Name: staining and high-resolution imaging of three-dimensional organoid and spheroid models
Uploaded: 2021-03-27T14:00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dal St Baldrick's Robert J. Arceci Innovation Award #604303.

<ol>
	<li>Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+system+methods+and+applications+for+mesenchymal+stem+cells.">Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells.</a> Cells. 8 (12), 1-13 (2019).</li><li>Bartfeld, S., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+organoids+and+their+application+for+medical+research+and+patient+treatment.">Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment.</a> Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).</li><li>Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+multicellular+spheroids+formation.">Advances in multicellular spheroids formation.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 14 (127), (2017).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation.">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1724-1743 (2016).</li><li>Rezanejad, H., Lock, J. H., Sullivan, B. A., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+pancreatic+ductal+organoids+and+whole-mount+immunostaining+of+intact+organoids.">Generation of pancreatic ductal organoids and whole-mount immunostaining of intact organoids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 82 (2019).</li><li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+systems+and+their+applications+in+drug+discovery+and+cell-based+biosensors.">Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).</li><li>McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+and+assessment+of+human+primary+prostate+organoid+culture.">Handling and assessment of human primary prostate organoid culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e59051 (2019).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li><li>Lazzari, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+fluorescence+microscopy+versus+confocal+microscopy:+in+quest+of+a+suitable+tool+to+assess+drug+and+nanomedicine+penetration+into+multicellular+tumor+spheroids.">Light sheet fluorescence microscopy versus confocal microscopy: in quest of a suitable tool to assess drug and nanomedicine penetration into multicellular tumor spheroids.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 142, 195-203 (2019).</li><li>Gabriel, J., Brennan, D., Elisseeff, J. H., Beachley, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+embedding/sectioning+for+parallel+analysis+of+3D+cell+spheroids.">Microarray embedding/sectioning for parallel analysis of 3D cell spheroids.</a> Scientific Reports. 9, 16287 (2019).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La coltura cellulare è uno strumento indispensabile per scoprire i meccanismi biologici fondamentali coinvolti nello sviluppo, nella funzione, nella rigenerazione e nella distruzione dei tessuti e degli organi, e nella malattia. Sebbene la coltura cellulare 2D monostrato abbia predominato, la ricerca recente si è spostata verso colture che generano strutture 3D più riflettenti delle risposte cellulari in vivo, in particolare a causa dell'organizzazione spaziale aggiuntiva e dei contatti cellula-cellula che influenzano l'espressione genica e il comportamento cellulare e potrebbero quindi fornire dati più predittivi7. Tuttavia, rimangono molte sfide, tra cui la necessità di tecniche di colorazione e imaging user-friendly per la visualizzazione microscopica dettagliata e la valutazione di strutture 3D complesse a livello cellulare e subcellulare. In tale contesto, sono stati forniti protocolli dettagliati, robusti e complementari per eseguire la colorazione e l'imaging con risoluzione cellulare e subcellulare di modelli fissi di colture cellulari 3D in vitro di dimensioni comprese tra 100 μm e diversi millimetri.
Questa procedura presenta due diverse strategie per affrontare una grande varietà di dimensioni e tipi di modelli di coltura cellulare 3D in vitro. La scelta dell'uno (analisi 3D a montaggio intero) o dell'altro (analisi di sezionamento 2D) dipenderà dal modello utilizzato e dal problema esaminato. L'analisi 3D a montaggio intero mediante microscopia confocale consente la visualizzazione di cellule con un campo di profondità fino a 200 μm, indipendentemente dalle dimensioni complessive della struttura 3D, mentre il sezionamento 2D è applicabile a campioni di qualsiasi dimensione, ma la visualizzazione rimane dimensionale 2D. Di seguito sono riportati alcuni suggerimenti per la risoluzione dei problemi e considerazioni tecniche.
La perdita di strutture 3D durante il flusso di lavoro è lo svantaggio più comune. Possono rimanere aderenti alle punte e ai tubi, motivo per cui è fondamentale preverniciare punte e tubi con soluzione PBS-BSA allo 0,1%. Inoltre, è fondamentale lasciare che le strutture 3D sedimentino tra i cambiamenti del reagente ed eseguire tutto il pipettaggio con molta attenzione. Come menzionato nella procedura, per tutte le fasi, se la sedimentazione della struttura 3D è troppo lunga, le cellule possono essere fatte girare delicatamente a 50 × g per 5 minuti a RT. A seconda dello scopo dello studio, i vantaggi / svantaggi di tale fase di rotazione dovrebbero essere considerati in quanto la centrifugazione può compromettere la forma delle strutture 3D. Inoltre, bisogna fare attenzione a preservare questa morfologia durante la fase di fissazione perché gli organoidi cistici tendono a collassare. Il fissaggio di strutture di dimensioni inferiori a 400 μm dovrebbe impedire cambiamenti strutturali.
