Name: staining and high-resolution imaging of three-dimensional organoid and spheroid models
Uploaded: 2021-03-27T14:00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי פרס רוברט ג'יי ארצ'י לחדשנות #604303 של סנט בולדריק.

<ol>
	<li>Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+system+methods+and+applications+for+mesenchymal+stem+cells.">Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells.</a> Cells. 8 (12), 1-13 (2019).</li><li>Bartfeld, S., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+organoids+and+their+application+for+medical+research+and+patient+treatment.">Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment.</a> Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).</li><li>Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+multicellular+spheroids+formation.">Advances in multicellular spheroids formation.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 14 (127), (2017).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation.">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1724-1743 (2016).</li><li>Rezanejad, H., Lock, J. H., Sullivan, B. A., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+pancreatic+ductal+organoids+and+whole-mount+immunostaining+of+intact+organoids.">Generation of pancreatic ductal organoids and whole-mount immunostaining of intact organoids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 82 (2019).</li><li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+systems+and+their+applications+in+drug+discovery+and+cell-based+biosensors.">Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).</li><li>McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+and+assessment+of+human+primary+prostate+organoid+culture.">Handling and assessment of human primary prostate organoid culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e59051 (2019).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li><li>Lazzari, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+fluorescence+microscopy+versus+confocal+microscopy:+in+quest+of+a+suitable+tool+to+assess+drug+and+nanomedicine+penetration+into+multicellular+tumor+spheroids.">Light sheet fluorescence microscopy versus confocal microscopy: in quest of a suitable tool to assess drug and nanomedicine penetration into multicellular tumor spheroids.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 142, 195-203 (2019).</li><li>Gabriel, J., Brennan, D., Elisseeff, J. H., Beachley, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+embedding/sectioning+for+parallel+analysis+of+3D+cell+spheroids.">Microarray embedding/sectioning for parallel analysis of 3D cell spheroids.</a> Scientific Reports. 9, 16287 (2019).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

