Name: staining and high-resolution imaging of three-dimensional organoid and spheroid models
Uploaded: 2021-03-27T14:00:00
Duration: 7 min 35 s
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<ol>
	<li>Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+system+methods+and+applications+for+mesenchymal+stem+cells.">Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells.</a> Cells. 8 (12), 1-13 (2019).</li><li>Bartfeld, S., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+organoids+and+their+application+for+medical+research+and+patient+treatment.">Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment.</a> Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).</li><li>Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+multicellular+spheroids+formation.">Advances in multicellular spheroids formation.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 14 (127), (2017).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation.">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1724-1743 (2016).</li><li>Rezanejad, H., Lock, J. H., Sullivan, B. A., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+pancreatic+ductal+organoids+and+whole-mount+immunostaining+of+intact+organoids.">Generation of pancreatic ductal organoids and whole-mount immunostaining of intact organoids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 82 (2019).</li><li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+systems+and+their+applications+in+drug+discovery+and+cell-based+biosensors.">Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).</li><li>McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+and+assessment+of+human+primary+prostate+organoid+culture.">Handling and assessment of human primary prostate organoid culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e59051 (2019).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li><li>Lazzari, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+fluorescence+microscopy+versus+confocal+microscopy:+in+quest+of+a+suitable+tool+to+assess+drug+and+nanomedicine+penetration+into+multicellular+tumor+spheroids.">Light sheet fluorescence microscopy versus confocal microscopy: in quest of a suitable tool to assess drug and nanomedicine penetration into multicellular tumor spheroids.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 142, 195-203 (2019).</li><li>Gabriel, J., Brennan, D., Elisseeff, J. H., Beachley, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+embedding/sectioning+for+parallel+analysis+of+3D+cell+spheroids.">Microarray embedding/sectioning for parallel analysis of 3D cell spheroids.</a> Scientific Reports. 9, 16287 (2019).</li></ol>

