Name: staining and high-resolution imaging of three-dimensional organoid and spheroid models
Uploaded: 2021-03-27T14:00:00
Duration: 7 min 35 s
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Este trabalho foi apoiado pelo Prêmio de Inovação Robert J. Arceci #604303 da St Baldrick.

<ol>
	<li>Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+system+methods+and+applications+for+mesenchymal+stem+cells.">Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells.</a> Cells. 8 (12), 1-13 (2019).</li><li>Bartfeld, S., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+organoids+and+their+application+for+medical+research+and+patient+treatment.">Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment.</a> Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).</li><li>Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+multicellular+spheroids+formation.">Advances in multicellular spheroids formation.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 14 (127), (2017).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation.">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1724-1743 (2016).</li><li>Rezanejad, H., Lock, J. H., Sullivan, B. A., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+pancreatic+ductal+organoids+and+whole-mount+immunostaining+of+intact+organoids.">Generation of pancreatic ductal organoids and whole-mount immunostaining of intact organoids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 82 (2019).</li><li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+systems+and+their+applications+in+drug+discovery+and+cell-based+biosensors.">Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).</li><li>McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+and+assessment+of+human+primary+prostate+organoid+culture.">Handling and assessment of human primary prostate organoid culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e59051 (2019).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li><li>Lazzari, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+fluorescence+microscopy+versus+confocal+microscopy:+in+quest+of+a+suitable+tool+to+assess+drug+and+nanomedicine+penetration+into+multicellular+tumor+spheroids.">Light sheet fluorescence microscopy versus confocal microscopy: in quest of a suitable tool to assess drug and nanomedicine penetration into multicellular tumor spheroids.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 142, 195-203 (2019).</li><li>Gabriel, J., Brennan, D., Elisseeff, J. H., Beachley, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+embedding/sectioning+for+parallel+analysis+of+3D+cell+spheroids.">Microarray embedding/sectioning for parallel analysis of 3D cell spheroids.</a> Scientific Reports. 9, 16287 (2019).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A cultura de células é uma ferramenta indispensável para descobrir mecanismos biológicos fundamentais envolvidos no desenvolvimento de tecidos e órgãos, função, regeneração e ruptura e doença. Embora a cultura de células 2D monocamadas tenha predominado, pesquisas recentes mudaram para culturas que geram estruturas 3D mais reflexivas das respostas celulares in vivo, devido notavelmente à organização espacial adicional e aos contatos célula-célula que influenciam a expressão gênica e o comportamento celular e, portanto, poderiam fornecer dados mais preditivos7. No entanto, muitos desafios permanecem, incluindo a necessidade de técnicas de coloração e imagem fáceis de usar para visualização microscópica detalhada e avaliação de estruturas 3D complexas nos níveis celular e subcelular. Nesse contexto, protocolos detalhados, robustos e complementares foram fornecidos para realizar a coloração e imagens de resolução celular e subcelular de modelos de cultura celular 3D fixa in vitro que variam de 100 μm a vários milímetros de tamanho.
Este procedimento apresenta duas estratégias diferentes para lidar com uma grande variedade de tamanhos e tipos de modelos de cultura de células 3D in vitro. A escolha de um (análise de montagem inteira 3D) ou outro (análise de seccionamento 2D) dependerá do modelo utilizado e do problema investigado. A análise 3D de montagem completa por microscopia confocal permite a visualização de células com um campo de profundidade de até 200 μm, independentemente do tamanho total da estrutura 3D, enquanto o seccionamento 2D é aplicável a amostras de qualquer tamanho, mas a visualização permanece dimensional 2D. Abaixo estão algumas sugestões para solução de problemas e considerações técnicas.
