Name: staining and high-resolution imaging of three-dimensional organoid and spheroid models
Uploaded: 2021-03-27T14:00:00
Duration: 7 min 35 s
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Diese Arbeit wurde durch den St Baldrick's Robert J. Arceci Innovation Award #604303 unterstützt.

<ol>
	<li>Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+system+methods+and+applications+for+mesenchymal+stem+cells.">Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells.</a> Cells. 8 (12), 1-13 (2019).</li><li>Bartfeld, S., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+organoids+and+their+application+for+medical+research+and+patient+treatment.">Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment.</a> Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).</li><li>Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+multicellular+spheroids+formation.">Advances in multicellular spheroids formation.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 14 (127), (2017).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation.">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1724-1743 (2016).</li><li>Rezanejad, H., Lock, J. H., Sullivan, B. A., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+pancreatic+ductal+organoids+and+whole-mount+immunostaining+of+intact+organoids.">Generation of pancreatic ductal organoids and whole-mount immunostaining of intact organoids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 82 (2019).</li><li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+systems+and+their+applications+in+drug+discovery+and+cell-based+biosensors.">Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).</li><li>McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+and+assessment+of+human+primary+prostate+organoid+culture.">Handling and assessment of human primary prostate organoid culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e59051 (2019).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li><li>Lazzari, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+fluorescence+microscopy+versus+confocal+microscopy:+in+quest+of+a+suitable+tool+to+assess+drug+and+nanomedicine+penetration+into+multicellular+tumor+spheroids.">Light sheet fluorescence microscopy versus confocal microscopy: in quest of a suitable tool to assess drug and nanomedicine penetration into multicellular tumor spheroids.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 142, 195-203 (2019).</li><li>Gabriel, J., Brennan, D., Elisseeff, J. H., Beachley, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+embedding/sectioning+for+parallel+analysis+of+3D+cell+spheroids.">Microarray embedding/sectioning for parallel analysis of 3D cell spheroids.</a> Scientific Reports. 9, 16287 (2019).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Zellkultur ist ein unverzichtbares Werkzeug, um grundlegende biologische Mechanismen aufzudecken, die an der Entwicklung, Funktion, Regeneration und Störung von Geweben und Organen sowie an Krankheiten beteiligt sind. Obwohl die einschichtige 2D-Zellkultur vorherrschte, hat sich die neuere Forschung in Richtung Kulturen verlagert, die 3D-Strukturen erzeugen, die die zellulären Reaktionen in vivo besser widerspiegeln, insbesondere aufgrund zusätzlicher räumlicher Organisation und Zell-Zell-Kontakte, die die Genexpression und das zelluläre Verhalten beeinflussen und somit prädiktivere Daten liefern könnten7. Dennoch bleiben viele Herausforderungen bestehen, einschließlich des Bedarfs an benutzerfreundlichen Färbe- und Bildgebungstechniken für die detaillierte mikroskopische Visualisierung und Bewertung komplexer 3D-Strukturen auf zellulärer und subzellulärer Ebene. In diesem Zusammenhang wurden detaillierte, robuste und komplementäre Protokolle zur Verfügung gestellt, um Färbung und zelluläre und subzelluläre Bildgebung von fixierten In-vitro-3D-Zellkulturmodellen mit einer Größe von 100 μm bis zu mehreren Millimetern durchzuführen.
Dieses Verfahren stellt zwei verschiedene Strategien vor, um mit einer Vielzahl von Größen und Arten von In-vitro-3D-Zellkulturmodellen umzugehen. Die Wahl des einen (3D-Ganzmontageanalyse) oder des anderen (2D-Schnittanalyse) hängt vom verwendeten Modell und dem untersuchten Problem ab. Die 3D-Whole-Mount-Analyse mittels konfokaler Mikroskopie ermöglicht die Visualisierung von Zellen mit einem Tiefenfeld von bis zu 200 μm, unabhängig von der Gesamtgröße der 3D-Struktur, während die 2D-Schnitte für Proben jeder Größe anwendbar sind, die Visualisierung jedoch 2D-dimensional bleibt. Im Folgenden finden Sie einige Vorschläge zur Fehlerbehebung und technische Überlegungen.