著者は開示するものは何もありません。

細胞培養は、組織や臓器の発生、機能、再生と破壊、および疾患に関与する基本的な生物学的メカニズムを明らかにするために不可欠なツールです。単層2D細胞培養が主流でしたが、最近の研究では、特に遺伝子発現と細胞挙動に影響を与える追加の空間組織化と細胞間接触により、in vivo細胞応答をより反映した3D構造を生成する培養にシフトしており、したがって、より多くの予測データを提供する可能性があります7。それにもかかわらず、細胞および細胞内レベルでの複雑な3D構造の詳細な顕微鏡的視覚化および評価のためのユーザーフレンドリーな染色およびイメージング技術の必要性など、多くの課題が残っています。これに関連して、100 μmから数ミリメートルのサイズの固定in vitro 3D細胞培養モデルの染色および細胞および細胞内分解能イメージングを実行するための、詳細で堅牢で補完的なプロトコルが提供されてきました。
この手順では、さまざまなサイズとタイプのin vitro 3D細胞培養モデルに対処するための2つの異なる戦略を提示します。どちら(3Dホールマウント解析)か、もう一方(2Dセクショニング解析)を選択するかは、使用するモデルと調査した問題によって異なります。共焦点顕微鏡による3Dホールマウント分析は、3D構造の全体的なサイズに関係なく、最大200μmの深さのフィールドの細胞の視覚化を可能にしますが、2Dセクショニングはあらゆるサイズのサンプルに適用できますが、視覚化は2D次元のままです。以下は、トラブルシューティングと技術的な考慮事項に関するいくつかの提案です。
ワークフロー中の3D構造の損失は、最も一般的な欠点です。チップやチューブに付着し続けることができるため、チップやチューブをPBS-BSA 0.1%溶液でプレコーティングすることが重要です。さらに、試薬交換の間に3D構造の沈殿物を発生させ、すべてのピペッティングを非常に慎重に行うことが重要です。手順で述べたように、すべてのステップで、3D構造の沈降が長すぎる場合は、細胞を50 × g でRTで5分間穏やかに回転させることができます。 研究の目的に応じて、遠心分離は3D構造の形状を損なう可能性があるため、このような紡糸ステップの長所と短所を考慮する必要があります。さらに、嚢胞性オルガノイドは崩壊する傾向があるため、固定ステップ中にこの形態を維持するように注意する必要があります。400μm以下の構造物を固定することで、構造変化を防ぐことができます。
最適な免疫標識のためには、3Dマトリックスからのオルガノイドの回収が重要なステップです。3Dマトリックスは、マトリックスへの非特異的結合のために、適切な抗体浸透を妨げたり、高いバックグラウンド染色を引き起こしたりする可能性があります。ECMの除去は、オルガノイドの外側セグメントの形態を変化させ(特に、研究された3D構造から伸びる小さな細胞突起の場合)、分析を部分的に妨げる可能性があります。このような3D構造の場合、マトリックスは手順全体を通して保持できます。ただし、溶液および抗体の不十分な浸透を防ぎ、過度のバックグラウンドノイズを低減することを目的とした連続した洗浄ステップを回避するために、培養条件は最小量のマトリックスで細胞を増殖するように注意深く適合させる必要があります6,8。
このプロトコルの3Dホールマウント染色セクションで説明されている光学的クリアリングステップは、クリアせずに50〜80μmではなく、深さ150〜200μmまでの3D構造のイメージングに適しています。しばしば数週間を必要とし、有毒な清算剤を使用する他の清算方法論と比較して、以前に公開された迅速で安全な清算ステップがこのプロトコル4,9で使用された。さらに、この透明化ステップは可逆的であり、分解能や輝度を失うことなく、新しい抗体を初期染色に追加することができます4。それにもかかわらず、研究された3D細胞培養モデルによっては、150〜200μmの深さでは有益な方法で3D構造を画像化するのに十分ではない可能性があり、このクリアリングプロトコルは、大きなルーメンを持つ球状の単層オルガノイドの一般的な形態に変化を引き起こす可能性があります4。ユーザーは実験を慎重に設計し、必要に応じて、透過処理/ブロッキングステップ(抗体と溶液の浸透を可能にするため)、透明化ステップ(200μmより深く浸透するには、検体を完全に透明にする必要があります)、および画像取得のタイミングを最適化する必要があります。コア施設で利用できる2つの最も一般的な技術は、ライトシート顕微鏡と共焦点顕微鏡です。ユーザーは、3D構造のサイズと生物学的な質問10に基づいてテクノロジーを慎重に選択する必要があります。しかしながら、共焦点顕微鏡と比較して、そのような深部構造について得られるライトシート顕微鏡分解能は、細胞内分解能を得るには最適ではないままである。
ここでは、単一サンプルのパラフィン包埋に特化した詳細で堅牢なプロセスが報告されています。興味深いことに、Gabrielらは最近、スループットを向上させたパラフィンに3D細胞培養を埋め込むプロトコルを開発しました。彼らは、ポリジメチルシロキサン(PDMS)モールドを使用して、96の3D構造をマイクロアレイパターンで1つのブロックに閉じ込め、より多くのグループ、時点、治療条件、および複製を含む3D腫瘍モデルに関する研究に新しい視点を提供しました11。ただし、この方法では、特にPDMS金型の作成に使用されるプリモールドの製造には、広範なスキルと機械が必要です。
要約すると、この論文では、3D細胞モデルのアーキテクチャおよび細胞構成に関する正確で定量的な情報を取得できるようにする2つの異なる補完的で適応可能なアプローチについて説明します。両方のパラメータは、腫瘍内細胞の不均一性や治療に対する耐性におけるその役割などの生物学的プロセスを研究するために重要です。