תרבית תאים היא כלי חיוני לחשיפת מנגנונים ביולוגיים בסיסיים המעורבים בהתפתחות רקמות ואיברים, תפקוד, התחדשות ושיבוש ומחלות. למרות שתרבית תאים דו-ממדית חד-שכבתית שלטה, המחקר האחרון עבר לתרביות המייצרות מבנים תלת-ממדיים המשקפים יותר תגובות תאיות in vivo, בעיקר בשל ארגון מרחבי נוסף ומגעים בין תאים המשפיעים על ביטוי גנים והתנהגות תאית ולכן יכולים לספק נתונים מנבאים יותר7. עם זאת, נותרו אתגרים רבים, כולל הצורך בטכניקות צביעה והדמיה ידידותיות למשתמש לצורך הדמיה מיקרוסקופית מפורטת והערכה של מבנים תלת-ממדיים מורכבים ברמה התאית והתת-תאית. בהקשר זה, ניתנו פרוטוקולים מפורטים, חזקים ומשלימים לביצוע צביעה והדמיה ברזולוציה תאית ותת-תאית של מודלים קבועים של תרביות תאים תלת-ממדיות במבחנה שגודלם נע בין 100 מיקרומטר למספר מילימטרים.
הליך זה מציג שתי אסטרטגיות שונות להתמודדות עם מגוון רחב של גדלים וסוגים של מודלים תלת-ממדיים של תרביות תאים במבחנה. הבחירה של אחד (3D All-mount analysis) או השני (2D sectioning analysis) יהיה תלוי במודל שבו נעשה שימוש והנושא נחקר. ניתוח תלת-ממדי של כל ההרכבה על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי מאפשר הדמיה של תאים עם שדה עומק של עד 200 מיקרומטר, ללא קשר לגודל הכולל של המבנה התלת-ממדי, בעוד שחתך דו-ממדי חל על דגימות בכל גודל, אך ויזואליזציה נשארת דו-ממדית. להלן כמה הצעות לפתרון בעיות ולשיקולים טכניים.
אובדן מבנים תלת-ממדיים במהלך זרימת העבודה הוא החיסרון הנפוץ ביותר. הם יכולים להישאר דבקים בקצוות וצינורות, ולכן טיפים וצינורות ציפוי מראש עם פתרון PBS-BSA 0.1% הוא המפתח. יתר על כן, חיוני לתת למבנים התלת-ממדיים לשקוע בין שינויים מגיבים ולבצע את כל הפיפטינג בזהירות רבה. כפי שהוזכר בהליך, עבור כל השלבים, אם שקיעת מבנה תלת מימד ארוכה מדי, ניתן לסובב תאים בעדינות ב 50 × גרם במשך 5 דקות ב- RT. בהתאם למטרת המחקר, יש לשקול את היתרונות / חסרונות של צעד מסתובב כזה מכיוון שצנטריפוגה יכולה לסכן את צורת המבנים התלת-ממדיים. יתר על כן, יש להקפיד לשמר מורפולוגיה זו במהלך שלב הקיבוע מכיוון שאורגנואידים ציסטיים נוטים לקרוס. תיקון מבנים שגודלם מתחת ל-400 מיקרומטר אמור למנוע שינויים מבניים.
עבור תיוג חיסוני אופטימלי, התאוששות של אורגנואידים מהמטריצות התלת-ממדיות שלהם היא צעד מכריע. המטריצה התלת-ממדית יכולה לעכב חדירת נוגדנים נאותה או להוביל לצביעת רקע גבוהה בגלל קשירה לא ספציפית למטריצה. הסרת ECM עשויה לשנות את המורפולוגיה של המקטעים החיצוניים של אורגנואידים (במיוחד במקרה של בליטות תאיות קטנות המשתרעות ממבנים תלת-ממדיים נחקרים) ולעכב חלקית ניתוחים. עבור מבנים תלת ממדיים כאלה, המטריצה יכולה להישמר לאורך כל ההליך; עם זאת, יש להתאים בקפידה את תנאי התרבית לגידול תאים בכמות מינימלית של מטריצה כדי למנוע חדירה לא מספקת של תמיסות ונוגדנים ולהימנע מצעדי שטיפה רצופים שמטרתם להפחית רעשי רקע מוגזמים 6,8.
שלב הניקוי האופטי המתואר בפרוטוקול זה בסעיף צביעת ההרכבה התלת-ממדית הרלוונטית להדמיה של מבנים תלת-ממדיים בעומק של עד 150-200 מיקרומטר במקום 50-80 מיקרומטר ללא ניקוי. בהשוואה למתודולוגיות סליקה אחרות הדורשות לעתים קרובות מספר שבועות ושימוש בחומרי סליקה רעילים, בפרוטוקול 4,9 זה נעשה שימוש בשלב סליקה מהיר ובטוח שפורסם בעבר. בנוסף, שלב ניקוי זה הפיך, וניתן להוסיף נוגדנים חדשים לצביעה הראשונית ללא אובדן רזולוציה או בהירות4. עם זאת, בהתאם למודל תרבית התאים התלת-ממדי שנחקר, עומק של 150-200 מיקרומטר עשוי שלא להספיק כדי לדמות את המבנה התלת-ממדי בצורה אינפורמטיבית, ופרוטוקול ניקוי זה יכול לגרום לשינויים במורפולוגיה הכללית של אורגנואידים חד-שכבתיים כדוריים עם לומןגדול 4. על המשתמשים לתכנן בקפידה את הניסוי שלהם, ובמידת הצורך, לייעל את העיתוי של שלב החדירה/חסימה (כדי לאפשר חדירה של נוגדנים ותמיסה), שלב הניקוי (כדי לחדור עמוק יותר מ-200 מיקרומטר, הדגימות צריכות להיות מנוקות לחלוטין) ורכישת תמונה. שתי הטכנולוגיות הנפוצות ביותר הזמינות במתקני הליבה יהיו יריעות אור ומיקרוסקופ קונפוקלי. המשתמשים יצטרכו לבחור בקפידה טכנולוגיה המבוססת על גודל המבנים התלת-ממדיים שלהם והשאלה הביולוגית שלהם10. עם זאת, בהשוואה למיקרוסקופ קונפוקלי, רזולוציית מיקרוסקופ יריעות האור המתקבלת עבור מבנים עמוקים כאלה נותרה תת-אופטימלית לקבלת רזולוציה תת-תאית.
כאן דווח על תהליך מפורט וחזק המוקדש להטמעת פרפין של דגימות בודדות. מעניין לציין כי גבריאל ועמיתיו פיתחו לאחרונה פרוטוקול להטמעת תרביות תאים תלת-ממדיות בפרפין עם תפוקה מוגברת. הם השתמשו בתבנית פולידימתילסילוקסאן (PDMS) כדי לכלוא 96 מבנים תלת-ממדיים בתבנית מיקרו-מערך בבלוק אחד, וסיפקו פרספקטיבות חדשות למחקרים על מודלים תלת-ממדיים של גידולים שהקיפו יותר קבוצות, נקודות זמן, תנאי טיפול ושכפול11. עם זאת, שיטה זו דורשת מיומנויות ומכונות נרחבות, בעיקר לייצור התבנית המוקדמת המשמשת ליצירת תבניות PDMS.
לסיכום, מאמר זה מתאר שתי גישות שונות, משלימות וניתנות להתאמה המאפשרות קבלת מידע מדויק וכמותי על ההרכב האדריכלי והתאי של מודלים סלולריים תלת-ממדיים. שני הפרמטרים חיוניים לחקר תהליכים ביולוגיים כגון הטרוגניות תאית תוך-גידולית ותפקידה בעמידות לטיפולים.