Der Verlust von 3D-Strukturen während des Workflows ist der häufigste Nachteil. Sie können an den Spitzen und Rohren haften, weshalb die Vorbeschichtung von Spitzen und Rohren mit PBS-BSA 0,1% iger Lösung von entscheidender Bedeutung ist. Darüber hinaus ist es wichtig, die 3D-Strukturen zwischen den Reagenzienwechseln sedimentieren zu lassen und alle Pipettierungen sehr sorgfältig durchzuführen. Wie in der Prozedur erwähnt, können die Zellen bei einer zu langen 3D-Struktursedimentation bei 50 × g für 5 min bei RT vorsichtig gesponnen werden. Je nach Ziel der Studie sollten die Vor- und Nachteile eines solchen Spinnschritts berücksichtigt werden, da die Zentrifugation die Form der 3D-Strukturen beeinträchtigen kann. Darüber hinaus sollte darauf geachtet werden, dass diese Morphologie während des Fixierungsschritts erhalten bleibt, da zystische Organoide zum Kollaps neigen. Durch die Fixierung von Strukturen mit einer Größe von weniger als 400 μm sollen strukturelle Veränderungen verhindert werden.
Für eine optimale Immunmarkierung ist die Rückgewinnung von Organoiden aus ihren 3D-Matrizen ein entscheidender Schritt. Die 3D-Matrix kann eine ausreichende Penetration von Antikörpern behindern oder aufgrund der unspezifischen Bindung an die Matrix zu einer hohen Hintergrundfärbung führen. Die EZM-Entfernung kann die Morphologie der äußeren Segmente von Organoiden verändern (insbesondere bei kleinen Zellvorsprüngen, die sich von untersuchten 3D-Strukturen erstrecken) und die Analyse teilweise behindern. Bei solchen 3D-Strukturen kann die Matrix während des gesamten Verfahrens beibehalten werden. Die Kulturbedingungen sollten jedoch sorgfältig angepasst werden, um Zellen in einer minimalen Menge an Matrix zu züchten, um ein unzureichendes Eindringen von Lösungen und Antikörpern zu verhindern und aufeinanderfolgende Waschschritte zu vermeiden, die darauf abzielen, übermäßige Hintergrundgeräusche zu reduzieren 6,8.
Der in diesem Protokoll beschriebene optische Clearing-Schritt im Abschnitt 3D-Whole-Mount-Färbung ist für die Abbildung von 3D-Strukturen bis zu einer Tiefe von 150-200 μm anstelle von 50-80 μm ohne Clearing relevant. Im Vergleich zu anderen Clearing-Methoden, die oft mehrere Wochen in Anspruch nehmen und toxische Clearing-Mittel verwenden, wurde in diesem Protokoll 4,9 ein zuvor veröffentlichter schneller und sicherer Clearing-Schritt verwendet. Darüber hinaus ist dieser Clearing-Schritt reversibel, und neue Antikörper können der ersten Färbung ohne Verlust der Auflösung oder Helligkeit hinzugefügt werden4. Je nach untersuchtem 3D-Zellkulturmodell reicht jedoch eine Tiefe von 150-200 μm möglicherweise nicht aus, um die 3D-Struktur informativ abzubilden, und dieses Clearingprotokoll kann zu Veränderungen in der allgemeinen Morphologie von kugelförmigen, einschichtigen Organoiden mit großen Lumenführen 4. Anwender sollten ihr Experiment sorgfältig planen und, falls erforderlich, das Timing des Permeabilisierungs-/Blockierungsschritts (um das Eindringen von Antikörpern und Lösung zu ermöglichen), des Clearing-Schritts (um tiefer als 200 μm einzudringen, sollten die Proben vollständig freigegeben werden) und der Bildaufnahme optimieren. Die beiden am weitesten verbreiteten Technologien, die in Core Facilities verfügbar sind, sind die Lichtblatt- und die konfokale Mikroskopie. Benutzer müssen eine Technologie sorgfältig auswählen, die auf der Größe ihrer 3D-Strukturen und ihrer biologischen Fragebasiert 10. Im Vergleich zur konfokalen Mikroskopie bleibt die Auflösung der Lichtblattmikroskopie, die für solche tiefen Strukturen erhalten wird, jedoch suboptimal, um eine subzelluläre Auflösung zu erhalten.
Hier wurde über einen detaillierten und robusten Prozess berichtet, der der Paraffineinbettung einzelner Proben gewidmet ist. Interessanterweise haben Gabriel et al. kürzlich ein Protokoll entwickelt, das 3D-Zellkulturen in Paraffin mit erhöhtem Durchsatz einbettet. Sie verwendeten eine Polydimethylsiloxan (PDMS) -Form, um 96 3D-Strukturen in einem Microarray-Muster in einem Block einzuschließen, was neue Perspektiven für Studien zu 3D-Tumormodellen bietet, die mehr Gruppen, Zeitpunkte, Behandlungsbedingungen und Replikate umfassen11. Diese Methode erfordert jedoch umfangreiche Fähigkeiten und Maschinen, insbesondere für die Herstellung der Vorform, die zur Herstellung von PDMS-Formen verwendet wird.
Zusammenfassend beschreibt dieser Artikel zwei verschiedene, komplementäre und anpassungsfähige Ansätze, die es ermöglichen, genaue und quantitative Informationen über die architektonische und zelluläre Zusammensetzung von 3D-Zellmodellen zu erhalten. Beide Parameter sind entscheidend für die Untersuchung biologischer Prozesse wie der intratumoralen zellulären Heterogenität und ihrer Rolle bei der Resistenz gegen Behandlungen.