A perda de estruturas 3D durante o fluxo de trabalho é a desvantagem mais comum. Eles podem permanecer aderentes às pontas e tubos, e é por isso que as pontas e tubos de pré-revestimento com solução PBS-BSA 0,1% são fundamentais. Além disso, é crucial deixar as estruturas 3D sedimentarem entre as mudanças de reagentes e realizar toda a pipetagem com muito cuidado. Como mencionado no procedimento, para todas as etapas, se a sedimentação da estrutura 3D for muito longa, as células podem ser giradas suavemente a 50 × g por 5 min no RT. Dependendo do objetivo do estudo, as vantagens/desvantagens de tal etapa de fiação devem ser consideradas, pois a centrifugação pode comprometer a forma das estruturas 3D. Além disso, deve-se tomar cuidado para preservar essa morfologia durante a etapa de fixação, pois os organoides císticos tendem a entrar em colapso. A fixação de estruturas com menos de 400 μm de tamanho deve evitar mudanças estruturais.
Para uma imunomarcação ideal, a recuperação de organoides de suas matrizes 3D é um passo crucial. A matriz 3D pode impedir a penetração adequada de anticorpos ou levar a uma alta coloração de fundo devido à ligação não específica à matriz. A remoção da ECM pode alterar a morfologia dos segmentos externos dos organoides (notavelmente no caso de pequenas saliências celulares que se estendem das estruturas 3D estudadas) e dificultar parcialmente as análises. Para tais estruturas 3D, a matriz pode ser mantida durante todo o procedimento; no entanto, as condições de cultura devem ser cuidadosamente adaptadas para cultivar células em uma quantidade mínima de matriz, a fim de evitar a penetração insuficiente de soluções e anticorpos e evitar sucessivas etapas de lavagem destinadas a reduzir o ruído de fundo excessivo 6,8.
A etapa de limpeza óptica descrita neste protocolo na seção de coloração de montagem inteira 3D é pertinente para a imagem de estruturas 3D de até 150-200 μm de profundidade, em vez de 50-80 μm sem limpeza. Em comparação com outras metodologias de compensação que muitas vezes requerem várias semanas e utilizam agentes de compensação tóxicos, uma etapa de compensação rápida e segura publicada anteriormente foi utilizada neste protocolo 4,9. Além disso, essa etapa de limpeza é reversível e novos anticorpos podem ser adicionados à coloração inicial sem perda de resolução ou brilho4. No entanto, dependendo do modelo de cultura de células 3D estudado, uma profundidade de 150-200 μm pode não ser suficiente para a imagem da estrutura 3D de forma informativa, e esse protocolo de limpeza pode causar alterações na morfologia geral de organoides esféricos, monocamadas, com grandes lúmens4. Os usuários devem projetar cuidadosamente seu experimento e, se necessário, otimizar o tempo da etapa de permeabilização/bloqueio (para permitir a penetração de anticorpos e solução), a etapa de limpeza (para penetrar mais profundamente em 200 μm, os espécimes devem ser totalmente limpos) e a aquisição de imagens. As duas tecnologias mais prevalentes disponíveis nas instalações centrais seriam a folha de luz e a microscopia confocal. Os usuários precisarão escolher cuidadosamente uma tecnologia com base no tamanho de suas estruturas 3D e sua questão biológica10. No entanto, em comparação com a microscopia confocal, a resolução da microscopia de folha de luz obtida para essas estruturas profundas permanece subótima para a obtenção de resolução subcelular.
Aqui, um processo detalhado e robusto foi relatado que é dedicado à incorporação de parafina de amostras únicas. Curiosamente, Gabriel et al. desenvolveram recentemente um protocolo que incorpora culturas de células 3D em parafina com um rendimento aumentado. Eles usaram um molde de polidimetilsiloxano (PDMS) para confinar 96 estruturas 3D em um padrão de microarray em um bloco, fornecendo novas perspectivas para estudos em modelos de tumores 3D abrangendo mais grupos, pontos de tempo, condições de tratamento e replicações11. No entanto, este método requer extensas habilidades e máquinas, nomeadamente para a fabricação do pré-molde usado para criar moldes PDMS.
Em resumo, este artigo descreve duas abordagens diferentes, complementares e adaptáveis, permitindo a aquisição de informações precisas e quantitativas sobre a composição arquitetônica e celular de modelos celulares 3D. Ambos os parâmetros são cruciais para o estudo de processos biológicos, como a heterogeneidade celular intratumoral e seu papel na resistência aos tratamentos.