Per una marcatura immunologica ottimale, il recupero degli organoidi dalle loro matrici 3D è un passo cruciale. La matrice 3D può impedire un'adeguata penetrazione degli anticorpi o portare a un'elevata colorazione dello sfondo a causa del legame non specifico alla matrice. La rimozione della ECM può alterare la morfologia dei segmenti esterni degli organoidi (in particolare nel caso di piccole sporgenze cellulari che si estendono da strutture 3D studiate) e ostacolare parzialmente le analisi. Per tali strutture 3D, la matrice può essere mantenuta durante tutta la procedura; Tuttavia, le condizioni di coltura devono essere attentamente adattate per far crescere le cellule in una quantità minima di matrice per evitare una penetrazione insufficiente di soluzioni e anticorpi ed evitare fasi di lavaggio successive volte a ridurre l'eccessivo rumore di fondo 6,8.
La fase di pulizia ottica descritta in questo protocollo nella sezione di colorazione 3D dell'intero montaggio è pertinente per l'imaging di strutture 3D fino a 150-200 μm di profondità anziché 50-80 μm senza clearing. Rispetto ad altre metodologie di compensazione che spesso richiedono diverse settimane e utilizzano agenti di compensazione tossici, in questo protocollo 4,9 è stata utilizzata una fase di compensazione rapida e sicura precedentemente pubblicata. Inoltre, questa fase di pulizia è reversibile e nuovi anticorpi possono essere aggiunti alla colorazione iniziale senza perdita di risoluzione o luminosità4. Tuttavia, a seconda del modello di coltura cellulare 3D studiato, una profondità di 150-200 μm potrebbe non essere sufficiente per visualizzare la struttura 3D in modo informativo e questo protocollo di compensazione può causare cambiamenti nella morfologia generale degli organoidi sferici monostrato con grandi lumen4. Gli utenti dovrebbero progettare attentamente il loro esperimento e, se necessario, ottimizzare i tempi della fase di permeabilizzazione / blocco (per consentire la penetrazione degli anticorpi e della soluzione), la fase di compensazione (per penetrare più in profondità di 200 μm, i campioni dovrebbero essere completamente eliminati) e l'acquisizione delle immagini. Le due tecnologie più diffuse disponibili nelle strutture principali sarebbero il foglio leggero e la microscopia confocale. Gli utenti dovranno scegliere attentamente una tecnologia in base alle dimensioni delle loro strutture 3D e alla loro domanda biologica10. Tuttavia, rispetto alla microscopia confocale, la risoluzione al microscopio a foglio di luce ottenuta per strutture così profonde rimane subottimale per ottenere la risoluzione subcellulare.
Qui, è stato riportato un processo dettagliato e robusto dedicato all'incorporazione di paraffina di singoli campioni. È interessante notare che Gabriel et al. hanno recentemente sviluppato un protocollo che incorpora colture cellulari 3D in paraffina con una maggiore produttività. Hanno usato uno stampo in polidimetilsilossano (PDMS) per confinare 96 strutture 3D in un modello di microarray in un unico blocco, fornendo nuove prospettive per studi su modelli tumorali 3D che comprendono più gruppi, punti temporali, condizioni di trattamento e repliche11. Tuttavia, questo metodo richiede competenze e macchinari approfonditi, in particolare per la fabbricazione del prestampo utilizzato per creare stampi PDMS.
In sintesi, questo articolo descrive due approcci diversi, complementari e adattabili che consentono l'acquisizione di informazioni accurate e quantitative sulla composizione architettonica e cellulare dei modelli cellulari 3D. Entrambi i parametri sono cruciali per lo studio di processi biologici come l'eterogeneità cellulare intratumorale e il suo ruolo nella resistenza ai trattamenti.