過去数十年にわたって、幹細胞生物学とin vitro 3D培養技術の進歩は、生物学と医学の革命を告げてきました。3Dのより複雑な細胞モデルは、細胞が成長し、周囲の細胞外フレームワークと相互作用し、その構造、細胞組織と相互作用、さらには拡散特性を含む生体組織の側面を密接に再現できるため、非常に人気があります。そのため、3D細胞培養モデルは、in vitroで発生中の組織または病変組織における細胞の挙動に関する独自の洞察を提供することができます。オルガノイドとスフェロイドはどちらも数マイクロメートルからミリメートルの範囲の多細胞3D構造であり、in vitroで最も顕著な3D構造です。どちらも、(i)動物由来のヒドロゲル(基底膜抽出物、コラーゲン)、植物(アルギン酸塩/アガロース)、または化学物質から合成された、または(ii)細胞の増殖と成長を促進する細孔を含む不活性マトリックスを含む支持足場内で培養できます。
オルガノイドとスフェロイドは、細胞に依存してクラスターに自己組織化することにより、支持足場の存在なしに発達することもできます。これは、細胞の付着、表面張力および重力を阻害するための非接着材料の使用(例えば、ハンギングドロップ技術)、または血管の一定の円回転(例えば、スピナー培養)などの異なる技術に依存している。いずれの場合も、これらの技術は細胞間および細胞マトリックスの相互作用を促進し、従来の単層細胞培養の限界を克服します1。「オルガノイド」と「スフェロイド」という用語は過去に同じ意味で使用されてきましたが、これら2つの3D細胞培養モデルには重要な違いがあります。オルガノイドは、多能性幹細胞または組織特異的幹細胞に由来するin vitro3D細胞クラスターであり、細胞は自発的に前駆細胞および分化細胞型に自己組織化し、目的の器官の少なくともいくつかの機能を再現します2。スフェロイドは、非接着条件下で形成されたより広い範囲の多細胞3D構造を含み、不死化細胞株や初代細胞などの多種多様な細胞タイプから生じる可能性があります3。したがって、その固有の幹細胞起源に固有のオルガノイドは、スフェロイドよりも自己組織化、生存率、および安定性の傾向が高くなります。
それにもかかわらず、本質的に、これら2つのモデルは複数の細胞で構成される3D構造であり、それらを研究するために開発された技術は非常に似ています。例えば、オルガノイドとスフェロイドの両方の細胞の複雑さを調べるには、単一細胞分解能レベルでの強力なイメージングアプローチが必要です。本稿では、本研究グループの知見とオルガノイド分野のリーダーの知見をまとめて4、100μmから数mmの範囲のオルガノイドやスフェロイドの細胞・細胞内組成や空間構成を2次元(2D)・3Dホールマウント染色、イメージング、解析する詳細な手順について述べる。実際、この手順では、さまざまなサイズとタイプのin vitro 3D細胞培養モデルを分析するための、2つの異なる補完的なタイプの染色およびイメージング取得が提示されます。一方(3Dホールマウント解析)または他方(2D断面解析)のどちらを使用するかは、調査したモデルと求められる答えによって異なります。共焦点顕微鏡による3Dホールマウント分析は、例えば、3D構造の全体的なサイズに関係なく、深さ200μmまでの3D培養中の細胞を視覚化するために適用できますが、2Dセクションの分析は、2Dレベルではありますが、あらゆるサイズのサンプルへの洞察を提供します。この手順は、さまざまなオルガノイド4,5、およびさまざまな胚胚葉に由来するヒトおよびマウス細胞由来のスフェロイドにうまく適用されています。手順の概要を図 1 に示します。主要な段階、それらの間の関係、決定的なステップ、および予想されるタイミングが示されます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig01.jpg"> 図1:手順の概略図。In vitro 3D細胞培養モデルを収集して固定し、3Dホールマウント染色用に調製するか(オプションa)、2D切片作成および染色のためにパラフィンに包埋します(オプションb)。3Dホールマウント染色実験では、固定された3D構造は固定ステップの後に免疫標識されます。オプションの光学クリアリングステップを実行して、画像処理中の光散乱を低減することにより、光学顕微鏡のイメージング品質と深度を向上させることができます。画像は倒立共焦点顕微鏡または共焦点ハイコンテンツシステムでキャプチャされ、適切なソフトウェアを使用して分析されます。パラフィン包埋の場合、3D構造は直接処理されるか(400 μm≥大きな構造の場合はオプションb.1)、脱水およびパラフィン包埋のためにゲルに含まれます(b.2、 400 μm≤小さな構造)。次に、パラフィンブロックを切断して染色します(組織学的または免疫化学的染色)。2D切片の画像は、デジタルスライドスキャナーまたは正立顕微鏡で取得され、高速デジタル定量分析を使用して画像分析プラットフォームで分析されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy pad Q Path blue</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes macrostar III Blc couv. Char. x1500</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassette microtwin white</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical hood</td>
			<td>Erlab</td>
			<td>FI82 5585-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips 1000 &#181;L</td>
			<td>Star lab Tip-One</td>
			<td>S1122-1730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Pyramid innovation</td>
			<td>R35002-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottom glass tubes with PTFE lined 2 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11784259</td>
			<td>Excellent&#160; for environmental&#160;&#160;&#160; samples,&#160;&#160;&#160; pharmaceuticals and diagnostic reagents. PTFE is designed for the ultimate in product safety. PTFE provides totally inert inner seal and surface facing the sample or product.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish plate 35 mm</td>
			<td>Ibedi</td>
			<td>2018003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal agitation</td>
			<td>N-BIOTEK</td>
			<td>NB-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator prewarmed to 65 &#176;C</td>
			<td>Memmert Incubator</td>
			<td>LAB129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inox molds 15x15</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-1918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides Matsunami TOMO-11/90</td>
			<td>Roche diagnostics</td>
			<td>8082286001</td>
			<td>these slides are used for a better adhesion of sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>HM340E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panoramic scan II</td>
			<td>3dhistech</td>
			<td>2397612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin embedding equipment</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette Pasteur 2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Path flacon 150mL cape blanc x250</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-1308</td>
