerie de résolution subcellulaire de modèles de culture cellulaire tridimensionnelle fixes allant de 100 μm à plusieurs millimètres, permettant ainsi la visualisation de leur morphologie, de leur composition de type cellulaire et de leurs interactions.

Coloration et imagerie haute résolution de modèles organoïdes et sphéroïdes tridimensionnels

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...

La caractérisation d’un modèle 3D in vitro à la résolution cellulaire et subcellulaire est cruciale pour la pleine exploitation, mais peut être difficile. Par conséquent, nous avons fourni un protocole complémentaire pour la coloration et l’imagerie de résolution subcellulaire de modèles 3D in vitro fixes allant de 100 micromètres à plusieurs millimètres. Les structures 3D sont radiales et doivent être manipulées avec soin.Avant de pipeter, vérifiez l’emplacement de vos structures 3D dans le tube pour éviter toute aspiration. Comme nous avons adapté les techniques classiques pour l’intégration de petites structures telles que les organoïdes ou les sphéroïdes, les instructions visualisées peuvent aider les nouveaux utilisateurs à effectuer la tâche plus facilement. Laura Francols, technicienne de laboratoire de la Plateforme de recherche en pathologie, fera la démonstration de la procédure avec moi.Pour préparer des échantillons pour la coloration 3D de montage entier, utilisez une pointe de pipette d’un millilitre pré-codée avec BSA pour ajouter une suspension de structure 3D d’un millilitre à un tube de 500 microlitres de PBS. Lorsque les structures 3D se sont installées au fond du tube, remplacez soigneusement le PBS par 500 microlitres de solution de blocage de perméabilisation pour une incubation d’une heure à température ambiante avec une agitation horizontale douce à 30 à 50 tours par minute. À la fin de l’incubation, laissez les structures 3D sédimenter à nouveau avant de laver soigneusement les structures 3D deux fois dans un millilitre de PBS à 0,1% supplémenté en BSA pendant trois minutes par lavage.Après le dernier lavage, étiqueter les structures 3D avec 250 microlitres d’anticorps primaires dans PBS pendant deux à trois jours avec une agitation horizontale douce à quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, laver l’échantillon avec cinq lavages de trois minutes et deux lavages de 15 minutes dans un millilitre de PBS BSA à 0,1% par lavage. Après le dernier lavage, étiqueter les structures 3D avec 250 microlitres de l’anticorps secondaire approprié dans du PBS pendant 24 heures à quatre degrés Celsius avec une légère agitation horizontale protégée de la lumière.Le lendemain, étiquetez les structures 3D avec 250 microlitres de la concentration appropriée de Hoechst 3342 pour une incubation de deux heures à quatre degrés Celsius avec une agitation horizontale douce. À la fin de l’incubation, lavez les structures 3D cinq fois pendant trois minutes et deux fois pendant 15 minutes dans un millilitre de PBS par lavage comme démontré. Après le dernier lavage, transférez les structures 3D sur une microplaque de polystyrène noir à 96 puits et ajoutez doucement 200 microlitres de solution de nettoyage sur les structures, en évitant les bulles.Ensuite, placez la plaque recouverte de papier d’aluminium à quatre degrés Celsius pendant au moins 48 heures. Pour intégrer de grands modèles de culture cellulaire 3D, utilisez une pointe de pipette d’un millilitre revêtue de BSA pour transférer soigneusement les structures 3D dans un tube de verre à fond plat avec un bouchon de bouteille doublé de PTFE. Une fois les structures déposées, remplacez soigneusement le PBS par de l’éthanol à 70 % pour une incubation de 30 minutes à température ambiante.À la fin de l’incubation, remplacez l’éthanol à 70% par un millilitre de solution d’éosine Y prête à l’emploi. Agitez le tube et colorez les structures pendant au moins 30 minutes. À la fin de l’incubation, déshydrater les structures avec trois lavages successifs de 30 minutes dans un millilitre d’éthanol à 100% par lavage.Après la dernière déshydratation, nettoyez les structures 3D avec trois lavages successifs de 30 minutes dans un millilitre de xylène par lavage sous une hotte chimique. Après la dernière immersion au xylène, placez un morceau de tampon de biopsie imbibé de xylène dans un compartiment d’une cassette de tissu microtwin blanc et utilisez une pipette Pasteur en plastique de deux millilitres revêtue de BSA pour transférer les structures 3D sur le tampon. Couvrez les structures 3D avec un autre tampon de biopsie imbibé de xylène pour maintenir les structures 3D en place et fermez la cassette.Lorsque tous les échantillons ont été transférés, placez les cassettes dans un bain de paraffine de 65 degrés Celsius pendant 30 minutes avant de placer les cassettes dans un bain de paraffine fraîche de 65 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, ajoutez de la paraffine liquide à un moule d’enrobage chauffé à 65 degrés Celsius par échantillon et placez un échantillon de paraffine incorporé dans chaque moule. Agitez doucement les moules jusqu’à ce que toutes les structures 3D tombent au fond et utilisez des pinces fines chauffées à 65 degrés Celsius pour positionner les structures 3D au centre de chaque moule.Refroidissez le moule jusqu’à ce que la paraffine forme une fine couche solide, fixant la structure 3D en place. Placez une cassette de mouchoir et ajoutez de la paraffine chaude sur le moule. Retirez la moisissure lorsque la paraffine s’est complètement solidifiée.Pour intégrer de petits modèles de culture cellulaire 3D, lavez doucement les structures 3D trois fois dans un millilitre de TBS par lavage. Après le dernier lavage, retirer autant de TBS que possible sans toucher les structures et ajouter deux gouttes de réactif deux d’un kit d’enrobage de paraffine commerciale. Mélanger doucement en tapotant et ajouter deux gouttes de réactif, une avec tapotement jusqu’à ce que le gel se solidifie.Utilisez une pince fine pour transférer le gel du puits de la cassette préassemblée du kit et déshydratez l’échantillon de gel incorporé avec des incubations ascendantes d’éthanol et de xylène de 30 minutes dans une hotte comme indiqué. Après la dernière immersion au xylène, placez la cassette dans un bain de paraffine de 65 degrés Celsius pendant la nuit avant d’utiliser de fines pinces pour transférer l’échantillon de paraffine incorporé au centre d’un moule d’enrobage réchauffé à 65 degrés Celsius chargé de paraffine liquide. Ensuite, fixez la structure 3D avec une couche supplémentaire de paraffine comme démontré pour les grands modèles de culture cellulaire 3D.La coloration tridimensionnelle à monture entière et la microscopie confocale fournissent des informations visuelles sur la composition cellulaire et la position spatiale des modèles de culture 3D à un champ de profondeur allant jusqu’à 200 microns. La haute résolution qui peut être obtenue pour les structures 3D en utilisant ce protocole permet l’application d’algorithmes de segmentation cellulaire et subcellulaire pour la quantification du nombre de cellules et la détection de divers marqueurs cellulaires au sein de différents sous-types cellulaires. L’analyse des montures entières 3D peut être appliquée à des cellules visualisées jusqu’à 200 microns de profondeur, quelles que soient les structures entières.Au contraire, l’analyse de section 2D peut fournir des informations sur les cellules de toute taille.

Research

JoVE Journal

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