Negli ultimi decenni, i progressi nella biologia delle cellule staminali e nelle tecnologie di coltura 3D in vitro hanno annunciato una rivoluzione nella biologia e nella medicina. I modelli cellulari di maggiore complessità in 3D sono diventati molto popolari in quanto consentono alle cellule di crescere e interagire con una struttura extracellulare circostante, ricapitolando da vicino gli aspetti dei tessuti viventi tra cui la loro architettura, l'organizzazione e le interazioni cellulari o persino le caratteristiche di diffusione. Pertanto, i modelli di coltura cellulare 3D possono fornire informazioni uniche sul comportamento delle cellule nei tessuti in via di sviluppo o malati in vitro. Gli organoidi e gli sferoidi sono entrambe strutture 3D multicellulari, che vanno da diversi micrometri a millimetri, e sono le strutture 3D in vitro più importanti. Entrambi possono essere coltivati all'interno di un'impalcatura di supporto che include (i) idrogel derivati da animali (estratto di membrana basale, collagene), piante (alginato / agarosio) o sintetizzati da sostanze chimiche, o (ii) matrici inerti contenenti pori per promuovere la proliferazione e la crescita cellulare.
Organoidi e sferoidi possono anche svilupparsi senza la presenza di un'impalcatura di supporto facendo affidamento sulle cellule per auto-assemblarsi in cluster. Ciò si basa su diverse tecniche come l'uso di materiali non adesivi per inibire l'attaccamento cellulare, la tensione superficiale e la forza gravitazionale (ad esempio, tecniche di caduta sospesa) o la rotazione circolare costante dei vasi (ad esempio, coltura di spinner). In tutti i casi, queste tecniche facilitano le interazioni cellula-cellula e cellula-matrice per superare i limiti della tradizionale coltura cellulare monostrato1. I termini "organoidi" e "sferoidi" sono stati usati in modo intercambiabile in passato, ma ci sono differenze chiave tra questi due modelli di coltura cellulare 3D. Gli organoidi sono cluster cellulari 3D in vitro derivati da cellule staminali pluripotenti o cellule staminali tessuto-specifiche, in cui le cellule si auto-organizzano spontaneamente in progenitori e tipi cellulari differenziati e che ricapitolano almeno alcune funzioni dell'organo di interesse2. Gli sferoidi comprendono una gamma più ampia di strutture 3D multicellulari formate in condizioni non aderenti e possono derivare da una grande varietà di tipi di cellule come linee cellulari immortalizzate o cellule primarie3. Quindi, inerente alle loro origini intrinseche delle cellule staminali, gli organoidi hanno una maggiore propensione all'autoassemblaggio, alla vitalità e alla stabilità rispetto agli sferoidi.
Tuttavia, in sostanza, questi due modelli sono strutture 3D composte da più cellule e le tecniche sviluppate per studiarle sono quindi molto simili. Ad esempio, potenti approcci di imaging a livello di risoluzione di una singola cellula sono necessari per sondare la complessità cellulare di organoidi e sferoidi. Qui, riassumendo l'esperienza di questo gruppo e quella dei leader nel campo degli organoidi4, questo articolo descrive procedure dettagliate per eseguire colorazioni bidimensionali (2D) e 3D a montaggio intero, imaging e analisi della composizione cellulare e subcellulare e dell'organizzazione spaziale di organoidi e sferoidi che vanno da 100 μm a diversi millimetri. In effetti, questa procedura presenta due tipi diversi e complementari di colorazione e acquisizione di immagini per analizzare una grande varietà di dimensioni e tipi di modelli di coltura cellulare 3D in vitro. L'uso dell'uno (analisi 3D a montaggio intero) o dell'altro (analisi di sezione 2D) dipenderà dal modello studiato e dalle risposte ricercate. L'analisi 3D a montaggio intero mediante microscopia confocale può, ad esempio, essere applicata per visualizzare cellule in coltura 3D fino a 200 μm di profondità, indipendentemente dalle dimensioni complessive della struttura 3D, mentre l'analisi di sezioni 2D fornisce approfondimenti su campioni di qualsiasi dimensione, anche se a livello 2D. Questa procedura è stata applicata con successo su una varietà di organoidi4,5 e sferoidi derivati da cellule umane e murine, provenienti da diversi strati germinali embrionali. La panoramica della procedura è illustrata nella Figura 1. Sono indicate le fasi principali, le relazioni tra loro, i passaggi decisivi e i tempi previsti.