In den letzten Jahrzehnten haben Fortschritte in der Stammzellbiologie und In-vitro-3D-Kulturtechnologien eine Revolution in Biologie und Medizin eingeläutet. Zellmodelle mit höherer Komplexität in 3D sind sehr beliebt geworden, da sie es Zellen ermöglichen, zu wachsen und mit einem umgebenden extrazellulären Gerüst zu interagieren und Aspekte lebender Gewebe einschließlich ihrer Architektur, Zellorganisation und -interaktionen oder sogar Diffusionseigenschaften genau zu rekapitulieren. So können 3D-Zellkulturmodelle einzigartige Einblicke in das Verhalten von Zellen in sich entwickelnden oder erkrankten Geweben in vitro liefern. Organoide und Sphäroide sind beide mehrzellige 3D-Strukturen, die von einigen Mikrometern bis zu Millimetern reichen und die prominentesten In-vitro-3D-Strukturen sind. Beide können in einem Trägergerüst kultiviert werden, einschließlich (i) Hydrogele, die aus Tieren (Basalmembranextrakt, Kollagen), Pflanzen (Alginat / Agarose) gewonnen oder aus Chemikalien synthetisiert werden, oder (ii) inerte Matrizen, die Poren enthalten, um die Zellproliferation und das Zellwachstum zu fördern.
Organoide und Sphäroide können sich auch ohne das Vorhandensein eines Stützgerüsts entwickeln, indem sie sich auf Zellen verlassen, um sich selbst zu Clustern zusammenzusetzen. Dies beruht auf verschiedenen Techniken, wie z. B. der Verwendung von nicht adhäsiven Materialien zur Hemmung der Zellanhaftung, der Oberflächenspannung und der Gravitationskraft (z. B. Hanging-Drop-Techniken) oder der konstanten kreisförmigen Rotation von Gefäßen (z. B. Spinnerkultur). In allen Fällen erleichtern diese Techniken Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen, um die Einschränkungen der traditionellen einschichtigen Zellkulturzu überwinden 1. Die Begriffe "Organoide" und "Sphäroide" wurden in der Vergangenheit synonym verwendet, aber es gibt wesentliche Unterschiede zwischen diesen beiden 3D-Zellkulturmodellen. Organoide sind in vitro 3D-Zellcluster, die von pluripotenten Stammzellen oder gewebespezifischen Stammzellen abgeleitet sind, in denen sich Zellen spontan in Vorläuferzellen und differenzierte Zelltypen organisieren und die zumindest einige Funktionen des interessierenden Organs rekapitulieren2. Sphäroide umfassen ein breiteres Spektrum von mehrzelligen 3D-Strukturen, die unter nicht-adhärenten Bedingungen gebildet werden und aus einer großen Vielfalt von Zelltypen wie immortalisierten Zelllinien oder Primärzellen entstehenkönnen 3. Daher haben Organoide aufgrund ihrer intrinsischen Stammzellherkunft eine höhere Neigung zur Selbstorganisation, Lebensfähigkeit und Stabilität als Sphäroide.
Dennoch handelt es sich bei diesen beiden Modellen im Wesentlichen um 3D-Strukturen, die aus mehreren Zellen bestehen, und die Techniken, die zu ihrer Untersuchung entwickelt wurden, sind daher sehr ähnlich. Zum Beispiel sind leistungsfähige bildgebende Ansätze auf der Ebene der Einzelzellauflösung notwendig, um die zelluläre Komplexität sowohl von Organoiden als auch von Sphäroiden zu untersuchen. Durch die Zusammenfassung der Expertise dieser Gruppe und der führenden Unternehmen auf dem Gebiet der Organoide4 beschreibt dieser Artikel detaillierte Verfahren zur Durchführung von zweidimensionalen (2D) und 3D-Whole-Mount-Färbungen, Bildgebung und Analysen der zellulären und subzellulären Zusammensetzung und der räumlichen Organisation von Organoiden und Sphäroiden im Bereich von 100 μm bis zu mehreren Millimetern. In der Tat stellt dieses Verfahren zwei verschiedene und komplementäre Arten der Färbung und Bildgebung dar, um eine Vielzahl von Größen und Arten von In-vitro-3D-Zellkulturmodellen zu analysieren. Die Verwendung des einen (3D-Whole-Mount-Analyse) oder des anderen (2D-Schnittanalyse) hängt vom untersuchten Modell und den gesuchten Antworten ab. Die 3D-Whole-Mount-Analyse mittels konfokaler Mikroskopie kann beispielsweise eingesetzt werden, um Zellen in 3D-Kulturen bis zu 200 μm Tiefe zu visualisieren, unabhängig von der Gesamtgröße der 3D-Struktur, während die Analyse von 2D-Schnitten Einblicke in Proben beliebiger Größe ermöglicht, wenn auch auf 2D-Ebene. Dieses Verfahren wurde erfolgreich auf eine Vielzahl von Organoiden4,5 und Sphäroide angewendet, die aus menschlichen und murinen Zellen stammen und aus verschiedenen embryonalen Keimblättern stammen. Die Übersicht über das Verfahren ist in Abbildung 1 dargestellt. Die wichtigsten Phasen, die Beziehungen zwischen ihnen, entscheidende Schritte und das erwartete Timing werden angegeben.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Übersicht des Verfahrens. In-vitro-3D-Zellkulturmodelle werden gesammelt und fixiert, dann entweder für die 3D-Ganzkörperfärbung vorbereitet (Option a) oder in Paraffin eingebettet (Option b). Bei 3D-Whole-Mount-Färbeexperimenten werden fixierte 3D-Strukturen nach dem Fixierungsschritt immunmarkiert. Ein optionaler optischer Clearing-Schritt kann durchgeführt werden, um die Abbildungsqualität und -tiefe der optischen Mikroskopie zu verbessern, indem die Lichtstreuung während der Bildverarbeitung reduziert wird. Die Bilder werden mit einem inversen konfokalen Mikroskop oder einem konfokalen High-Content-System aufgenommen und mit der entsprechenden Software analysiert. Für die Paraffineinbettung werden 3D-Strukturen direkt verarbeitet (Option b.1 für große Strukturen ≥ 400 μm) oder in ein Gel (b.2; kleine Strukturen ≤ 400 μm) zur Dehydratisierung und Paraffineinbettung aufgenommen. Anschließend werden Paraffinblöcke geschnitten und gefärbt (histologische oder immunchemische Färbung). Bilder von 2D-Schnitten werden auf einem digitalen Objektträgerscanner oder einem aufrechten Mikroskop erhalten und auf einer Bildanalyseplattform mittels schneller digitaler quantitativer Analyse analysiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy pad Q Path blue</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes macrostar III Blc couv. Char. x1500</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassette microtwin white</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical hood</td>