Nas últimas décadas, os avanços na biologia de células-tronco e nas tecnologias de cultura 3D in vitro anunciaram uma revolução na biologia e na medicina. Modelos celulares de maior complexidade em 3D tornaram-se muito populares, pois permitem que as células cresçam e interajam com uma estrutura extracelular circundante, recapitulando de perto aspectos dos tecidos vivos, incluindo sua arquitetura, organização celular e interações, ou mesmo características de difusão. Como tal, os modelos de cultura de células 3D podem fornecer insights únicos sobre o comportamento das células em tecidos em desenvolvimento ou doentes in vitro. Organoides e esferoides são estruturas 3D multicelulares, variando de vários micrômetros a milímetros, e são as estruturas 3D in vitro mais proeminentes. Ambos podem ser cultivados dentro de um andaime de suporte, incluindo (i) hidrogéis derivados de animais (extrato de membrana basal, colágeno), plantas (alginato / agarose), ou sintetizados a partir de produtos químicos, ou (ii) matrizes inertes contendo poros para promover a proliferação e o crescimento celular.
Organoides e esferoides também podem se desenvolver sem a presença de um andaime de suporte, confiando nas células para se auto-montar em aglomerados. Isso depende de diferentes técnicas, como o uso de materiais não adesivos para inibir a fixação celular, a tensão superficial e a força gravitacional (por exemplo, técnicas de queda suspensa) ou a rotação circular constante dos vasos (por exemplo, cultura do rotador). Em todos os casos, essas técnicas facilitam as interações célula-célula e célula-matriz para superar as limitações da cultura tradicional de células monocamadas1. Os termos "organoides" e "esferoides" foram usados de forma intercambiável no passado, mas existem diferenças fundamentais entre esses dois modelos de cultura de células 3D. Os organoides são aglomerados celulares 3D in vitro derivados de células-tronco pluripotentes ou células-tronco específicas de tecidos, nos quais as células se auto-organizam espontaneamente em progenitores e tipos celulares diferenciados e que recapitulam pelo menos algumas funções do órgão de interesse2. Os esferoides compreendem uma gama mais ampla de estruturas 3D multicelulares formadas sob condições não aderentes e podem surgir de uma grande diversidade de tipos celulares, como linhagens celulares imortalizadas ou células primárias3. Assim, inerente às suas origens intrínsecas de células-tronco, os organoides têm uma maior propensão à auto-montagem, viabilidade e estabilidade do que os esferoides.
No entanto, em essência, esses dois modelos são estruturas 3D compostas de múltiplas células, e as técnicas desenvolvidas para estudá-los são, portanto, muito semelhantes. Por exemplo, abordagens de imagem poderosas no nível de resolução de célula única são necessárias para sondar a complexidade celular de organoides e esferoides. Aqui, resumindo a experiência deste grupo e a de líderes no campo dos organoides4, este artigo descreve procedimentos detalhados para realizar colorações bidimensionais (2D) e 3D de montagem completa, imagens e análises da composição celular e subcelular e organização espacial de organoides e esferoides variando de 100 μm a vários milímetros. De fato, este procedimento apresenta dois tipos diferentes e complementares de coloração e aquisição de imagens para analisar uma grande variedade de tamanhos e tipos de modelos de cultura de células 3D in vitro. O uso de um (análise 3D de montagem inteira) ou outro (análise de seção 2D) dependerá do modelo estudado e das respostas buscadas. A análise 3D de montagem completa por microscopia confocal pode, por exemplo, ser aplicada para visualizar células em cultura 3D de até 200 μm de profundidade, independentemente do tamanho total da estrutura 3D, enquanto a análise de seções 2D fornece insights sobre amostras de qualquer tamanho, embora no nível 2D. Este procedimento tem sido aplicado com sucesso em uma variedade de organoides4,5 e esferoides derivados de células humanas e murinas, provenientes de diferentes camadas germinativas embrionárias. A visão geral do procedimento é mostrada na Figura 1. Os principais estágios, as relações entre eles, os passos decisivos e o tempo esperado são indicados.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig01.jpg"> Figura 1: Visão geral esquemática do procedimento. Os modelos de cultura de células 3D in vitro são coletados e fixados, em seguida, preparados para coloração de montagem inteira 3D (opção a) ou incorporados em parafina para seccionamento e coloração 2D (opção b). Para experimentos de coloração 3D de montagem completa, as estruturas 3D fixas são imunomarcadas após a etapa de fixação. Uma etapa opcional de limpeza óptica pode ser realizada para melhorar a qualidade da imagem e a profundidade da microscopia óptica, reduzindo o espalhamento da luz durante o processamento da imagem. As imagens são capturadas em um microscópio confocal invertido ou em um sistema confocal de alto conteúdo e analisadas usando o software apropriado. Para a incorporação de parafina, as estruturas 3D são processadas diretamente (opção b.1 para grandes estruturas ≥ 400 μm) ou incluídas em um gel (b.2; pequenas estruturas ≤ 400 μm) para desidratação e incorporação de parafina. Os blocos de parafina são então cortados e corados (coloração histológica ou imunoquímica). As imagens de seções 2D são obtidas em um scanner de lâmina digital ou um microscópio vertical e analisadas em uma plataforma de análise de imagens usando análise quantitativa digital rápida. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig01large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy pad Q Path blue</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes macrostar III Blc couv. Char. x1500</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassette microtwin white</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical hood</td>
			<td>Erlab</td>
			<td>FI82 5585-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips 1000 &#181;L</td>