			<td>Good for environmental&#160;&#160;&#160; samples,&#160;&#160;&#160; pharmaceuticals and diagnostic reagents. Polypropylene (PP) are rigid,&#160; solid, provide excellent&#160; stress&#160; crack&#160; and&#160; impact&#160; resistance and have a&#160; good oil and alcohol barrier and chemical resistance. PE-lined cap is stress crack resistant and offers&#160; excellent&#160; sealing&#160; characteristics.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Set of micropipettors&#160; (p200, p1000)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11877351 (20-200) 11887351(p1000)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPERA PHENIX</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>HH14000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP5 inverted confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LSM780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue cassette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-0228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiomager microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SIP 60549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoblock (kit)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10066588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57648266</td>
			<td>CAUTION: toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin aqueous 1%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT110316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83804.360</td>
			<td>CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.365</td>
			<td>CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin 4%</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>F/40877-36</td>
			<td>CAUTION: Formalin contains formaldehyde which is hazardous. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fructose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gill hematoxylin type II</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>F/CP813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td>CAUTION: Suspected of causing genetic defects.&#160; Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Wax tek III</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS) 1 X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Buffered Saline (TBS) 10X</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>F/00801</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8532</td>
			<td>CAUTION: Triton X&#173;100 is hazardous. Avoid contact with skin and eyes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>534056</td>
			<td>CAUTION: Xylene is toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Clearing solution</td>
			<td>Glycerol-Fructose clearing solution is 60% (vol/w) glycerol and 2.5 M fructose. To prepare 10 mL of this solution, mix 6 mL of glycerol and 4.5 g of fructose. Complete to 10 mL with dH2O. Use a magnetic stirrer overnight. Refractive index = 1.4688 at room temperature (RT: 19&#8211;23 &#176;C). Store at 4 &#176;C in dark for up to 1 month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">PBS-BSA 0,1% solution</td>
			<td>To prepare 0,1% (vol/wt) PBS-BSA 0,1% solution, dissolve 500 mg of BSA in 50 mL of PBS-1X (store at 4&#176;C for up to 2 weeks). And dilute 1mL of this solution into 9mL of PBS-1X. This solution can be used to precoat the tip and centrifugation tube.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Permeabilisation-blocking solution (PB solution)</td>
			<td>The PBSDT blocking solution is PBS-1X supplemented with 0.1% &#8211; 1% Tritonx-100 (depending on the protein localization membrane/nucleus), 1% DMSO, 1% BSA and 1% donkey serum (or from the animal in which the secondary antibodies were raised). This solution can be stored at 4&#176;C for up to 1 month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">PB:PBS-1X &#160;(1:10) solution</td>
			<td>PB:PBS-1X &#160;(1:10) solution is a 10 time diluted PB solution. To prepare 10 mL of this solution dilute 1 mL of PB solution in 9 mL of PBS-1X.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halo software</td>
			<td>Indicalabs</td>
			<td>NM 87114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harmony software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>HH17000010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