			<td>Erlab</td>
			<td>FI82 5585-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips 1000 &#181;L</td>
			<td>Star lab Tip-One</td>
			<td>S1122-1730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Pyramid innovation</td>
			<td>R35002-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottom glass tubes with PTFE lined 2 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11784259</td>
			<td>Excellent&#160; for environmental&#160;&#160;&#160; samples,&#160;&#160;&#160; pharmaceuticals and diagnostic reagents. PTFE is designed for the ultimate in product safety. PTFE provides totally inert inner seal and surface facing the sample or product.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish plate 35 mm</td>
			<td>Ibedi</td>
			<td>2018003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal agitation</td>
			<td>N-BIOTEK</td>
			<td>NB-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator prewarmed to 65 &#176;C</td>
			<td>Memmert Incubator</td>
			<td>LAB129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inox molds 15x15</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-1918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides Matsunami TOMO-11/90</td>
			<td>Roche diagnostics</td>
			<td>8082286001</td>
			<td>these slides are used for a better adhesion of sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>HM340E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panoramic scan II</td>
			<td>3dhistech</td>
			<td>2397612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin embedding equipment</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette Pasteur 2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Path flacon 150mL cape blanc x250</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-1308</td>
			<td>Good for environmental&#160;&#160;&#160; samples,&#160;&#160;&#160; pharmaceuticals and diagnostic reagents. Polypropylene (PP) are rigid,&#160; solid, provide excellent&#160; stress&#160; crack&#160; and&#160; impact&#160; resistance and have a&#160; good oil and alcohol barrier and chemical resistance. PE-lined cap is stress crack resistant and offers&#160; excellent&#160; sealing&#160; characteristics.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Set of micropipettors&#160; (p200, p1000)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11877351 (20-200) 11887351(p1000)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPERA PHENIX</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>HH14000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP5 inverted confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LSM780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue cassette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-0228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiomager microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SIP 60549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoblock (kit)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10066588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57648266</td>
			<td>CAUTION: toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin aqueous 1%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT110316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83804.360</td>
			<td>CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.365</td>
			<td>CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin 4%</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>F/40877-36</td>
			<td>CAUTION: Formalin contains formaldehyde which is hazardous. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fructose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gill hematoxylin type II</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>F/CP813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td>CAUTION: Suspected of causing genetic defects.&#160; Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Wax tek III</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS) 1 X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Buffered Saline (TBS) 10X</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>F/00801</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8532</td>
			<td>CAUTION: Triton X&#173;100 is hazardous. Avoid contact with skin and eyes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>534056</td>
			<td>CAUTION: Xylene is toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Clearing solution</td>
			<td>Glycerol-Fructose clearing solution is 60% (vol/w) glycerol and 2.5 M fructose. To prepare 10 mL of this solution, mix 6 mL of glycerol and 4.5 g of fructose. Complete to 10 mL with dH2O. Use a magnetic stirrer overnight. Refractive index = 1.4688 at room temperature (RT: 19&#8211;23 &#176;C). Store at 4 &#176;C in dark for up to 1 month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">PBS-BSA 0,1% solution</td>
			<td>To prepare 0,1% (vol/wt) PBS-BSA 0,1% solution, dissolve 500 mg of BSA in 50 mL of PBS-1X (store at 4&#176;C for up to 2 weeks). And dilute 1mL of this solution into 9mL of PBS-1X. This solution can be used to precoat the tip and centrifugation tube.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Permeabilisation-blocking solution (PB solution)</td>
			<td>The PBSDT blocking solution is PBS-1X supplemented with 0.1% &#8211; 1% Tritonx-100 (depending on the protein localization membrane/nucleus), 1% DMSO, 1% BSA and 1% donkey serum (or from the animal in which the secondary antibodies were raised). This solution can be stored at 4&#176;C for up to 1 month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">PB:PBS-1X &#160;(1:10) solution</td>
			<td>PB:PBS-1X &#160;(1:10) solution is a 10 time diluted PB solution. To prepare 10 mL of this solution dilute 1 mL of PB solution in 9 mL of PBS-1X.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halo software</td>
			<td>Indicalabs</td>
			<td>NM 87114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harmony software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>HH17000010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