במהלך העשורים האחרונים, ההתקדמות בביולוגיה של תאי גזע ובטכנולוגיות תרביות תלת-ממד במבחנה בישרו על מהפכה בביולוגיה וברפואה. מודלים של תאים בעלי מורכבות גבוהה יותר בתלת-ממד הפכו פופולריים מאוד מכיוון שהם מאפשרים לתאים לגדול ולקיים אינטראקציה עם מסגרת חוץ-תאית הסובבת אותם, תוך שחזור הדוק של היבטים של רקמות חיות, כולל הארכיטקטורה שלהם, ארגון התא והאינטראקציות שלהם, או אפילו מאפייני הדיפוזיה. ככאלה, מודלים תלת-ממדיים של תרביות תאים יכולים לספק תובנות ייחודיות על התנהגות תאים ברקמות מתפתחות או חולות במבחנה. אורגנואידים וספרואידים הם שניהם מבנים תלת-ממדיים רב-תאיים, הנעים בין מספר מיקרומטרים למילימטרים, והם הבולטים ביותר במבנים תלת-ממדיים במבחנה. שניהם יכולים להיות מתורבתים בתוך פיגום תומך, כולל (i) הידרוג'ל שמקורו בבעלי חיים (תמצית קרום מרתף, קולגן), צמחים (alginate/agarose), או מסונתז מכימיקלים, או (ii) מטריצות אינרטיות המכילות נקבוביות כדי לקדם שגשוג תאים וצמיחה.
אורגנואידים וספרואידים יכולים גם להתפתח ללא נוכחות של פיגום תומך על ידי הסתמכות על תאים להרכבה עצמית לאשכולות. זה מסתמך על טכניקות שונות כגון שימוש בחומרים לא דביקים כדי לעכב התקשרות תאים, מתח פני השטח וכוח הכבידה (למשל, טכניקות נפילה תלויה), או סיבוב מעגלי קבוע של כלי דם (למשל, תרבית ספינר). בכל המקרים, טכניקות אלה מקלות על אינטראקציות תא-תא ומטריצת תאים כדי להתגבר על המגבלות של תרבית תאים חד-שכבתית מסורתית1. המונחים "אורגנואידים" ו"ספרואידים" שימשו לסירוגין בעבר, אך ישנם הבדלים מרכזיים בין שני מודלים אלה של תרביות תאים תלת-ממדיות. אורגנואידים הם צבירי תאים תלת-ממדיים במבחנה שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים או תאי גזע ספציפיים לרקמות, שבהם תאים מתארגנים באופן ספונטני לאבות ולסוגי תאים ממוינים ואשר משחזרים לפחות חלק מהפונקציות של האיבר המעניין2. ספרואידים מהווים טווח רחב יותר של מבנים תלת-ממדיים רב-תאיים הנוצרים בתנאים לא נצמדים ויכולים לנבוע ממגוון גדול של סוגי תאים כגון קווי תאים אימורטליים או תאים ראשוניים3. לפיכך, הטבועים במקורם הפנימי של תאי גזע, לאורגנואידים יש נטייה גבוהה יותר להרכבה עצמית, כדאיות ויציבות מאשר ספרואידים.
עם זאת, למעשה, שני מודלים אלה הם מבנים תלת-ממדיים המורכבים מתאים מרובים, ולכן הטכניקות שפותחו כדי לחקור אותם דומות מאוד. לדוגמה, גישות הדמיה חזקות ברמת הרזולוציה של תא בודד נחוצות כדי לחקור את המורכבות התאית הן של אורגנואידים והן של ספרואידים. כאן, על ידי סיכום המומחיות של קבוצה זו ושל מובילים בתחום האורגנואידים4, מאמר זה מתאר הליכים מפורטים לביצוע צביעה דו-ממדית (דו-ממדית) ותלת-ממדית של הרכבה מלאה, הדמיה וניתוח של ההרכב התאי והתת-תאי והארגון המרחבי של אורגנואידים וכדורואידים בטווח שבין 100 מיקרומטר למספר מילימטרים. ואכן, הליך זה מציג שני סוגים שונים ומשלימים של צביעה ורכישת הדמיה כדי לנתח מגוון רחב של גדלים וסוגים של מודלים תלת ממדיים של תרביות תאים במבחנה. השימוש באחד (3D whole-mount analysis) או השני (2D section analysis) יהיה תלוי במודל שנלמד ובתשובות המבוקשות. ניתוח תלת-ממדי של כל הרכבה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי יכול, למשל, להיות מיושם כדי להמחיש תאים בתרבית תלת-ממדית בעומק של עד 200 מיקרומטר, ללא קשר לגודל הכולל של המבנה התלת-ממדי, ואילו ניתוח של חתכים דו-ממדיים מספק תובנות לגבי דגימות בכל גודל, אם כי ברמה הדו-ממדית. הליך זה יושם בהצלחה במגוון אורגנואידים4,5 וספרואידים שמקורם בתאי אדם ומורין, שמקורם בשכבות נבט עובריות שונות. הסקירה הכללית של ההליך מוצגת באיור 1. מצוינים השלבים העיקריים, היחסים ביניהם, הצעדים המכריעים והעיתוי הצפוי.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig01.jpg"> איור 1: סקירה סכמטית של ההליך. מודלים של תרביות תאים תלת-ממדיות במבחנה נאספים וקבועים, ולאחר מכן מוכנים לצביעה תלת-ממדית של הר שלם (אפשרות א) או מוטמעים בפרפין עבור חתך וצביעה דו-ממדיים (אפשרות ב). עבור ניסויי צביעה תלת-ממדיים בהרכבה שלמה, מבנים תלת-ממדיים קבועים מסומנים כבעלי תווית חיסונית לאחר שלב הקיבוע. ניתן לבצע שלב ניקוי אופטי אופציונלי לשיפור איכות ההדמיה והעומק של מיקרוסקופ אופטי על ידי הפחתת פיזור האור במהלך עיבוד תמונה. התמונות נלכדות במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך או במערכת תוכן קונפוקלית גבוהה ומנותחות באמצעות התוכנה המתאימה. עבור הטבעה פרפין, מבנים תלת ממדיים מעובדים ישירות (אפשרות b.1 עבור מבנים גדולים ≥ 400 מיקרומטר) או כלולים בג'ל (b.2; מבנים קטנים ≤ 400 מיקרומטר) עבור התייבשות והטבעה פרפין. לאחר מכן גושי פרפין נחתכים ומוכתמים (צביעה היסטולוגית או אימונוכימית). תמונות של מקטעים דו-ממדיים מתקבלות בסורק שקופיות דיגיטלי או במיקרוסקופ זקוף ומנותחות על פלטפורמת ניתוח תמונות באמצעות ניתוח כמותי דיגיטלי מהיר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy pad Q Path blue</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes macrostar III Blc couv. Char. x1500</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassette microtwin white</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical hood</td>
			<td>Erlab</td>
			<td>FI82 5585-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips 1000 &#181;L</td>
			<td>Star lab Tip-One</td>
			<td>S1122-1730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Pyramid innovation</td>
			<td>R35002-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottom glass tubes with PTFE lined 2 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11784259</td>
			<td>Excellent&#160; for environmental&#160;&#160;&#160; samples,&#160;&#160;&#160; pharmaceuticals and diagnostic reagents. PTFE is designed for the ultimate in product safety. PTFE provides totally inert inner seal and surface facing the sample or product.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish plate 35 mm</td>
			<td>Ibedi</td>