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig01.jpg"> Figura 1: Panoramica schematica della procedura. I modelli di coltura cellulare 3D in vitro vengono raccolti e fissati, quindi preparati per la colorazione 3D a montaggio intero (opzione a) o incorporati in paraffina per il sezionamento e la colorazione 2D (opzione b). Per gli esperimenti di colorazione 3D a montaggio intero, le strutture 3D fisse sono immunomarcate seguendo la fase di fissazione. È possibile eseguire una fase di pulizia ottica opzionale per migliorare la qualità dell'imaging e la profondità della microscopia ottica riducendo la diffusione della luce durante l'elaborazione delle immagini. Le immagini vengono catturate su un microscopio confocale invertito o su un sistema confocale ad alto contenuto e analizzate utilizzando il software appropriato. Per l'incorporazione di paraffina, le strutture 3D vengono elaborate direttamente (opzione b.1 per strutture di grandi dimensioni ≥ 400 μm) o incluse in un gel (b.2; piccole strutture ≤ 400 μm) per la disidratazione e l'incorporazione di paraffina. I blocchi di paraffina vengono quindi tagliati e colorati (colorazione istologica o immunochimica). Le immagini delle sezioni 2D sono ottenute su uno scanner digitale o un microscopio verticale e analizzate su una piattaforma di analisi delle immagini utilizzando un'analisi quantitativa digitale veloce. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy pad Q Path blue</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes macrostar III Blc couv. Char. x1500</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassette microtwin white</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical hood</td>
			<td>Erlab</td>
			<td>FI82 5585-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips 1000 &#181;L</td>
			<td>Star lab Tip-One</td>
			<td>S1122-1730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Pyramid innovation</td>
			<td>R35002-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottom glass tubes with PTFE lined 2 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11784259</td>
			<td>Excellent&#160; for environmental&#160;&#160;&#160; samples,&#160;&#160;&#160; pharmaceuticals and diagnostic reagents. PTFE is designed for the ultimate in product safety. PTFE provides totally inert inner seal and surface facing the sample or product.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish plate 35 mm</td>
			<td>Ibedi</td>
			<td>2018003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal agitation</td>
			<td>N-BIOTEK</td>
			<td>NB-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator prewarmed to 65 &#176;C</td>
			<td>Memmert Incubator</td>
			<td>LAB129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inox molds 15x15</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-1918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides Matsunami TOMO-11/90</td>
			<td>Roche diagnostics</td>
			<td>8082286001</td>
			<td>these slides are used for a better adhesion of sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>HM340E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panoramic scan II</td>
			<td>3dhistech</td>
			<td>2397612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin embedding equipment</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette Pasteur 2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Path flacon 150mL cape blanc x250</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-1308</td>
			<td>Good for environmental&#160;&#160;&#160; samples,&#160;&#160;&#160; pharmaceuticals and diagnostic reagents. Polypropylene (PP) are rigid,&#160; solid, provide excellent&#160; stress&#160; crack&#160; and&#160; impact&#160; resistance and have a&#160; good oil and alcohol barrier and chemical resistance. PE-lined cap is stress crack resistant and offers&#160; excellent&#160; sealing&#160; characteristics.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Set of micropipettors&#160; (p200, p1000)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11877351 (20-200) 11887351(p1000)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPERA PHENIX</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>HH14000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP5 inverted confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LSM780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue cassette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-0228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiomager microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SIP 60549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoblock (kit)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10066588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57648266</td>
			<td>CAUTION: toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin aqueous 1%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT110316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83804.360</td>
			<td>CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.365</td>
			<td>CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin 4%</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>F/40877-36</td>