staining and high-resolution imaging of three-dimensional organoid and spheroid models

Dreidimensionale (3D) In-vitro-Zellkulturmodelle wie Organoide und Sphäroide sind wertvolle Werkzeuge für viele Anwendungen, darunter Entwicklung und Krankheitsmodellierung, Wirkstoffforschung und regenerative Medizin. Um diese Modelle voll auszuschöpfen, ist es entscheidend, sie auf zellulärer und subzellulärer Ebene zu untersuchen. Die Charakterisierung solcher In-vitro-3D-Zellkulturmodelle kann jedoch technisch anspruchsvoll sein und erfordert spezifisches Fachwissen, um effektive Analysen durchzuführen. In diesem Artikel werden detaillierte, robuste und komplementäre Protokolle zur Durchführung von Färbungs- und subzellulärer Bildgebung von fixierten In-vitro-3D-Zellkulturmodellen im Bereich von 100 μm bis zu mehreren Millimetern vorgestellt. Diese Protokolle sind auf eine Vielzahl von Organoiden und Sphäroiden anwendbar, die sich in ihren Ursprungszellen, ihrer Morphologie und ihren Kulturbedingungen unterscheiden. Von der 3D-Strukturgewinnung bis zur Bildanalyse können diese Protokolle innerhalb von 4-5 Tagen abgeschlossen werden. Kurz gesagt, 3D-Strukturen werden gesammelt, fixiert und können dann entweder durch Paraffineinbettung und histologische/immunhistochemische Färbung oder direkt immunmarkiert und für die optische Klärung und 3D-Rekonstruktion (200 μm Tiefe) durch konfokale Mikroskopie vorbereitet werden.