			<td>2018003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal agitation</td>
			<td>N-BIOTEK</td>
			<td>NB-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator prewarmed to 65 &#176;C</td>
			<td>Memmert Incubator</td>
			<td>LAB129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inox molds 15x15</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-1918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides Matsunami TOMO-11/90</td>
			<td>Roche diagnostics</td>
			<td>8082286001</td>
			<td>these slides are used for a better adhesion of sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>HM340E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panoramic scan II</td>
			<td>3dhistech</td>
			<td>2397612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin embedding equipment</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette Pasteur 2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Path flacon 150mL cape blanc x250</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-1308</td>
			<td>Good for environmental&#160;&#160;&#160; samples,&#160;&#160;&#160; pharmaceuticals and diagnostic reagents. Polypropylene (PP) are rigid,&#160; solid, provide excellent&#160; stress&#160; crack&#160; and&#160; impact&#160; resistance and have a&#160; good oil and alcohol barrier and chemical resistance. PE-lined cap is stress crack resistant and offers&#160; excellent&#160; sealing&#160; characteristics.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Set of micropipettors&#160; (p200, p1000)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11877351 (20-200) 11887351(p1000)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPERA PHENIX</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>HH14000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP5 inverted confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LSM780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue cassette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-0228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiomager microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SIP 60549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoblock (kit)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10066588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57648266</td>
			<td>CAUTION: toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin aqueous 1%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT110316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83804.360</td>
			<td>CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.365</td>
			<td>CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin 4%</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>F/40877-36</td>
			<td>CAUTION: Formalin contains formaldehyde which is hazardous. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fructose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gill hematoxylin type II</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>F/CP813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td>CAUTION: Suspected of causing genetic defects.&#160; Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Wax tek III</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS) 1 X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Buffered Saline (TBS) 10X</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>F/00801</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8532</td>
			<td>CAUTION: Triton X&#173;100 is hazardous. Avoid contact with skin and eyes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>534056</td>
			<td>CAUTION: Xylene is toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Clearing solution</td>
			<td>Glycerol-Fructose clearing solution is 60% (vol/w) glycerol and 2.5 M fructose. To prepare 10 mL of this solution, mix 6 mL of glycerol and 4.5 g of fructose. Complete to 10 mL with dH2O. Use a magnetic stirrer overnight. Refractive index = 1.4688 at room temperature (RT: 19&#8211;23 &#176;C). Store at 4 &#176;C in dark for up to 1 month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">PBS-BSA 0,1% solution</td>
			<td>To prepare 0,1% (vol/wt) PBS-BSA 0,1% solution, dissolve 500 mg of BSA in 50 mL of PBS-1X (store at 4&#176;C for up to 2 weeks). And dilute 1mL of this solution into 9mL of PBS-1X. This solution can be used to precoat the tip and centrifugation tube.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Permeabilisation-blocking solution (PB solution)</td>
			<td>The PBSDT blocking solution is PBS-1X supplemented with 0.1% &#8211; 1% Tritonx-100 (depending on the protein localization membrane/nucleus), 1% DMSO, 1% BSA and 1% donkey serum (or from the animal in which the secondary antibodies were raised). This solution can be stored at 4&#176;C for up to 1 month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">PB:PBS-1X &#160;(1:10) solution</td>
			<td>PB:PBS-1X &#160;(1:10) solution is a 10 time diluted PB solution. To prepare 10 mL of this solution dilute 1 mL of PB solution in 9 mL of PBS-1X.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halo software</td>
			<td>Indicalabs</td>
			<td>NM 87114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harmony software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>HH17000010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