			<td>Star lab Tip-One</td>
			<td>S1122-1730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Pyramid innovation</td>
			<td>R35002-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottom glass tubes with PTFE lined 2 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11784259</td>
			<td>Excellent&#160; for environmental&#160;&#160;&#160; samples,&#160;&#160;&#160; pharmaceuticals and diagnostic reagents. PTFE is designed for the ultimate in product safety. PTFE provides totally inert inner seal and surface facing the sample or product.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish plate 35 mm</td>
			<td>Ibedi</td>
			<td>2018003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal agitation</td>
			<td>N-BIOTEK</td>
			<td>NB-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator prewarmed to 65 &#176;C</td>
			<td>Memmert Incubator</td>
			<td>LAB129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inox molds 15x15</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-1918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides Matsunami TOMO-11/90</td>
			<td>Roche diagnostics</td>
			<td>8082286001</td>
			<td>these slides are used for a better adhesion of sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>HM340E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panoramic scan II</td>
			<td>3dhistech</td>
			<td>2397612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin embedding equipment</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette Pasteur 2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Path flacon 150mL cape blanc x250</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-1308</td>
			<td>Good for environmental&#160;&#160;&#160; samples,&#160;&#160;&#160; pharmaceuticals and diagnostic reagents. Polypropylene (PP) are rigid,&#160; solid, provide excellent&#160; stress&#160; crack&#160; and&#160; impact&#160; resistance and have a&#160; good oil and alcohol barrier and chemical resistance. PE-lined cap is stress crack resistant and offers&#160; excellent&#160; sealing&#160; characteristics.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Set of micropipettors&#160; (p200, p1000)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11877351 (20-200) 11887351(p1000)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPERA PHENIX</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>HH14000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP5 inverted confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LSM780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue cassette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-0228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiomager microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SIP 60549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoblock (kit)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10066588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57648266</td>
			<td>CAUTION: toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin aqueous 1%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT110316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83804.360</td>
			<td>CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.365</td>
			<td>CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin 4%</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>F/40877-36</td>
			<td>CAUTION: Formalin contains formaldehyde which is hazardous. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fructose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gill hematoxylin type II</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>F/CP813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td>CAUTION: Suspected of causing genetic defects.&#160; Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Wax tek III</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS) 1 X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Buffered Saline (TBS) 10X</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>F/00801</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8532</td>
			<td>CAUTION: Triton X&#173;100 is hazardous. Avoid contact with skin and eyes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>534056</td>
			<td>CAUTION: Xylene is toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Clearing solution</td>
			<td>Glycerol-Fructose clearing solution is 60% (vol/w) glycerol and 2.5 M fructose. To prepare 10 mL of this solution, mix 6 mL of glycerol and 4.5 g of fructose. Complete to 10 mL with dH2O. Use a magnetic stirrer overnight. Refractive index = 1.4688 at room temperature (RT: 19&#8211;23 &#176;C). Store at 4 &#176;C in dark for up to 1 month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">PBS-BSA 0,1% solution</td>
			<td>To prepare 0,1% (vol/wt) PBS-BSA 0,1% solution, dissolve 500 mg of BSA in 50 mL of PBS-1X (store at 4&#176;C for up to 2 weeks). And dilute 1mL of this solution into 9mL of PBS-1X. This solution can be used to precoat the tip and centrifugation tube.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Permeabilisation-blocking solution (PB solution)</td>
			<td>The PBSDT blocking solution is PBS-1X supplemented with 0.1% &#8211; 1% Tritonx-100 (depending on the protein localization membrane/nucleus), 1% DMSO, 1% BSA and 1% donkey serum (or from the animal in which the secondary antibodies were raised). This solution can be stored at 4&#176;C for up to 1 month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">PB:PBS-1X &#160;(1:10) solution</td>
			<td>PB:PBS-1X &#160;(1:10) solution is a 10 time diluted PB solution. To prepare 10 mL of this solution dilute 1 mL of PB solution in 9 mL of PBS-1X.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halo software</td>
			<td>Indicalabs</td>
			<td>NM 87114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harmony software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>HH17000010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