			<td>CAUTION: Formalin contains formaldehyde which is hazardous. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fructose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gill hematoxylin type II</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>F/CP813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td>CAUTION: Suspected of causing genetic defects.&#160; Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Wax tek III</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS) 1 X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Buffered Saline (TBS) 10X</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>F/00801</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8532</td>
			<td>CAUTION: Triton X&#173;100 is hazardous. Avoid contact with skin and eyes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>534056</td>
			<td>CAUTION: Xylene is toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Clearing solution</td>
			<td>Glycerol-Fructose clearing solution is 60% (vol/w) glycerol and 2.5 M fructose. To prepare 10 mL of this solution, mix 6 mL of glycerol and 4.5 g of fructose. Complete to 10 mL with dH2O. Use a magnetic stirrer overnight. Refractive index = 1.4688 at room temperature (RT: 19&#8211;23 &#176;C). Store at 4 &#176;C in dark for up to 1 month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">PBS-BSA 0,1% solution</td>
			<td>To prepare 0,1% (vol/wt) PBS-BSA 0,1% solution, dissolve 500 mg of BSA in 50 mL of PBS-1X (store at 4&#176;C for up to 2 weeks). And dilute 1mL of this solution into 9mL of PBS-1X. This solution can be used to precoat the tip and centrifugation tube.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Permeabilisation-blocking solution (PB solution)</td>
			<td>The PBSDT blocking solution is PBS-1X supplemented with 0.1% &#8211; 1% Tritonx-100 (depending on the protein localization membrane/nucleus), 1% DMSO, 1% BSA and 1% donkey serum (or from the animal in which the secondary antibodies were raised). This solution can be stored at 4&#176;C for up to 1 month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">PB:PBS-1X &#160;(1:10) solution</td>
			<td>PB:PBS-1X &#160;(1:10) solution is a 10 time diluted PB solution. To prepare 10 mL of this solution dilute 1 mL of PB solution in 9 mL of PBS-1X.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halo software</td>
			<td>Indicalabs</td>
			<td>NM 87114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harmony software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>HH17000010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

staining and high-resolution imaging of three-dimensional organoid and spheroid models

I modelli di coltura cellulare tridimensionale (3D) in vitro, come organoidi e sferoidi, sono strumenti preziosi per molte applicazioni, tra cui lo sviluppo e la modellazione di malattie, la scoperta di farmaci e la medicina rigenerativa. Per sfruttare appieno questi modelli, è fondamentale studiarli a livello cellulare e subcellulare. Tuttavia, la caratterizzazione di tali modelli di coltura cellulare 3D in vitro può essere tecnicamente impegnativa e richiede competenze specifiche per eseguire analisi efficaci. Qui, questo documento fornisce protocolli dettagliati, robusti e complementari per eseguire la colorazione e l'imaging con risoluzione subcellulare di modelli di coltura cellulare 3D fissi in vitro che vanno da 100 μm a diversi millimetri. Questi protocolli sono applicabili a un'ampia varietà di organoidi e sferoidi che differiscono per cellula di origine, morfologia e condizioni di coltura. Dalla raccolta della struttura 3D all'analisi delle immagini, questi protocolli possono essere completati entro 4-5 giorni. In breve, le strutture 3D vengono raccolte, fissate e possono quindi essere elaborate attraverso l'incorporazione di paraffina e colorazione istologica / immunoistochimica, o direttamente immunomarcate e preparate per la pulizia ottica e la ricostruzione 3D (profondità 200 μm) mediante microscopia confocale.

Questo protocollo fornisce una panoramica delle fasi critiche per la colorazione 2D e 3D a montaggio intero, nonché l'imaging e le analisi quantitative dei modelli di coltura cellulare 3D (Figura 3 e Figura 4). È applicabile a una vasta gamma di modelli di coltura cellulare 3D, dagli sferoidi agli organoidi di diverse specie o tessuti ospiti, e consente l'acquisizione di informazioni accurate e quantitative sull'architettura, l'organizzazione cellulare e le interazioni a livello cellulare e subcellulare (Figura 3 e Figura 4). I laboratori potrebbero aver bisogno di ottimizzare le tecniche istologiche e immunoistochimiche 2D e le concentrazioni di anticorpi in base alle proprie esigenze.