staining and high-resolution imaging of three-dimensional organoid and spheroid models

מודלים תלת-ממדיים של תרביות תאים במבחנה (3D), כגון אורגנואידים וספרואידים, הם כלים רבי ערך עבור יישומים רבים, כולל פיתוח ומידול מחלות, גילוי תרופות ורפואה רגנרטיבית. כדי לנצל מודלים אלה במלואם, חיוני לחקור אותם ברמה התאית והתת-תאית. עם זאת, אפיון מודלים כאלה של תרביות תאים תלת-ממדיות במבחנה יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית ודורש מומחיות ספציפית לביצוע ניתוחים יעילים. כאן, מאמר זה מספק פרוטוקולים מפורטים, חזקים ומשלימים לביצוע דימות צביעה ורזולוציה תת-תאית של מודלים קבועים של תרביות תאים תלת-ממדיות במבחנה בטווח של 100 מיקרומטר עד מספר מילימטרים. פרוטוקולים אלה ישימים למגוון רחב של אורגנואידים וספרואידים הנבדלים זה מזה בתנאי המוצא של התא, המורפולוגיה והתרבית שלהם. מקצירת מבנה תלת-ממדית ועד ניתוח תמונות, ניתן להשלים פרוטוקולים אלה תוך 4-5 ימים. בקצרה, מבנים תלת-ממדיים נאספים, קבועים, ולאחר מכן ניתן לעבד אותם באמצעות הטבעה של פרפין וצביעה היסטולוגית/אימונוהיסטוכימית, או באמצעות סימון חיסוני ישיר והכנה לניקוי אופטי ושחזור תלת-ממדי (עומק 200 מיקרומטר) במיקרוסקופ קונפוקלי.