Dieses Protokoll bietet einen Überblick über die kritischen Schritte für die 2D- und 3D-Whole-Mount-Färbung sowie die Bildgebung und quantitative Analyse von 3D-Zellkulturmodellen (Abbildung 3 und Abbildung 4). Es ist auf eine breite Palette von 3D-Zellkulturmodellen anwendbar - von Sphäroiden bis hin zu Organoiden aus verschiedenen Wirtsspezies oder Geweben - und ermöglicht die Erfassung genauer und quantitativer Informationen über Architektur, Zellorganisation und Interaktionen auf zellulärer und subzellulärer Ebene (Abbildung 3 und Abbildung 4). Laboratorien müssen möglicherweise histologische und immunhistochemische 2D-Techniken und Antikörperkonzentrationen entsprechend ihren eigenen Bedürfnissen optimieren.
Beide Methoden liefern wertvolle biologische Informationen. 3D-Whole-Mount-Färbung und konfokale Mikroskopie liefern visuelle Informationen über die zelluläre Zusammensetzung und räumliche Position mit einem Tiefenfeld von bis zu 200 μm (Abbildung 3B). Die 2D-Schnitte sind jedoch für größere 3D-Strukturen geeignet, um detaillierte zelluläre morphologische Merkmale im gesamten Schnitt von 3D-Strukturen zu enthüllen, die aufgrund der Lichtstreuung, die die Auflösung in größeren Proben beeinträchtigt, in situ schwierig zu beobachten sind. Darüber hinaus können beide Techniken quantitative Daten liefern. In der Tat ermöglicht die erhaltene Auflösung die Anwendung von zellulären und subzellulären Segmentierungsalgorithmen zur Quantifizierung der Anzahl der Zellen und zum Nachweis des Vorhandenseins verschiedener Zellmarker in verschiedenen zellulären Subtypen (Abbildung 3F und Abbildung 4). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hier beschriebenen bildgebenden Verfahren reproduzierbar, einfach und komplementär sind und wertvolle Werkzeuge zur Untersuchung der zellulären Heterogenität darstellen.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig03.jpg"> Abbildung 3: Repräsentative Ergebnisse für die 3D-Ganzmontage, Bildgebung und Analyse von optischen 3D- und 2D-Schnitten . (A) Konfokale Bilder von humanen (h) hochgradigen Gliom-Sphäroiden, die eine Woche lang kultiviert und mit Hoechst (blau), Olig2 (gelb) und Aktin (rot) (20x Wasserobjektiv) markiert wurden. Für alle aufgenommenen Bilder wurden die Mikroskopeinstellungen mit einer Positivkontrolle (oben) festgelegt, und dann wurde die Negativkontrolle mit identischen Einstellungen abgebildet, um das Fehlen von Fluoreszenz in Abwesenheit von primären Antikörpern zu kontrollieren (unten). (B) Orthogonale 3D-Whole-Mount-Darstellung der Ki67-Färbung, durchgeführt in (h) hochgradigem Gliom-Sphäroid, das eine Woche lang kultiviert wurde (Glycerin-Fructose-Clearing; 20x Wasserobjektiv, konfokal). (C) Konfokale Bilder von (h) hochgradigem Gliom-Sphäroid, das eine Woche lang kultiviert und mit Hoechst (blau), Olig2 (gelb) und Phalloidin-488 (grün) markiert wurde (Glycerin-Fructose-Clearing; 20x Wasserziel). (D) Konfokale Bilder von menschlichen (h) Rhabdomyosarkomen (oben) und Maus (m) Neuralleistenzellen (unten), die eine Woche lang kultiviert und mit Hoechst (blau), Aktin (rot) bzw. Ki67 (grün) markiert wurden (Glycerin-Fructose-Clearing; 20x trockenes Objektiv). (E) Konfokale Bilder von (h) hochgradigen Gliom-Sphäroiden, die eine Woche lang kultiviert und mit Hoechst (blau) und Ki67 (grün) markiert wurden (Glycerin-Fructose-Clearing; 40x Wasserobjektiv) (oben links). Segmentierte Bilder auf dem Hoechst-Kanal und Ki67-positiven (+) Kernregionen auf dem grünen Kanal wurden mit einer High-Content-Analyse-Software erzeugt (siehe ergänzende Abbildung 1 und Materialtabelle) (unten). Die Ausgabe ist der Prozentsatz der Ki67+ -Kerne pro segmentierter 3D-Struktur (oben rechts). Maßstabsbalken = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig04.jpg"> Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse für die Bildgebung und Analyse optischer 2D-Schnitte. (A, D) 2D-Schnittbilder eines 3D-Zellmodells (humane Rhabdomyosarkom-Sphäroide, die einen Monat lang kultiviert wurden), die mit einem digitalen Objektträgerscanner aufgenommen und auf einer Plattform für eine schnelle digitale quantitative Analyse analysiert wurden. (A) H&E-Färbung und Nachweis von Zellen entsprechend