Entrambi i metodi forniscono preziose informazioni biologiche. La colorazione 3D a montaggio intero e la microscopia confocale forniscono informazioni visive sulla composizione cellulare e sulla posizione spaziale con un campo di profondità fino a 200 μm (Figura 3B). Tuttavia, il sezionamento 2D è conveniente per le strutture 3D più grandi per rivelare tratti morfologici cellulari dettagliati nell'intera sezione delle strutture 3D che possono essere altrimenti difficili da osservare in situ a causa della diffusione della luce che compromette la risoluzione in campioni più grandi. Inoltre, entrambe le tecniche possono fornire dati quantitativi. Infatti, la risoluzione ottenuta consente l'applicazione di algoritmi di segmentazione cellulare e subcellulare per la quantificazione del numero di cellule e la rilevazione della presenza di vari marcatori cellulari in diversi sottotipi cellulari (Figura 3F e Figura 4). In sintesi, le tecniche di imaging qui descritte sono riproducibili, semplici e complementari e rappresentano strumenti preziosi per studiare l'eterogeneità cellulare.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig03.jpg"> Figura 3: Risultati rappresentativi per l'intera montatura 3D, l'imaging e l'analisi di sezioni ottiche 3D e 2D. (A) Immagini confocali di (h) sferoide glioma umano di alto grado coltivato per una settimana ed etichettato con Hoechst (blu), Olig2 (giallo) e Actina (rosso) (obiettivo 20x acqua). Per tutte le immagini acquisite, le impostazioni del microscopio sono state stabilite utilizzando un controllo positivo (in alto), e quindi il controllo negativo è stato ripreso utilizzando impostazioni identiche per controllare la mancanza di fluorescenza in assenza di anticorpi primari (in basso). (B) Rappresentazione ortogonale 3D a montaggio intero della colorazione Ki67 eseguita in (h) sferoide glioma di alto grado coltivato per una settimana (eliminazione glicerolo-fruttosio; obiettivo acqua 20x, confocale). (C) Immagini confocali di (h) sferoide glioma di alto grado coltivato per una settimana ed etichettato con Hoechst (blu), Olig2 (giallo) e Phalloidine-488 (verde) (eliminazione glicerolo-fruttosio; obiettivo acqua 20x). (D) Immagini confocali di sferoidi umani (h) rabdomiosarcoma (in alto) e di topo (m) (in basso) coltivati per una settimana ed etichettati rispettivamente con Hoechst (blu), actina (rosso) e Ki67 (verde) (eliminazione glicerolo-fruttosio; obiettivo secco 20x). (E) Immagini confocali di (h) sferoide glioma di alto grado coltivato per una settimana ed etichettato con Hoechst (blu) e Ki67 (verde) (eliminazione glicerolo-fruttosio; obiettivo acqua 40x) (in alto a sinistra). Le immagini segmentate sul canale di Hoechst e le regioni nucleari Ki67-positive (+) sul canale verde sono state generate utilizzando un software di analisi ad alto contenuto (vedi Figura supplementare 1 e Tabella dei materiali) (in basso). L'output dato è la percentuale di nuclei Ki67+ per struttura 3D segmentata (in alto a destra). Barra di scala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig04.jpg"> Figura 4: Risultati rappresentativi per l'imaging e l'analisi di sezioni ottiche 2D. (A, D) Immagini di sezione 2D di un modello cellulare 3D (sferoidi rabdomiosarcoma umani coltivati per un mese) ottenute con un scanner digitale e analizzate su una piattaforma per un'analisi quantitativa digitale veloce. (A) Colorazione H&E e rilevamento delle cellule in base alle loro dimensioni. Barra di scala = 500 μm. (B) L'istogramma mostra la percentuale di cellule < 100 μm 2 e > 100 μm2 rilevate utilizzando un software per l'analisi quantitativa digitale veloce (a sinistra: Halo) o il conteggio manuale (a destra: MC). (C) Colorazione di Ki67 e rilevamento delle cellule in funzione dell'intensità del loro segnale 3,3'-diaminobenzidina (DAB). Negativo (blu), debolmente positivo (giallo), positivo (rosso). Barra della scala = 500 μm. (D) L'istogramma mostra la percentuale di cellule Ki67-negative, debolmente positive e positive. Abbreviazioni: H&E = ematossilina ed eosina; MC = conteggio manuale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Figura supplementare 1: Panoramica delle fasi del software di analisi per immagini. Le analisi si basano sull'associazione di elementi costitutivi. Ogni blocco di costruzione corrisponde a una funzione - segmentazione, calcolo, associazione, definizione dell'output - e offre più algoritmi e selezioni di variabili per abbinare il campione biologico visualizzato. Il software fornisce più protocolli di analisi RMS (Ready Made Solution) che possono essere facilmente utilizzati e modificati. I protocolli di analisi delle immagini integrati possono essere salvati, applicati a diversi set di dati e condivisi tra gli utenti. In breve, il protocollo di analisi implica la segmentazione sequenziale degli oggetti: sferoide, nuclei e, infine, tasche Ki67 (A488). Quindi, l'intensità media delle sacche Ki67 viene calcolata per discriminare ulteriormente gli eventi positivi. Infine, i nuclei che comprendono le tasche positive Ki67 sono selezionati positivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/Suppl1_Harmony%20analysis_Revised.pdf" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Figura supplementare 2: Panoramica delle fasi procedurali del software di analisi quantitativa. Passo 1. Carica i file utilizzando la scheda Studi . I file verranno aperti nella sezione Azioni immagine . Passo 2. Aprite la scheda