פרוטוקול זה מספק סקירה כללית של השלבים הקריטיים לצביעה דו-ממדית ותלת-ממדית של הרכבה מלאה, כמו גם הדמיה וניתוח כמותי של מודלים תלת-ממדיים של תרביות תאים (איור 3 ואיור 4). הוא ישים למגוון רחב של מודלים תלת-ממדיים של תרביות תאים – מספרואידים ועד אורגנואידים ממינים או רקמות מארחים שונים – ומאפשר קבלת מידע מדויק וכמותי על ארכיטקטורה, ארגון תאים ואינטראקציות ברמה התאית והתת-תאית (איור 3 ואיור 4). מעבדות עשויות להזדקק לאופטימיזציה של טכניקות היסטולוגיות ואימונוהיסטוכימיות דו-ממדיות וריכוזי נוגדנים בהתאם לצרכים שלהן.
שתי השיטות מניבות מידע ביולוגי רב ערך. צביעה תלת-ממדית בהרכבה מלאה ומיקרוסקופ קונפוקלי מספקים מידע חזותי על הרכב התאים והמיקום המרחבי עם שדה עומק של עד 200 מיקרומטר (איור 3B). עם זאת, חתך דו-ממדי נוח למבנים תלת-ממדיים גדולים יותר לחשוף תכונות מורפולוגיות תאיות מפורטות בכל החלק של מבנים תלת-ממדיים שאחרת יכול להיות מאתגר לצפות בהן באתרן עקב פיזור אור שפוגע ברזולוציה בדגימות גדולות יותר. יתר על כן, שתי הטכניקות יכולות לספק נתונים כמותיים. ואכן, הרזולוציה המתקבלת מאפשרת יישום של אלגוריתמי סגמנטציה תאיים ותת-תאיים לכימות מספר התאים ולזיהוי נוכחות של סמנים תאיים שונים בתת-סוגים תאיים שונים (איור 3F ואיור 4). לסיכום, טכניקות ההדמיה המתוארות כאן ניתנות לשחזור, פשוטות ומשלימות ומייצגות כלים רבי ערך לחקר הטרוגניות תאית.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig03.jpg"> איור 3: תוצאות מייצגות עבור הרכבה שלמה תלת-ממדית, הדמיה וניתוח של מקטעים אופטיים תלת-ממדיים ודו-ממדיים. (A) תמונות קונפוקליות של גליומה ספרואיד בדרגה גבוהה (h) אנושיים שגודלו בתרבית במשך שבוע וסומנו עם Hoechst (כחול), Olig2 (צהוב) ו-Actin (אדום) (20x מטרת מים). עבור כל התמונות שנרכשו, הגדרות המיקרוסקופ נקבעו באמצעות בקרה חיובית (למעלה), ולאחר מכן הבקרה השלילית צולמה באמצעות הגדרות זהות כדי לשלוט בחוסר פלואורסצנטיות בהיעדר נוגדן ראשוני (למטה). (B) ייצוג תלת-ממדי אורתוגונלי של צביעת Ki67 המבוצע ב-(h) גליומה ספרואיד בדרגה גבוהה בתרבית במשך שבוע (ניקוי גליצרול-פרוקטוז; 20x מטרת מים, קונפוקל). (C) תמונות קונפוקליות של (h) גליומה ספרואיד ברמה גבוהה שגודלו בתרבית במשך שבוע וסומנו עם Hoechst (כחול), Olig2 (צהוב) ו-Phalloidine-488 (ירוק) (ניקוי גליצרול-פרוקטוז; יעד מים פי 20). (D) תמונות קונפוקליות של ספרואידים אנושיים (h) רבדומיוסרקומה (למעלה) ועכבר (m) תאי פסגה עצביים (למטה) שגודלו בתרבית במשך שבוע וסומנו ב-Hoechst (כחול), Actin (אדום) ו-Ki67 (ירוק), בהתאמה (ניקוי גליצרול-פרוקטוז; 20x מטרה יבשה). (E) תמונות קונפוקליות של (h) גליומה ספרואיד ברמה גבוהה שגודלו בתרבית במשך שבוע וסומנו עם Hoechst (כחול) ו-Ki67 (ירוק) (ניקוי גליצרול-פרוקטוז; 40x מטרת מים) (למעלה משמאל). תמונות מקוטעות בערוץ Hoechst ובאזורים גרעיניים חיוביים ל-Ki67 (+) בערוץ הירוק נוצרו באמצעות תוכנת ניתוח תוכן גבוה (ראו איור משלים 1 וטבלת חומרים) (למטה). הפלט הנתון הוא אחוז גרעיני Ki67+ לכל מבנה תלת-ממדי מקוטע (למעלה מימין). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig04.jpg"> איור 4: תוצאות מייצגות עבור הדמיה וניתוח של מקטעים אופטיים דו-ממדיים. (A, D) תמונות חתך דו-ממדיות של מודל תא תלת-ממדי (ספרואידים אנושיים מסוג rhabdomyosarcoma שגודלו בתרבית במשך חודש) שהתקבלו באמצעות סורק שקופיות דיגיטלי ונותחו על פלטפורמה לניתוח כמותי דיגיטלי מהיר. (A) צביעת H&E ואיתור תאים בהתאם לגודלם. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. (B) היסטוגרמה מראה אחוז התאים < 100 מיקרומטר 2 ו- > 100 מיקרומטר2 שזוהו באמצעות תוכנה לניתוח כמותי דיגיטלי מהיר (משמאל: Halo) או ספירה ידנית (מימין: MC). (C) צביעת Ki67 וזיהוי תאים בהתאם לעוצמת האות 3,3'-diaminobenzidine (DAB) שלהם. שלילי (כחול), חיובי חלש (צהוב), חיובי (אדום). סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. (D) היסטוגרמה מציגה אחוז של תאים שליליים מסוג Ki67, חיוביים חלשים וחיוביים. קיצורים: H&E = hematoxylin ו eosin; MC = ספירה ידנית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
תרשים משלים 1: סקירה כללית של השלבים בתוכנת ניתוח ההדמיה. הניתוחים מבוססים על שיוך אבני בניין. כל אבן בניין מתאימה לפונקציה - סגמנטציה, חישוב, שיוך, הגדרת פלט - ומציעה אלגוריתמים מרובים ובחירות משתנים כדי להתאים למדגם הביולוגי המצולם. התוכנה מספקת פרוטוקולי ניתוח RMS מרובים (Ready Made Solution) שניתן להשתמש בהם ולשנות בקלות. ניתן לשמור פרוטוקולי ניתוח תמונה משולבים, להחיל אותם על ערכות נתונים שונות ולשתף אותם בין משתמשים. בקצרה, פרוטוקול הניתוח מרמז על פילוח אובייקטים רציף: ספרואידים, גרעינים ולבסוף, כיסי Ki67 (A488). לאחר מכן, העוצמה הממוצעת של כיסי Ki67 מחושבת כדי להפלות עוד יותר את האירועים החיוביים. לבסוף, גרעינים המקיפים כיסים חיוביים Ki67 נבחרים באופן חיובי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/Suppl1_Harmony%20analysis_Revised.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
תרשים משלים 2: סקירה כללית של שלבי הפרוצדורה של תוכנת הניתוח הכמותי. שלב 1. העלה את הקבצים באמצעות הכרטיסיה מחקרים . הקבצים ייפתחו במקטע פעולות תמונה . שלב 2. פתחו את הכרטיסייה ' ביאורים ' ולחצו על 'פעולות שכבה ' כדי לעצב שכבה חדשה מסביב למבנה באמצעות הכלי עיגול של סרגל הכלים. למבנים שאינם עגולים, ניתן להשתמש בכלי העט במקום זאת. שלב 3. ניתן להשתמש בסרגל הכלים כדי לעצב ביאורים ולהמחיש את הכימות באמצעות הכלי <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62280/62280eq01.jpg">. שלב 4. פתח את הכרטיסייה ניתוח ובחר את התנאים הטובים ביותר לניתוח המדגם (ייתכן שיהיה צורך במספר ניסויים כאן). שלב 4.1. השתמשו באזור 'בחירת כתמים ' כדי להגדיר את מצב הצביעה. במקרה של מספר כתמים, ניתן להוסיף אותם ולשנות את שמם, וניתן לשנות את הצבע הווירטואלי . זיהוי הלוקליזציה יכול להיות מוגדר - צביעה גרעינית או ציטופלסמה. שלב 4.2. השתמש במקטע זיהוי תאים כדי להגדיר את זיהוי התא. סעיף זה יהיה החשוב ביותר לניתוח. סעיף סף הניגודיות הגרעינית יאפשר גילוי של כל הגרעינים. יש לשים לב במקרה שיש מספר גדלי אוכלוסייה, התוכנה יכולה לזהות מספר תאים במקום תא גדול ייחודי. ניתן להשתמש במדורי גודל גרעיני ותוקפנות פילוח גרעיני כדי לכמת טווחי אוכלוסייה של גודל תאים. שלב 5. תיאור כיצד להפעיל ניתוח לדוגמה. בצע את השלבים המוצגים באיור. המקטע שכבת ביאור יפעיל את ההגדרה רק בשקופית זו. ניתן להמחיש את הכימות באמצעות הכלי <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62280/62280eq01.jpg">. חזור על שלבים 4.1-5 עד להשגת כימות מתאים. שלבים 6-6.1. שלבים אלה מאפשרים לך לצייר דמות באמצעות התוכנה. שלב 7. ניתן לשמור גרפיקה לכימות המתקבלת באמצעות תוכנה. שלב 8. ניתן לייצא נתונים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/Suppl2_Halo%20Images_revised.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models at JoVE.com

Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

כאן, אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים, חזקים ומשלימים לביצוע הדמיית צביעה ורזולוציה תת-תאית של מודלים קבועים של תרביות תאים תלת-ממדיות בטווח של 100 מיקרומטר עד מספר מילימטרים, ובכך מאפשרים הדמיה של המורפולוגיה, הרכב סוג התא והאינטראקציות ביניהם.

צביעה והדמיה ברזולוציה גבוהה של מודלים תלת מימדיים של אורגנואידים וכדוריים

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...

אפיון מודל תלת ממדי במבחנה ברזולוציה תאית ותת תאית הוא קריטי לניצול מלא, אך יכול להיות מאתגר. לכן, סיפקנו פרוטוקול משלים להדמיית צביעה ורזולוציה תת-תאית של מודלים תלת-ממדיים קבועים במבחנה הנעים בין 100 מיקרומטר למספר מילימטרים. מבנים תלת ממדיים הם רדיאליים, ויש לטפל בהם בזהירות.לפני הפיפט, בדוק את המיקום של המבנים התלת-ממדיים שלך בתוך הצינור כדי למנוע כל שאיפה. כפי שהתאמנו טכניקות קלאסיות להטמעת מבנים קטנים כגון אורגנואידים או ספרואידים, הוראות חזותיות יכולות לעזור למשתמשים בפעם הראשונה לבצע את המשימה ביתר קלות. מי שתדגים איתי את ההליך תהיה לורה פרנקולס, טכנאית מעבדה מהפלטפורמה לחקר הפתולוגיה.כדי להכין דוגמאות לצביעה תלת-ממדית של תושבת שלמה, השתמש בקצה פיפטה של מיליליטר אחד המקודד מראש עם BSA כדי להוסיף תרחיף מבנה תלת-ממדי של מיליליטר אחד לשפופרת של 500 מיקרוליטר של PBS. כאשר המבנים התלת-ממדיים התיישבו בתחתית הצינור, החלף בזהירות את PBS בתמיסת חסימת חדירה של 500 מיקרוליטר לדגירת שעה אחת בטמפרטורת החדר עם תסיסה אופקית עדינה במהירות של 30 עד 50 סיבובים לדקה. בסוף הדגירה, אפשרו למבנים התלת-ממדיים לשקוע שוב לפני ששטפו בזהירות את המבנים התלת-ממדיים פעמיים במיליליטר אחד של 0.1% PBS בתוספת BSA במשך שלוש דקות לכל שטיפה.לאחר השטיפה האחרונה, תייגו את המבנים התלת-ממדיים עם 250 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני ב-PBS למשך יומיים-שלושה עם תסיסה אופקית עדינה בארבע מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, שטפו את הדגימה בחמש שטיפות של שלוש דקות ושתי שטיפות של 15 דקות במיליליטר אחד של 0.1% PBS BSA לכל שטיפה. לאחר השטיפה האחרונה, תייגו את המבנים התלת-ממדיים עם 250 מיקרוליטר של הנוגדן המשני המתאים ב-PBS למשך 24 שעות בארבע מעלות צלזיוס עם תסיסה אופקית עדינה המוגנת מפני אור.למחרת, תייגו את המבנים התלת-ממדיים עם 250 מיקרוליטר מהריכוז המתאים של Hoechst 3342 לדגירת שעתיים בארבע מעלות צלזיוס עם תסיסה אופקית עדינה. בסוף הדגירה, שטפו את המבנים התלת-ממדיים חמש פעמים במשך שלוש דקות ופעמיים במשך 15 דקות במיליליטר אחד של PBS לכל שטיפה כפי שהודגם בהדגמה. לאחר השטיפה האחרונה, מעבירים את המבנים התלת-ממדיים למיקרו-צלחת פוליסטירן שחורה 96, ומוסיפים בעדינות 200 מיקרוליטר של תמיסת ניקוי על המבנים, תוך הימנעות מבועות.לאחר מכן מניחים את הצלחת מכוסה ברדיד אלומיניום בארבע מעלות צלזיוס למשך 48 שעות לפחות. כדי להטמיע מודלים גדולים של תרביות תאים תלת-ממדיות, השתמש בקצה פיפטה של מיליליטר אחד מצופה BSA כדי להעביר בזהירות את המבנים התלת-ממדיים לצינור זכוכית תחתון שטוח עם פקק בקבוק מרופד PTFE. לאחר שהמבנים שקעו, החליפו בזהירות את PBS באתנול 70% למשך דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר.בסוף הדגירה, להחליף את 70% אתנול עם מיליליטר אחד של מוכן לשימוש eosin Y פתרון. יש להעיף את הצינור ולהכתים את המבנים למשך 30 דקות לפחות. בתום הדגירה, יש לייבש את המבנים בשלוש שטיפות רצופות של 30 דקות במיליליטר אחד של 100% אתנול לכל שטיפה.לאחר ההתייבשות האחרונה, נקו את המבנים התלת-ממדיים עם שלוש שטיפות רצופות של 30 דקות במיליליטר אחד של קסילן לכל שטיפה מתחת למכסה מנוע כימי. לאחר טבילת הקסילן האחרונה, הניחו חתיכת פד ביופסיה ספוג קסילן בתא אחד של קלטת רקמת מיקרוטווין לבנה, והשתמשו בפיפטת פסטר פלסטיק מצופה BSA של שני מיליליטר כדי להעביר את המבנים התלת-ממדיים אל הפד. כסו את המבנים התלת-ממדיים בכרית ביופסיה ספוגה קסילן נוספת כדי להחזיק את המבנים התלת-ממדיים במקומם ולסגור את הקלטת.לאחר שכל הדגימות הועברו, הניחו את הקלטות באמבט פרפין בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפני שתניחו את הקלטות באמבט פרפין טרי בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת בבוקר, מוסיפים פרפין נוזלי לתבנית הטבעה מחוממת אחת של 65 מעלות צלזיוס לכל דגימה, ומניחים דגימה אחת משובצת פרפין בכל תבנית. הסעירו בעדינות את התבניות עד שכל המבנים התלת-ממדיים צונחים לתחתית, והשתמשו במלקחיים עדינים מחוממים בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס כדי למקם את המבנים התלת-ממדיים במרכז כל תבנית.מצננים את התבנית עד שהפרפין יוצר שכבה מוצקה דקה, המבטיחה את המבנה התלת-ממדי במקומו. מניחים קסטת טישו ומוסיפים פרפין חם על התבנית. מוציאים את התבנית כאשר הפרפין התמצק לחלוטין.כדי להטמיע מודלים קטנים של תרביות תאים תלת-ממדיות, שטפו בעדינות את המבנים התלת-ממדיים שלוש פעמים במיליליטר אחד של TBS לכל שטיפה. לאחר השטיפה האחרונה, מוציאים כמה שיותר TBS מבלי לגעת במבנים, ומוסיפים שתי טיפות מגיב שתיים מערכת הטבעה מסחרית של פרפין. מערבבים בעדינות על ידי הקשה, ומוסיפים שתי טיפות מגיב, אחת עם הקשה עד שהג'ל מתמצק.השתמשו במלקחיים עדינים כדי להעביר את הג'ל מהבאר של הקלטת שהורכבה מראש מהערכה, ולייבש את הדגימה המשובצת בג'ל עם דגירות אתנול וקסילן עולות של 30 דקות במכסה אדים כפי שצוין. לאחר טבילת הקסילן האחרונה, הניחו את הקלטת באמבט פרפין בטמפרטורה של 65 מעלות למשך הלילה לפני שתשתמשו במלקחיים עדינים כדי להעביר את הדגימה המשובצת בפרפין למרכז תבנית הטבעה מחוממת של פרפין נוזלי בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס. לאחר מכן אבטחו את המבנה התלת-ממדי עם שכבה נוספת של פרפין כפי שהודגם עבור מודלים גדולים של תרביות תאים תלת-ממדיות.צביעה תלת ממדית של הר שלם ומיקרוסקופ קונפוקלי מספקים מידע חזותי על ההרכב התאי והמיקום המרחבי של מודלי התרבית התלת-ממדית לשדה עומק של עד 200 מיקרון. הרזולוציה הגבוהה שניתן לקבל עבור מבנים תלת-ממדיים באמצעות פרוטוקול זה מאפשרת יישום של אלגוריתמי סגמנטציה תאיים ותת-תאיים לכימות מספר התא ולאיתור סמני תאים שונים בתוך תת-סוגים שונים של תאים. ניתוח תושבות שלמות תלת-ממדיות יכול להיות מיושם על תאים דמיוניים בעומק של עד 200 מיקרון, ללא קשר למבנים השלמים.להיפך, ניתוח חתכים דו-ממדי יכול לספק תובנות לגבי תאים בכל גודל.