ihrer Größe. Maßstabsbalken = 500 μm. (B) Das Histogramm zeigt den Prozentsatz der Zellen < 100 μm 2 und > 100 μm2, die mit einer Software für schnelle digitale quantitative Analyse (links: Halo) oder manueller Zählung (rechts: MC) detektiert wurden. (C) Ki67-Färbung und Detektion von Zellen entsprechend der Intensität ihres 3,3'-Diaminobenzidin-Signals (DAB). Negativ (blau), schwach positiv (gelb), positiv (rot). Maßstabsbalken = 500 μm. (D) Das Histogramm zeigt den Prozentsatz der Ki67-negativen, schwach positiven und positiven Zellen. Abkürzungen: H&E = Hämatoxylin und Eosin; MC = manuelle Zählung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Ergänzende Abbildung 1: Übersicht über die Schritte in der Bildanalyse-Software. Analysen basieren auf der Assoziation von Bausteinen. Jeder Baustein entspricht einer Funktion - Segmentierung, Berechnung, Assoziation, Ausgabedefinition - und bietet mehrere Algorithmen und Variablenauswahlen, um der biologischen Probe zu entsprechen, die abgebildet wird. Die Software bietet mehrere RMS-Analyseprotokolle (Ready Made Solution), die einfach verwendet und geändert werden können. Integrierte Bildanalyseprotokolle können gespeichert, auf verschiedene Datensätze angewendet und von Benutzern gemeinsam genutzt werden. Kurz gesagt, das Analyseprotokoll impliziert eine sequentielle Objektsegmentierung: Sphäroide, Kerne und schließlich Ki67-Taschen (A488). Dann wird die mittlere Intensität der Ki67-Taschen berechnet, um die positiven Ereignisse weiter zu unterscheiden. Schließlich werden Kerne, die Ki67-positive Taschen umfassen, positiv ausgewählt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/Suppl1_Harmony%20analysis_Revised.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung 2: Überblick über die Verfahrensschritte der quantitativen Analysesoftware. Schritt 1. Laden Sie die Dateien über die Registerkarte Studien hoch. Die Dateien werden im Abschnitt "Bildaktionen " geöffnet. Schritt 2. Öffnen Sie die Registerkarte Anmerkungen und klicken Sie dann auf Ebenenaktionen , um mit dem Kreiswerkzeug der Symbolleiste eine neue Ebene rund um die Struktur zu entwerfen. Für nicht kreisförmige Strukturen kann stattdessen das Stiftwerkzeug verwendet werden. Schritt 3. Die Symbolleiste kann verwendet werden, um Anmerkungen zu entwerfen und die Quantifizierung mit dem <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62280/62280eq01.jpg">Tool zu visualisieren. Schritt 4. Öffnen Sie die Registerkarte Analyse und wählen Sie die besten Bedingungen für die Analyse der Probe aus (hier können mehrere Versuche erforderlich sein). Schritt 4.1. Verwenden Sie den Abschnitt "Fleckenauswahl ", um die Färbebedingung festzulegen. Bei mehreren Flecken können diese hinzugefügt und umbenannt werden, und die virtuelle Farbe kann geändert werden. Die Lokalisationsdetektion kann spezifiziert werden - Kern- oder Zytoplasma-Färbung. Schritt 4.2. Verwenden Sie den Abschnitt Zellerkennung, um die Zellerkennung einzurichten. Dieser Abschnitt ist der wichtigste für die Analyse. Der Abschnitt "Kernkontrastschwelle " ermöglicht die Detektion aller Kerne. Es muss darauf geachtet werden, dass es mehrere Populationsgrößen gibt, die Software kann mehrere Zellen anstelle einer einzigen großen erkennen. Die Abschnitte " Kerngröße " und "Aggressivität der Kernsegmentierung " können verwendet werden, um Zellgrößenpopulationsbereiche zu quantifizieren. Schritt 5. Beschreibung zum Ausführen der Stichprobenanalyse. Befolgen Sie die in der Abbildung gezeigten Schritte. Im Abschnitt "Anmerkungsebene " wird die Einstellung nur auf dieser Folie ausgeführt. Die Quantifizierung kann mit dem <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62280/62280eq01.jpg">Tool visualisiert werden. Wiederholen Sie die Schritte 4.1-5, bis eine geeignete Quantifizierung erreicht ist. Schritte 6-6.1. Diese Schritte ermöglichen es Ihnen, eine Figur mit der Software zu zeichnen. Schritt 7. Quantifizierungsgrafiken, die über Software erstellt wurden, können gespeichert werden. Schritt 8. Daten können exportiert werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/Suppl2_Halo%20Images_revised.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