Annotazioni , quindi fate clic su Azioni livello per progettare un nuovo livello attorno alla struttura utilizzando lo strumento cerchio della barra degli strumenti. Per le strutture non circolari, è possibile utilizzare lo strumento penna . Passo 3. La barra degli strumenti può essere utilizzata per progettare annotazioni e visualizzare la quantificazione con lo <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62280/62280eq01.jpg">strumento. Passo 4. Aprire la scheda Analisi e selezionare le condizioni migliori per l'analisi del campione (potrebbero essere necessarie diverse prove qui). Passo 4.1. Utilizzare la sezione Selezione macchia per impostare la condizione di colorazione. In caso di più macchie, queste possono essere aggiunte e rinominate e il colore virtuale può essere modificato. Il rilevamento della localizzazione può essere specificato: colorazione nucleare o citoplasmatica. Passo 4.2. Utilizzare la sezione Rilevamento celle per configurare il rilevamento delle celle. Questa sezione sarà la più importante per l'analisi. La sezione Soglia di contrasto nucleare consentirà il rilevamento di tutti i nuclei. È necessario prestare attenzione nel caso in cui ci siano più dimensioni della popolazione, il software può rilevare diverse celle invece di una grande unica. Le sezioni Dimensione nucleare e Segmentazione nucleare aggressività possono essere utilizzate per quantificare gli intervalli di popolazione delle dimensioni delle cellule. Passo 5. Descrizione su come eseguire l'analisi dei campioni. Seguire i passaggi illustrati nella figura. La sezione Layer di annotazione eseguirà l'impostazione solo in questa diapositiva. La quantificazione può essere visualizzata utilizzando lo <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62280/62280eq01.jpg">strumento. Ripetere i punti 4.1-5 fino a ottenere un'adeguata quantificazione. Passi 6-6.1. Questi passaggi consentono di disegnare una figura utilizzando il software. Passo 7. I grafici di quantificazione ottenuti tramite software possono essere salvati. Passo 8. I dati possono essere esportati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/Suppl2_Halo%20Images_revised.pdf" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

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Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

Qui, forniamo protocolli dettagliati, robusti e complementari per eseguire la colorazione e l'imaging a risoluzione subcellulare di modelli di coltura cellulare tridimensionale fissi che vanno da 100 μm a diversi millimetri, consentendo così la visualizzazione della loro morfologia, composizione del tipo di cellula e interazioni.

Colorazione e imaging ad alta risoluzione di modelli organoidi e sferoidi tridimensionali

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...

La caratterizzazione del modello 3D in vitro a risoluzione cellulare e subcellulare è fondamentale per il pieno sfruttamento, ma può essere impegnativa. Pertanto, abbiamo fornito un protocollo complementare per la colorazione e l'imaging con risoluzione subcellulare di modelli 3D fissi in vitro che vanno da 100 micrometri a diversi millimetri. Le strutture 3D sono radiali e devono essere attentamente manipolate.Prima di pipettare, controllare la posizione delle strutture 3D all'interno del tubo per evitare qualsiasi aspirazione. Poiché abbiamo adattato le tecniche classiche per l'incorporazione di piccole strutture come organoidi o sferoidi, le istruzioni visualizzate possono aiutare gli utenti alle prime armi a eseguire l'attività più facilmente. A dimostrare la procedura con me sarà Laura Francols, un tecnico di laboratorio della Pathology Research Platform.Per preparare i campioni per la colorazione 3D a montaggio intero, utilizzare una punta per pipetta da un millilitro precodificata con BSA per aggiungere una sospensione strutturale 3D da un millilitro a un tubo da 500 microlitri di PBS. Quando le strutture 3D si sono depositate sul fondo del tubo, sostituire con cura il PBS con 500 microlitri di soluzione di blocco della permeabilizzazione per un'ora di incubazione a temperatura ambiente con delicata agitazione orizzontale a 30-50 giri al minuto. Alla fine dell'incubazione, lasciare che le strutture 3D sedimentino di nuovo prima di lavare accuratamente le strutture 3D due volte in un millilitro di 0,1% PBS integrato con BSA per tre minuti per lavaggio.Dopo l'ultimo lavaggio, etichettare le strutture 3D con 250 microlitri di anticorpi primari in PBS per due o tre giorni con delicata agitazione orizzontale a quattro gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione, lavare il campione con cinque lavaggi da tre minuti e due da 15 minuti in un millilitro di BSA allo 0,1% di PBS per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, etichettare le strutture 3D con 250 microlitri dell'anticorpo secondario appropriato in PBS per 24 ore a quattro gradi Celsius con delicata agitazione orizzontale protetta dalla luce.Il giorno successivo, etichettare le strutture 3D con 250 microlitri della concentrazione appropriata di Hoechst 3342 per un'incubazione di due ore a quattro gradi Celsius con delicata agitazione orizzontale. Alla fine dell'incubazione, lavare le strutture 3D cinque volte per tre minuti e due volte per 15 minuti in un millilitro di PBS per lavaggio come dimostrato. Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire le strutture 3D su una micropiastra di polistirene nero a 96 pozzetti e aggiungere delicatamente 200 microlitri di soluzione trasparente sulle strutture, evitando bolle.Quindi posizionare la piastra coperta con un foglio di alluminio a quattro gradi Celsius per almeno 48 ore. Per incorporare modelli di colture cellulari 3D di grandi dimensioni, utilizzare una punta di pipetta da un millilitro rivestita BSA per trasferire con cura le strutture 3D su un tubo di vetro a fondo piatto con un tappo di bottiglia rivestito in PTFE. Dopo che le strutture si sono sistemate, sostituire accuratamente il PBS con etanolo al 70% per un'incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente.Al termine dell'incubazione, sostituire l'etanolo al 70% con un millilitro di soluzione di eosina Y pronta all'uso. Sfiorare il tubo e macchiare le strutture per almeno 30 minuti. Al termine dell'incubazione, disidratare le strutture con tre lavaggi successivi di 30 minuti in un millilitro di etanolo al 100% per lavaggio.Dopo l'ultima disidratazione, pulire le strutture 3D con tre lavaggi successivi di 30 minuti in un millilitro di xilene per lavaggio sotto una cappa chimica. Dopo l'ultima immersione nello xilene, posizionare un pezzo di tampone per biopsia imbevuto di xilene in uno scomparto di una cassetta di tessuto microgemello bianco e utilizzare una pipetta Pasteur in plastica da due millilitri rivestita BSA per trasferire le strutture 3D sul pad. Coprire le strutture 3D con un altro tampone per biopsia imbevuto di xilene per tenere le strutture 3D in posizione e chiudere la cassetta.Quando tutti i campioni sono stati trasferiti, posizionare le cassette in un bagno di paraffina a 65 gradi Celsius per 30 minuti prima di posizionare le cassette in un bagno di paraffina fresco a 65 gradi Celsius durante la notte. La mattina seguente, aggiungere la paraffina liquida a uno stampo di incorporazione riscaldato a 65 gradi Celsius per campione e posizionare un campione incorporato di paraffina in ogni stampo. Agitare delicatamente gli stampi fino a quando tutte le strutture 3D cadono sul fondo e utilizzare una pinza fine riscaldata a 65 gradi Celsius per posizionare le strutture 3D al centro di ogni stampo.Raffreddare lo stampo fino a quando la paraffina forma un sottile strato solido, fissando la struttura 3D in posizione. Posizionare una cassetta di carta e aggiungere la paraffina calda sullo stampo. Rimuovere lo stampo quando la paraffina si è completamente solidificata.Per incorporare piccoli modelli di coltura cellulare 3D, lavare delicatamente le strutture 3D tre volte in un millilitro di TBS per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere quanto più TBS possibile senza toccare le strutture e aggiungere due gocce di reagente due da un kit di incorporamento di paraffina commerciale. Mescolare delicatamente picchiettando e aggiungere due gocce di reagente una con picchiettamento fino a quando il gel si solidifica.Utilizzare una pinza fine per trasferire il gel dal pozzetto della cassetta preassemblata dal kit e disidratare il campione incorporato nel gel con incubazioni ascendenti di etanolo e xilene di 30 minuti in una cappa aspirante come indicato. Dopo l'ultima immersione nello xilene, posizionare la cassetta in un bagno di paraffina a 65 gradi Celsius durante la notte prima di utilizzare una pinza fine per trasferire il campione incorporato in paraffina al centro di uno stampo di incorporamento riscaldato a 65 gradi Celsius caricato con paraffina liquida. Quindi fissare la struttura 3D con un altro strato di paraffina, come dimostrato per i modelli di coltura cellulare 3D di grandi dimensioni.La colorazione tridimensionale a montaggio intero e la microscopia confocale forniscono informazioni visive sulla composizione cellulare e sulla posizione spaziale dei modelli di coltura 3D a un campo di profondità fino a 200 micron. L'alta risoluzione che si può ottenere per le strutture 3D utilizzando questo protocollo consente l'applicazione di algoritmi di segmentazione cellulare e subcellulare per la quantificazione del numero di cellule e la rilevazione di vari marcatori cellulari all'interno di diversi sottotipi cellulari. L'analisi 3D di supporti interi può essere applicata a celle visualizzate fino a 200 micron di profondità, indipendentemente dall'intera struttura.Al contrario, l'analisi delle sezioni 2D può fornire informazioni su celle di qualsiasi dimensione.

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