Research

JoVE Journal

Biology

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

ברזולוציה גבוהה מדידה של התנהגות ריח מונחה על הזחלים תסיסנית

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

תא תרבויות העצבית מ Aplysia עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של קונוסים צמיחה

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the IÃƒâ€šÃ‚Â·Cryo Kit

הזרע עכבר cryopreservation ושחזור באמצעות · אני cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

בידוד של תאים אפיתל החלב של תלת ממדי תאים משולבים תרבות משותפת אליפטית

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

שתי והדמית תא חייה תלת ממדית של חלבוני תגובת ניזק לדנ&quot;א

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

לטווח ארוך הדמיה, ברזולוציה גבוהה Confocal זמן פקיעה של<em&gt; טבורית ארבידופסיס</em&gt; אפידרמיס במהלך הנביטה

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

שימוש ברזולוציה גבוהה טומוגרפיה ממוחשבת כדי להמחיש את המבנה התל ממדים ופונקציה של הצמח vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

מערכת תרבות עכבר העוברי שלם מעי ל<em&gt; Ex Vivo</em&gt; מניפולציה של מסלולי איתות והדמית חיה תלת ממדית של פיתוח שליה

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

סריג הדמיה ב הידרוג תלת ממדי

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של Dynamics microtubule In Living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...