staining and high-resolution imaging of three-dimensional organoid and spheroid models

Modelos de cultura celular tridimensionais (3D) in vitro, como organoides e esferoides, são ferramentas valiosas para muitas aplicações, incluindo desenvolvimento e modelagem de doenças, descoberta de medicamentos e medicina regenerativa. Para explorar plenamente esses modelos, é crucial estudá-los nos níveis celular e subcelular. No entanto, caracterizar esses modelos de cultura de células 3D in vitro pode ser tecnicamente desafiador e requer conhecimentos específicos para realizar análises eficazes. Aqui, este artigo fornece protocolos detalhados, robustos e complementares para realizar imagens de coloração e resolução subcelular de modelos de cultura de células 3D fixas in vitro que variam de 100 μm a vários milímetros. Esses protocolos são aplicáveis a uma ampla variedade de organoides e esferoides que diferem em suas condições de célula de origem, morfologia e cultura. Desde a colheita da estrutura 3D até a análise da imagem, esses protocolos podem ser concluídos dentro de 4 a 5 dias. Resumidamente, as estruturas 3D são coletadas, fixadas e podem então ser processadas por meio de incorporação de parafina e coloração histológica/imuno-histoquímica, ou diretamente imunomarcadas e preparadas para limpeza óptica e reconstrução 3D (profundidade de 200 μm) por microscopia confocal.