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Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

Hier stellen wir detaillierte, robuste und komplementäre Protokolle zur Verfügung, um Färbung und subzelluläre Bildgebung von fixierten dreidimensionalen Zellkulturmodellen im Bereich von 100 μm bis zu mehreren Millimetern durchzuführen und so die Visualisierung ihrer Morphologie, Zelltypzusammensetzung und Wechselwirkungen zu ermöglichen.

Färbung und hochauflösende Bildgebung von dreidimensionalen Organoid- und Sphäroidmodellen

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...

Die Charakterisierung von 3D-In-vitro-Modellen mit zellulärer und subzellulärer Auflösung ist entscheidend für die vollständige Nutzung, kann aber eine Herausforderung darstellen. Daher haben wir ein komplementäres Protokoll für die Färbung und subzelluläre Bildgebung von fixierten 3D-In-vitro-Modellen im Bereich von 100 Mikrometern bis zu mehreren Millimetern bereitgestellt. 3D-Strukturen sind radial und sollten sorgfältig manipuliert werden.Überprüfen Sie vor dem Pipettieren die Position Ihrer 3D-Strukturen in der Röhre, um eine Aspiration zu vermeiden. Da wir klassische Techniken für die Einbettung kleiner Strukturen wie Organoide oder Sphäroide adaptiert haben, können visualisierte Anweisungen Erstanwendern helfen, die Aufgabe einfacher zu erledigen. Laura Francols, eine Labortechnikerin der Pathology Research Platform, wird das Verfahren mit mir demonstrieren.Um Proben für die 3D-Färbung der gesamten Halterung vorzubereiten, verwenden Sie eine mit BSA vorcodierte Pipettenspitze von einem Milliliter, um eine 3D-Struktursuspension von einem Milliliter zu einem 500-Mikroliter-Röhrchen PBS hinzuzufügen. Wenn sich die 3D-Strukturen am Boden des Röhrchens abgesetzt haben, ersetzen Sie das PBS vorsichtig durch 500 Mikroliter Permeabilisierungsblocklösung für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur mit sanftem horizontalem Rühren bei 30 bis 50 Umdrehungen pro Minute. Lassen Sie die 3D-Strukturen am Ende der Inkubation erneut sedimentieren, bevor Sie die 3D-Strukturen zwei Mal in einem Milliliter von 0,1% PBS, ergänzt mit BSA, für drei Minuten pro Waschgang sorgfältig waschen.Nach der letzten Wäsche beschriften Sie die 3D-Strukturen mit 250 Mikroliter Primärantikörper in PBS für zwei bis drei Tage unter sanftem horizontalem Rühren bei vier Grad Celsius. Am Ende der Inkubation wird die Probe mit fünf dreiminütigen und zwei 15-minütigen Wäschen in einem Milliliter von 0,1% PBS BSA pro Waschgang gewaschen. Nach der letzten Wäsche beschriften Sie die 3D-Strukturen mit 250 Mikrolitern des entsprechenden sekundären Antikörpers in PBS für 24 Stunden bei vier Grad Celsius mit sanftem horizontalem Rühren vor Licht geschützt.Am nächsten Tag beschriften Sie die 3D-Strukturen mit 250 Mikrolitern der entsprechenden Konzentration von Hoechst 3342 für eine zweistündige Inkubation bei vier Grad Celsius mit sanftem horizontalem Rühren. Am Ende der Inkubation waschen Sie die 3D-Strukturen fünfmal für drei Minuten und zweimal für 15 Minuten in einem Milliliter PBS pro Waschgang, wie gezeigt. Nach der letzten Wäsche übertragen Sie die 3D-Strukturen auf eine 96-Well-Mikrotiterplatte aus schwarzem Polystyrol und geben Sie vorsichtig 200 Mikroliter Reinigungslösung auf die Strukturen, um Blasen zu vermeiden.Dann legen Sie die mit Alufolie bedeckte Platte bei vier Grad Celsius für mindestens 48 Stunden. Um große 3D-Zellkulturmodelle einzubetten, verwenden Sie eine BSA-beschichtete Pipettenspitze, um die 3D-Strukturen vorsichtig auf ein flaches Glasrohr mit einem mit PTFE ausgekleideten Flaschenverschluss zu übertragen. Nachdem sich die Strukturen abgesetzt haben, ersetzen Sie das PBS vorsichtig durch 70% Ethanol für eine 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur.Ersetzen Sie am Ende der Inkubation das 70%ige Ethanol durch einen Milliliter gebrauchsfertige Eosin-Y-Lösung. Streifen Sie die Tube und färben Sie die Strukturen für mindestens 30 Minuten. Am Ende der Inkubation dehydrieren Sie die Strukturen mit drei aufeinanderfolgenden 30-minütigen Wäschen in einem Milliliter 100% Ethanol pro Waschgang.Nach der letzten Austrocknung entfernen Sie die 3D-Strukturen mit drei aufeinanderfolgenden 30-minütigen Wäschen in einem Milliliter Xylol pro Waschgang unter einer chemischen Haube. Legen Sie nach dem letzten Eintauchen in Xylol ein Stück Xylol-getränktes Biopsie-Pad in ein Fach einer weißen Mikrotwin-Gewebekassette und verwenden Sie eine BSA-beschichtete Pasteur-Pipette aus Kunststoff mit zwei Millilitern, um die 3D-Strukturen auf das Pad zu übertragen. Decken Sie die 3D-Strukturen mit einem weiteren mit Xylol getränkten Biopsiekissen ab, um die 3D-Strukturen an Ort und Stelle zu halten, und schließen Sie die Kassette.Wenn alle Proben übertragen wurden, legen Sie die Kassetten für 30 Minuten in ein 65 Grad Celsius Paraffinbad, bevor Sie die Kassetten über Nacht in ein frisches 65 Grad Celsius Paraffinbad legen. Am nächsten Morgen fügen Sie flüssiges Paraffin zu einer 65 Grad Celsius erwärmten Einbettungsform pro Probe hinzu und geben Sie eine in Paraffin eingebettete Probe in jede Form. Rühren Sie die Formen vorsichtig um, bis alle 3D-Strukturen auf den Boden fallen, und verwenden Sie eine 65 Grad Celsius warme feine Pinzette, um die 3D-Strukturen in der Mitte jeder Form zu positionieren.Kühlen Sie die Form, bis das Paraffin eine dünne feste Schicht bildet, die die 3D-Struktur an Ort und Stelle sichert. Legen Sie eine Taschentuchkassette und geben Sie heißes Paraffin über die Form. Entfernen Sie die Form, wenn das Paraffin vollständig erstarrt ist.Um kleine 3D-Zellkulturmodelle einzubetten, waschen Sie die 3D-Strukturen vorsichtig dreimal in einem Milliliter TBS pro Waschgang. Entfernen Sie nach dem letzten Waschen so viel TBS wie möglich, ohne die Strukturen zu berühren, und fügen Sie zwei Tropfen Reagenz zwei aus einem handelsüblichen Paraffin-Einbettungskit hinzu. Mischen Sie vorsichtig durch Klopfen und fügen Sie zwei Tropfen Reagenz hinzu, einen mit Klopfen, bis das Gel fest wird.Verwenden Sie eine feine Pinzette, um das Gel aus der Vertiefung der vormontierten Kassette aus dem Kit zu übertragen, und dehydrieren Sie die in das Gel eingebettete Probe mit 30-minütigen aufsteigenden Ethanol- und Xylol-Inkubationen in einem Abzug wie angegeben. Nach dem letzten Eintauchen in Xylol wird die Kassette über Nacht in ein 65 Grad Celsius Paraffinbad gegeben, bevor die in Paraffin eingebettete Probe mit einer feinen Pinzette in die Mitte einer mit flüssigem Paraffin beladenen 65 Grad Celsius erwärmten Einbettungsform überführt wird. Anschließend sichern Sie die 3D-Struktur mit einer weiteren Schicht Paraffin, wie es für die großen 3D-Zellkulturmodelle gezeigt wird.Dreidimensionale Whole-Mount-Färbung und konfokale Mikroskopie liefern visuelle Informationen über die zelluläre Zusammensetzung und räumliche Position der 3D-Kulturmodelle bis zu einem Tiefenfeld von bis zu 200 Mikrometern. Die hohe Auflösung, die mit diesem Protokoll für 3D-Strukturen erhalten werden kann, ermöglicht die Anwendung von zellulären und subzellulären Segmentierungsalgorithmen zur Quantifizierung der Zellzahl und zur Detektion verschiedener Zellmarker innerhalb verschiedener Zellsubtypen. Die 3D-Analyse ganzer Halterungen kann auf visualisierte Zellen mit einer Tiefe von bis zu 200 Mikrometern angewendet werden, unabhängig von den gesamten Strukturen.Im Gegenteil, die 2D-Schnittanalyse kann Einblicke in Zellen jeder Größe liefern.

Research

JoVE Journal

Biology

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Forschung

Biologie

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