staining and high-resolution imaging of three-dimensional organoid and spheroid models

オルガノイドやスフェロイドなどのin vitro三次元(3D)細胞培養モデルは、開発や疾患モデリング、創薬、再生医療など、多くのアプリケーションにとって貴重なツールです。これらのモデルを十分に活用するには、細胞レベルおよび細胞内レベルで研究することが重要です。ただし、このようなin vitro 3D細胞培養モデルの特性評価は技術的に困難な場合があり、効果的な分析を実行するには特定の専門知識が必要です。ここでは、この論文は、100 μmから数ミリメートルの範囲の固定in vitro 3D細胞培養モデルの染色および細胞内分解能イメージングを実行するための詳細で堅牢で補完的なプロトコルを提供します。これらのプロトコルは、起源細胞、形態、および培養条件が異なる多種多様なオルガノイドおよびスフェロイドに適用できます。3D構造収集から画像解析まで、これらのプロトコルは4〜5日以内に完了することができます。簡単に説明すると、3D構造を収集して固定し、パラフィン包埋および組織学的/免疫組織化学的染色によって処理するか、直接免疫標識して共焦点顕微鏡による光学的透明化および3D再構成(深さ200μm)のために調製することができます。

このプロトコルでは、2Dおよび3Dホールマウント染色の重要なステップの概要、および3D細胞培養モデルのイメージングおよび定量分析を提供します(図3および図4)。スフェロイドから異なる宿主種や組織のオルガノイドまで、幅広い3D細胞培養モデルに適用でき、細胞および細胞内レベルでの構造、細胞組織、相互作用に関する正確かつ定量的な情報を取得できます(図3および図4)。ラボは、独自のニーズに応じて、2D組織学的および免疫組織化学的手法と抗体濃度を最適化する必要がある場合があります。
どちらの方法も貴重な生物学的情報をもたらします。3Dホールマウント染色と共焦点顕微鏡は、最大200 μmの深さの視野で細胞組成と空間位置に関する視覚情報を提供します(図3B)。ただし、2Dセクショニングは、より大きな3D構造が3D構造のセクション全体で詳細な細胞形態学的特徴を明らかにするのに便利ですが、より大きなサンプルでは分解能を損なう光散乱のために、その場で観察することは困難です。さらに、どちらの手法も定量的データを提供できます。実際、得られた分解能により、細胞数の定量化および異なる細胞サブタイプにおける様々な細胞マーカーの存在の検出のための細胞および細胞内セグメンテーションアルゴリズムの適用が可能になる(図3Fおよび図4)。要約すると、ここで説明するイメージング技術は、再現性があり、単純で、補完的であり、細胞の不均一性を研究するための貴重なツールを表しています。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig03.jpg"> 図3:3Dおよび2D光学セクションの3Dホールマウント、イメージング、および解析の代表的な結果。 (A)ヒト(h)高悪性度神経膠腫スフェロイドを1週間培養し、ヘキスト(青)、Olig2(黄色)、アクチン(赤)(20倍の水対物レンズ)で標識した共焦点画像。取得したすべての画像について、ポジティブコントロール(上)を使用して顕微鏡設定を確立し、次に、一次抗体の非存在下での蛍光の欠如を制御するために同じ設定を使用してネガティブコントロールを画像化しました(下)。(B)1週間培養した高悪性度グリオーマスフェロイドで行われたKi67染色の直交3Dホールマウント表現(グリセロール-フルクトースクリアリング;20倍水対物レンズ、共焦点)。(C)(h)高悪性度神経膠腫スフェロイドを1週間培養し、ヘキスト(青)、Olig2(黄色)、およびファロイジン-488(緑)で標識した共焦点画像(グリセロール-フルクトースクリア;20倍対水レンズ)。(D)ヒト(h)横紋筋肉腫(上)およびマウス(m)神経堤細胞(下)スフェロイドを1週間培養し、それぞれヘキスト(青)、アクチン(赤)、Ki67(緑)で標識した共焦点画像(グリセロール-フルクトースクリアリング;20倍乾燥対物レンズ)。(E)(h)高悪性度神経膠腫スフェロイドを1週間培養し、ヘキスト(青)およびKi67(緑)で標識した共焦点画像(グリセロール-フルクトース透明化;40倍水対物レンズ)(左上)。ヘキストチャネルのセグメント化された画像と緑チャネルのKi67陽性(+)核領域は、ハイコンテント分析ソフトウェアを使用して生成されました(補足図1および材料表を参照)(下)。与えられた出力は、セグメント化された3D構造あたりのKi67+核の割合です(右上)。スケールバー = 100 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig04.jpg"> 図4:2D光学切片のイメージングと分析の代表的な結果。 (A、D)デジタルスライドスキャナーで取得した3D細胞モデル(ヒト横紋筋肉腫スフェロイドを1ヶ月間培養し、高速デジタル定量分析のためのプラットフォームで分析した2D断面画像。(A)細胞の大きさに応じたH&E染色と検出。スケールバー= 500μm。 (B)ヒストグラムは、高速デジタル定量分析(左:Halo)または手動カウント(右:MC)用のソフトウェアを使用して検出された100μm2および>100μm2<細胞の割合を示しています。(C)Ki67染色およびそれらの3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)シグナルの強度による細胞の検出。ネガティブ(青)、弱ポジティブ(黄色)、ポジティブ(赤)。スケールバー= 500μm。 (D)ヒストグラムは、Ki67陰性、弱陽性、陽性の細胞の割合を示す。略語:H&E =ヘマトキシリンとエオジン;MC =手動カウント。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足図1:イメージング解析ソフトウェアの手順の概要。 分析は、ビルディングブロックの関連付けに基づいています。関数(セグメンテーション、計算、関連付け、出力定義)に対応する各ビルディングブロックは、画像化される生物学的サンプルに一致する複数のアルゴリズムと変数選択を提供します。このソフトウェアは、簡単に使用および変更できる複数のRMS(既製ソリューション)分析プロトコルを提供します。統合された画像解析プロトコルを保存したり、さまざまなデータセットに適用したり、ユーザー間で共有したりできます。簡単に言えば、分析プロトコルは、回転楕円体、核、そして最後にKi67ポケット(A488)の連続したオブジェクトセグメンテーションを意味します。次に、Ki67ポケットの平均強度を計算して、陽性イベントをさらに識別します。最後に、Ki67ポジティブポケットを含む核がポジティブに選択されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/Suppl1_Harmony%20analysis_Revised.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図2:定量分析ソフトウェアの手順ステップの概要。 ステップ1.[スタディ] タブを使用してファイルをアップロードします。ファイルは[画像アクション]セクションで開きます。ステップ2.[注釈]タブを開き、[レイヤーアクション]をクリックして、ツールバーの円ツールを使用して構造全体に新しいレイヤーを設計します。非円形構造の場合は、代わりにペンツールを使用できます。ステップ3.ツールバーを使用して、アノテーションを設計し、ツールで<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62280/62280eq01.jpg">定量化を視覚化できます。ステップ4.分析タブを開き、サンプルの分析に最適な条件を選択します(ここではいくつかの試行が必要になる場合があります)。ステップ 4.1.[染色の選択]セクションを使用して、染色条件を設定します。複数の汚れが発生した場合は、これらを追加して名前を変更したり、仮想色を変更したりできます。局在検出は、核染色または細胞質染色を指定することができる。ステップ 4.2.[セル検出] セクションを使用して、セル検出を設定します。このセクションは、分析にとって最も重要になります。核コントラスト閾値セクションでは、すべての核の検出が可能になります。複数の母集団サイズがある場合には注意を払う必要があり、ソフトウェアは一意の大きな細胞ではなく複数の細胞を検出できます。核サイズおよび核セグメンテーションの攻撃性のセクションは、細胞サイズの集団範囲を定量化するために使用できます。ステップ5.サンプル分析の実行方法の説明。図に示す手順に従います。[注釈レイヤー]セクションでは、このスライドでのみ設定が実行されます。定量化は、ツールを使用して<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62280/62280eq01.jpg">視覚化できます。適切な定量が得られるまで、手順4.1〜5を繰り返します。ステップ6-6.1。これらの手順により、ソフトウェアを使用して図形を描くことができます。ステップ7。ソフトウェアで取得した定量グラフィックを保存することができます。ステップ8。データをエクスポートできます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/Suppl2_Halo%20Images_revised.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