Este protocolo fornece uma visão geral das etapas críticas para a coloração 2D e 3D de montagem completa, bem como análises de imagem e quantitativas de modelos de cultura de células 3D (Figura 3 e Figura 4). É aplicável a uma ampla gama de modelos de cultura de células 3D - de esferoides a organoides de diferentes espécies hospedeiras ou tecidos - e permite a aquisição de informações precisas e quantitativas sobre arquitetura, organização celular e interações em níveis celulares e subcelulares (Figura 3 e Figura 4). Os laboratórios podem precisar otimizar as técnicas histológicas e imuno-histoquímicas 2D e as concentrações de anticorpos de acordo com suas próprias necessidades.
Ambos os métodos produzem informações biológicas valiosas. A coloração 3D de montagem completa e a microscopia confocal fornecem informações visuais sobre a composição celular e a posição espacial com um campo de profundidade de até 200 μm (Figura 3B). No entanto, o seccionamento 2D é conveniente para estruturas 3D maiores revelarem características morfológicas celulares detalhadas em toda a seção de estruturas 3D que, de outra forma, podem ser difíceis de observar in situ devido ao espalhamento de luz que compromete a resolução em amostras maiores. Além disso, ambas as técnicas podem fornecer dados quantitativos. De fato, a resolução obtida permite a aplicação de algoritmos de segmentação celular e subcelular para a quantificação do número de células e a detecção da presença de vários marcadores celulares em diferentes subtipos celulares (Figura 3F e Figura 4). Em resumo, as técnicas de imagem aqui descritas são reprodutíveis, simples e complementares e representam ferramentas valiosas para o estudo da heterogeneidade celular.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig03.jpg"> Figura 3: Resultados representativos para montagem inteira 3D, imagens e análises de seções ópticas 3D e 2D. (A) Imagens confocais de esferoides de glioma humano (h) de alto grau cultivadas por uma semana e marcadas com Hoechst (azul), Olig2 (amarelo) e Actin (vermelho) (20x objetiva de água). Para todas as imagens adquiridas, as configurações do microscópio foram estabelecidas usando um controle positivo (acima) e, em seguida, o controle negativo foi visualizado usando configurações idênticas para controlar a falta de fluorescência na ausência de anticorpos primários (abaixo). (B) Representação ortogonal 3D de toda a montagem da coloração Ki67 realizada em (h) glioma esferoide de alto grau cultivado por uma semana (limpeza de glicerol-frutose; 20x objetiva de água, confocal). (C) Imagens confocais de (h) esferoide de glioma de alto grau cultivadas durante uma semana e marcadas com Hoechst (azul), Olig2 (amarelo) e Faloidina-488 (verde) (limpeza de glicerol-frutose; 20x objetivo de água). (D) Imagens confocais de esferoides humanos (h) rabdomiossarcoma (superior) e de células da crista neural do rato (m) (em baixo) cultivados durante uma semana e marcados com Hoechst (azul), Actina (vermelho) e Ki67 (verde), respetivamente (depuração de glicerol-frutose; 20x objetivo seco). (E) Imagens confocais de (h) esferoide de glioma de alto grau cultivadas durante uma semana e marcadas com Hoechst (azul) e Ki67 (verde) (limpeza de glicerol-frutose; 40x objetiva de água) (canto superior esquerdo). As imagens segmentadas no canal Hoechst e nas regiões nucleares Ki67-positivas (+) no canal verde foram geradas utilizando software de análise de alto teor (ver Figura 1 Suplementar e Tabela de materiais) (abaixo). A saída dada é a porcentagem de núcleos Ki67+ por estrutura 3D segmentada (canto superior direito). Barra de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig04.jpg"> Figura 4: Resultados representativos para imagens e análises de seções ópticas 2D. (A, D) Imagens de seção 2D de um modelo de célula 3D (esferoides de rabdomiossarcoma humano cultivados por um mês) obtidas com um scanner de lâmina digital e analisadas em uma plataforma para análise quantitativa digital rápida. (A) Coloração H&E e detecção de células de acordo com o seu tamanho. Barra de escala = 500 μm. (B) O histograma mostra a porcentagem de células < 100 μm 2 e > 100 μm2 detectadas usando software para análise quantitativa digital rápida (esquerda: Halo) ou contagem manual (direita: MC). (C) Coloração Ki67 e detecção de células de acordo com a intensidade do seu sinal de 3,3'-diaminobenzidina (DAB). Negativo (azul), fracamente positivo (amarelo), positivo (vermelho). Barra de escala = 500 μm. (D) O histograma mostra a porcentagem de células Ki67-negativas, fracamente positivas e positivas. Abreviaturas: H&E = hematoxilina e eosina; MC = contagem manual. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig04large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura 1 Suplementar: Visão geral das etapas no software de análise de imagens. As análises são baseadas na associação de blocos de construção. Cada bloco de construção corresponde a uma função - segmentação, cálculo, associação, definição de saída - e oferece vários algoritmos e seleções de variáveis para corresponder à amostra biológica que está sendo visualizada. O software fornece vários protocolos de análise RMS (Ready Made Solution) que podem ser facilmente usados e modificados. Os protocolos integrados de análise de imagem podem ser salvos, aplicados a diferentes conjuntos de dados e compartilhados entre usuários. Resumidamente, o protocolo de análise implica segmentação sequencial de objetos: esferoide, núcleos e, finalmente, bolsas Ki67 (A488). Em seguida, a intensidade média dos bolsões Ki67 é calculada para discriminar ainda mais os eventos positivos. Finalmente, os núcleos que abrangem bolsas positivas Ki67 são selecionados positivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/Suppl1_Harmony%20analysis_Revised.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura 2 Suplementar: Visão geral das etapas do procedimento do software de análise quantitativa. Passo 1. Carregue os arquivos usando a guia Estudos. Os arquivos serão abertos na seção Ações de imagem. Passo 2. Abra a guia Anotações e clique em Ações de camada para criar uma nova camada ao redor da estrutura usando a ferramenta de círculo da barra de ferramentas. Para estruturas não circulares, a ferramenta caneta pode ser usada. Passo 3. A barra de ferramentas pode ser usada para projetar anotações e visualizar a quantificação com a <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62280/62280eq01.jpg">ferramenta. Passo 4. Abra a guia Análise e selecione as melhores condições para a análise da amostra (vários ensaios podem ser necessários aqui). Passo 4.1. Use a seção Seleção de manchas para configurar a condição de coloração. No caso de várias manchas, elas podem ser adicionadas e renomeadas, e a cor virtual pode ser modificada. A detecção de localização pode ser especificada - coloração nuclear ou citoplasmática. Passo 4.2. Use a seção Detecção de Célula para configurar a detecção de célula. Esta seção será a mais importante para a análise. A seção Limiar de Contraste Nuclear permitirá a detecção de todos os núcleos. Atenção deve ser dada no caso de haver vários tamanhos de população, o software pode detectar várias células em vez de uma grande única. As seções de tamanho nuclear e agressividade da segmentação nuclear podem ser usadas para quantificar as faixas populacionais de tamanho celular. Passo 5. Descrição sobre como executar a análise de amostra. Siga as etapas mostradas na figura. A seção Camada de Anotação executará a configuração somente neste slide. A quantificação pode ser visualizada usando a <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62280/62280eq01.jpg">ferramenta. Repita os passos 4.1-5 até que a quantificação adequada seja alcançada. Passos 6-6.1. Essas etapas permitem que você desenhe uma figura usando o software. Passo 7. Gráficos de quantificação obtidos via software podem ser salvos. Passo 8. Os dados podem ser exportados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/Suppl2_Halo%20Images_revised.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