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Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

ここでは、100 μmから数ミリメートルの範囲の固定3次元細胞培養モデルの染色および細胞内分解能イメージングを実行するための詳細で堅牢で補完的なプロトコルを提供し、それらの形態、細胞タイプの組成、および相互作用の視覚化を可能にします。

3次元オルガノイドおよびスフェロイドモデルの染色および高解像度イメージング

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...

細胞および細胞内分解能で3Din vitroモデルを特性評価することは、完全な活用に不可欠ですが、困難な場合があります。したがって、100マイクロメートルから数ミリメートルの範囲の固定3Din vitroモデルの染色および細胞内分解能イメージングのための補完的なプロトコルを提供しました。3D 構造は放射状であり、慎重に操作する必要があります。ピペッティングする前に、チューブ内の3D構造の位置を確認して、吸引を回避してください。オルガノイドやスフェロイドなどの小さな構造の埋め込みに古典的な手法を採用しているため、視覚化された指示は、初めてのユーザーがタスクをより簡単に実行するのに役立ちます。私と一緒に手順を実演するのは、病理学研究プラットフォームのラボ技術者であるローラ・フランコルスです。3Dホールマウント染色用のサンプルを調製するには、BSAで事前にコードされた1ミリリットルのピペットチップを使用して、1ミリリットルの3D構造懸濁液を500マイクロリットルのPBSチューブに追加します。3D構造がチューブの底に落ち着いたら、PBSを500マイクロリットルの透過処理ブロッキング溶液で慎重に交換し、室温で1時間インキュベートし、毎分30〜50回転で穏やかな水平攪拌を行います。インキュベーションの最後に、3D構造を再び沈降させてから、BSAを添加した1ミリリットルの0.1%PBSで3D構造を2回注意深く洗浄します。最後の洗浄後、3D構造をPBS中の250マイクロリットルの一次抗体で2〜3日間標識し、摂氏4度で穏やかに水平に攪拌します。インキュベーションの最後に、1回の洗浄につき1ミリリットルの0.1%PBS BSAで5回の3分間洗浄と2回の15分間洗浄でサンプルを洗浄します。最後の洗浄後、3D構造をPBS中の250マイクロリットルの適切な二次抗体で、光から保護された穏やかな水平攪拌で摂氏4度で24時間標識します。翌日、3D構造に250マイクロリットルの適切な濃度のHoechst 3342を標識し、摂氏4度で穏やかな水平攪拌で2時間インキュベートします。インキュベーションの最後に、実証されているように、3D構造を3分間5回、洗浄ごとに1ミリリットルのPBSで15分間2回洗浄します。最後の洗浄後、3D構造を96ウェルの黒色ポリスチレンマイクロプレートに移し、気泡を避けて200マイクロリットルの透明化溶液を構造にそっと加えます。次に、アルミホイルで覆われたプレートを摂氏4度で少なくとも48時間置きます。大規模な3D細胞培養モデルを埋め込むには、BSAコーティングされた1ミリリットルのピペットチップを使用して、PTFEで裏打ちされたボトルキャップ付きの平底ガラスチューブに3D構造を慎重に移します。構造が落ち着いたら、PBSを70%エタノールで慎重に交換し、室温で30分間インキュベートします。インキュベーションの最後に、70%エタノールを1ミリリットルのすぐに使用できるエオジンY溶液と交換します。チューブをフリックし、構造を少なくとも30分間染色します。インキュベーションの終わりに、洗浄ごとに1ミリリットルの100%エタノール中で30分間連続して30分間洗浄して構造を脱水する。最後の脱水の後、化学フードの下で洗浄ごとに1ミリリットルのキシレンで30分間連続して洗浄し、3D構造をクリアします。最後のキシレン浸漬後、キシレンに浸した生検パッドを白いマイクロツイン組織カセットの1つのコンパートメントに入れ、BSAコーティングされた2ミリリットルのプラスチックパスツールピペットを使用して3D構造をパッドに移します。3D構造を別のキシレンに浸した生検パッドで覆い、3D構造を所定の位置に保持し、カセットを閉じます。すべてのサンプルを移したら、カセットを摂氏65度のパラフィン浴に30分間入れてから、カセットを摂氏65度の新鮮なパラフィン浴に一晩入れます。翌朝、1サンプルにつき65°C加温した包埋型に流動パラフィンを加え、各型にパラフィン包埋試料を1個入れる。すべての3D構造が底に落ちるまで金型をゆっくりと攪拌し、摂氏65度で温めた細かい鉗子を使用して、3D構造を各金型の中央に配置します。パラフィンが薄い固体層を形成するまで金型を冷却し、3D構造を所定の位置に固定します。ティッシュカセットを置き、型の上にホットパラフィンを追加します。パラフィンが完全に固まったら金型を取り外します。小さな3D細胞培養モデルを埋め込むには、洗浄ごとに1ミリリットルのTBSで3D構造を3回穏やかに洗浄します。最後の洗浄後、構造に触れずにできるだけ多くのTBSを取り除き、市販のパラフィン包埋キットから2滴の試薬2滴を加えます。軽くたたいて軽く混ぜ、ゲルが固まるまで軽くたたく試薬を2滴加えます。細かい鉗子を使用して、キットから事前に組み立てられたカセットのウェルからゲルを移し、示されているように、ドラフト内で30分間上昇するエタノールとキシレンのインキュベーションでゲル包埋サンプルを脱水します。最後のキシレン浸漬後、カセットを摂氏65度のパラフィン浴に一晩置いてから、細かい鉗子を使用して、パラフィン包埋サンプルを摂氏65度で加温した包埋型を装填した流動パラフィンの中心に移します。次に、大規模な3D細胞培養モデルで実証されたように、もう1つのパラフィン層で3D構造を固定します。3次元ホールマウント染色と共焦点顕微鏡は、3D培養モデルの細胞組成と空間位置に関する視覚情報を最大200ミクロンの深さのフィールドまで提供します。このプロトコルを使用して3D構造に対して取得できる高分解能により、細胞数の定量化および異なる細胞サブタイプ内のさまざまな細胞マーカーの検出に、細胞および細胞内セグメンテーションアルゴリズムを適用できます。3Dホールマウント解析は、構造全体に関係なく、深さ200ミクロンまでの視覚化されたセルに適用できます。それどころか、2D断面分析は、あらゆるサイズの細胞に関する洞察を提供することができます。

Research

JoVE Journal

Biology

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Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

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Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

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リビングヒト臍帯静脈内皮細胞における高解像度タイムラプスイメージングと微小管ダイナミクスの自動解析

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