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Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

Aqui, fornecemos protocolos detalhados, robustos e complementares para realizar imagens de coloração e resolução subcelular de modelos de cultura celular tridimensional fixa que variam de 100 μm a vários milímetros, permitindo assim a visualização de sua morfologia, composição do tipo celular e interações.

Coloração e Imagem de Alta Resolução de Modelos Organoides e Esferoides Tridimensionais

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...

Caracterizar o modelo 3D in vitro em resolução celular e subcelular é crucial para a exploração completa, mas pode ser um desafio. Portanto, fornecemos protocolo complementar para a coloração e imagens de resolução subcelular de modelos fixos 3D in vitro que variam de 100 micrômetros a vários milímetros. As estruturas 3D são radiais e devem ser cuidadosamente manipuladas.Antes de pipetar, verifique a localização de suas estruturas 3D dentro do tubo para evitar qualquer aspiração. Como adaptamos técnicas clássicas para a incorporação de pequenas estruturas, como organoides ou esferoides, as instruções visualizadas podem ajudar os usuários de primeira viagem a executar a tarefa com mais facilidade. Demonstrando o procedimento comigo estará Laura Francols, uma técnica de laboratório da Plataforma de Pesquisa em Patologia.Para preparar amostras para coloração de montagem inteira 3D, use uma ponta de pipeta de um mililitro pré-codificada com BSA para adicionar uma suspensão de estrutura 3D de um mililitro a um tubo de 500 microlitros de PBS. Quando as estruturas 3D tiverem se acomodado no fundo do tubo, substitua cuidadosamente o PBS por 500 microlitros de solução de bloqueio de permeabilização por uma incubação de uma hora à temperatura ambiente com agitação horizontal suave a 30 a 50 rotações por minuto. No final da incubação, permita que as estruturas 3D sedimentem novamente antes de lavar cuidadosamente as estruturas 3D duas vezes em um mililitro de 0,1% PBS suplementado com BSA por três minutos por lavagem.Após a última lavagem, rotule as estruturas 3D com 250 microlitros de anticorpo primário em PBS por dois a três dias com agitação horizontal suave a quatro graus Celsius. No final da incubação, lavar a amostra com cinco lavagens de três minutos e duas lavagens de 15 minutos em um mililitro de 0,1% PBS BSA por lavagem. Após a última lavagem, rotule as estruturas 3D com 250 microlitros do anticorpo secundário apropriado em PBS por 24 horas a quatro graus Celsius com agitação horizontal suave protegida da luz.No dia seguinte, rotule as estruturas 3D com 250 microlitros da concentração adequada de Hoechst 3342 para uma incubação de duas horas a quatro graus Celsius com uma agitação horizontal suave. No final da incubação, lave as estruturas 3D cinco vezes por três minutos e duas vezes por 15 minutos em um mililitro de PBS por lavagem, conforme demonstrado. Após a última lavagem, transfira as estruturas 3D para uma microplaca de poliestireno preto de 96 poços e adicione suavemente 200 microlitros de solução de limpeza nas estruturas, evitando bolhas.Em seguida, coloque a placa coberta com papel alumínio a quatro graus Celsius por pelo menos 48 horas. Para incorporar grandes modelos de cultura de células 3D, use uma ponta de pipeta de um mililitro revestida de BSA para transferir cuidadosamente as estruturas 3D para um tubo de vidro de fundo plano com uma tampa de garrafa revestida de PTFE. Após a assentação das estruturas, substitua cuidadosamente o PBS por etanol a 70% por uma incubação de 30 minutos à temperatura ambiente.No final da incubação, substitua o etanol a 70% por um mililitro de solução de eosina Y pronta para uso. Mexa o tubo e manche as estruturas por pelo menos 30 minutos. No final da incubação, desidratar as estruturas com três lavagens sucessivas de 30 minutos em um mililitro de etanol a 100% por lavagem.Após a última desidratação, limpe as estruturas 3D com três lavagens sucessivas de 30 minutos em um mililitro de xileno por lavagem sob um exaustor químico. Após a última imersão em xileno, coloque um pedaço de almofada de biópsia embebida em xileno em um compartimento de um de tecido microgêmeo branco e use uma pipeta Pasteur de plástico de dois mililitros revestida de BSA para transferir as estruturas 3D para a almofada. Cubra as estruturas 3D com outra almofada de biópsia embebida em xileno para manter as estruturas 3D no lugar e fechar o.Quando todas as amostras tiverem sido transferidas, coloque as em um banho de parafina de 65 graus Celsius por 30 minutos antes de colocar as em um banho fresco de parafina de 65 graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, adicione parafina líquida a um molde de incorporação aquecido a 65 graus Celsius por amostra e coloque uma amostra embutida em parafina em cada molde. Agite suavemente os moldes até que todas as estruturas 3D caiam para o fundo e use pinças finas aquecidas a 65 graus Celsius para posicionar as estruturas 3D no centro de cada molde.Resfrie o molde até que a parafina forme uma fina camada sólida, prendendo a estrutura 3D no lugar. Coloque um de tecido e adicione parafina quente sobre o molde. Remova o molde quando a parafina tiver se solidificado completamente.Para incorporar pequenos modelos de cultura de células 3D, lave suavemente as estruturas 3D três vezes em um mililitro de TBS por lavagem. Após a última lavagem, remova o máximo de TBS possível sem tocar nas estruturas e adicione duas gotas de reagente duas de um kit comercial de incorporação de parafina. Misture suavemente batendo e adicione duas gotas de reagente uma com batida até que o gel se solidifique.Use pinças finas para transferir o gel do poço do pré-montado do kit e desidrate a amostra embutida em gel com incubações ascendentes de etanol e xileno ascendentes de 30 minutos em um exaustor, conforme indicado. Após a última imersão em xileno, coloque o em um banho de parafina de 65 graus Celsius durante a noite antes de usar pinça fina para transferir a amostra embutida de parafina para o centro de um molde de incorporação aquecido de parafina líquida carregada a 65 graus Celsius. Em seguida, proteja a estrutura 3D com mais uma camada de parafina, conforme demonstrado para os grandes modelos de cultura de células 3D.A coloração tridimensional de montagem inteira e a microscopia confocal fornecem informações visuais sobre a composição celular e a posição espacial dos modelos de cultura 3D para um campo de profundidade de até 200 mícrons. A alta resolução que pode ser obtida para estruturas 3D usando este protocolo permite a aplicação de algoritmos de segmentação celular e subcelular para quantificação do número de células e a detecção de vários marcadores celulares dentro de diferentes subtipos celulares. A análise de montagens inteiras 3D pode ser aplicada a células visualizadas de até 200 mícrons de profundidade, independentemente de todas as estruturas.Pelo contrário, a análise de seção 2D pode fornecer insights sobre células de qualquer tamanho.

Research

JoVE Journal

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High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

De alta resolução de Medição do Comportamento Odor-Driven em larvas de Drosophila

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Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

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While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

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Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

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High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

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Rato Fetal Whole Intestino Sistema de Cultura para<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Manipulação de vias de sinalização e tridimensional Imagens ao vivo de Desenvolvimento Villus

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

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De alta resolução de imagem Time-lapse e análise automatizada de microtúbulos Dynamics em Viver umbilical humano Células Endoteliais da Veia

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...