Name: staining and high-resolution imaging of three-dimensional organoid and spheroid models
Uploaded: 2021-03-27T14:00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models at JoVE.com

Эта работа была поддержана премией St Baldrick's Robert J. Arceci Innovation Award #604303.

<ol>
	<li>Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+system+methods+and+applications+for+mesenchymal+stem+cells.">Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells.</a> Cells. 8 (12), 1-13 (2019).</li><li>Bartfeld, S., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+organoids+and+their+application+for+medical+research+and+patient+treatment.">Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment.</a> Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).</li><li>Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+multicellular+spheroids+formation.">Advances in multicellular spheroids formation.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 14 (127), (2017).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation.">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1724-1743 (2016).</li><li>Rezanejad, H., Lock, J. H., Sullivan, B. A., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+pancreatic+ductal+organoids+and+whole-mount+immunostaining+of+intact+organoids.">Generation of pancreatic ductal organoids and whole-mount immunostaining of intact organoids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 82 (2019).</li><li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+systems+and+their+applications+in+drug+discovery+and+cell-based+biosensors.">Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).</li><li>McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+and+assessment+of+human+primary+prostate+organoid+culture.">Handling and assessment of human primary prostate organoid culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e59051 (2019).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li><li>Lazzari, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+fluorescence+microscopy+versus+confocal+microscopy:+in+quest+of+a+suitable+tool+to+assess+drug+and+nanomedicine+penetration+into+multicellular+tumor+spheroids.">Light sheet fluorescence microscopy versus confocal microscopy: in quest of a suitable tool to assess drug and nanomedicine penetration into multicellular tumor spheroids.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 142, 195-203 (2019).</li><li>Gabriel, J., Brennan, D., Elisseeff, J. H., Beachley, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+embedding/sectioning+for+parallel+analysis+of+3D+cell+spheroids.">Microarray embedding/sectioning for parallel analysis of 3D cell spheroids.</a> Scientific Reports. 9, 16287 (2019).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

Клеточная культура является незаменимым инструментом для выявления фундаментальных биологических механизмов, участвующих в развитии тканей и органов, функции, регенерации и разрушении, а также заболеваниях. Хотя монослойная 2D-клеточная культура преобладала, недавние исследования сместились в сторону культур, генерирующих 3D-структуры, более отражающие клеточные реакции in vivo, в частности, благодаря дополнительной пространственной организации и контактам между клетками, которые влияют на экспрессию генов и клеточное поведение и, таким образом, могут обеспечить более прогностические данные7. Тем не менее, многие проблемы остаются, в том числе потребность в удобных для пользователя методах окрашивания и визуализации для детальной микроскопической визуализации и оценки сложных 3D-структур на клеточном и субклеточном уровнях. В этом контексте были предоставлены подробные, надежные и взаимодополняющие протоколы для выполнения окрашивания и визуализации клеточного и субклеточного разрешения фиксированных моделей 3D-культур клеток in vitro размером от 100 мкм до нескольких миллиметров.
Эта процедура представляет две различные стратегии для работы с большим разнообразием размеров и типов моделей 3D-культур клеток in vitro. Выбор одного (3D-анализ всего монтажа) или другого (2D-анализ секционирования) будет зависеть от используемой модели и исследуемой проблемы. 3D-анализ цельного крепления методом конфокальной микроскопии позволяет визуализировать ячейки с полем глубиной до 200 мкм, независимо от общего размера 3D-структуры, тогда как 2D-секционирование применимо к образцам любого размера, но визуализация остается 2D-размерной. Ниже приведены некоторые рекомендации по устранению неполадок и технические соображения.
Потеря 3D-структур во время рабочего процесса является наиболее распространенным недостатком. Они могут оставаться прикрепленными к наконечникам и трубкам, поэтому предварительное покрытие наконечников и трубок с 0,1% раствором PBS-BSA является ключевым. Кроме того, крайне важно, чтобы 3D-структуры оседаляли между изменениями реагентов и выполняли все пипетки очень осторожно. Как упоминалось в процедуре, на всех этапах, если осаждение 3D-структуры слишком длинное, клетки могут быть аккуратно раскручены при 50 × g в течение 5 мин при RT. В зависимости от цели исследования, преимущества / недостатки такой стадии вращения следует рассматривать, поскольку центрифугирование может нарушить форму 3D-структур. Кроме того, следует позаботиться о сохранении этой морфологии на этапе фиксации, потому что кистозные органоиды имеют тенденцию к коллапсу. Крепление конструкций размером до 400 мкм должно предотвращать структурные изменения.
Для оптимальной иммуномаркировки восстановление органоидов из их 3D-матриц является решающим шагом. 3D-матрица может препятствовать адекватному проникновению антител или приводить к высокому фоновому окрашиванию из-за неспецифического связывания с матрицей. Удаление ECM может изменить морфологию внешних сегментов органоидов (особенно в случае небольших клеточных выступов, простирающихся от изученных 3D-структур) и частично затруднить анализ. Для таких 3D-структур матрица может сохраняться на протяжении всей процедуры; однако условия культивирования должны быть тщательно адаптированы для выращивания клеток в минимальном количестве матрицы, чтобы предотвратить недостаточное проникновение растворов и антител и избежать последовательных этапов промывки, направленных на снижение чрезмерного фонового шума 6,8.
Стадия оптической очистки, описанная в этом протоколе в 3D-секции окрашивания всего крепления, уместна для визуализации 3D-структур глубиной до 150-200 мкм вместо 50-80 мкм без очистки. По сравнению с другими методами очистки, которые часто требуют нескольких недель и с использованием токсичных очищающих агентов, в этом протоколе 4,9 использовался ранее опубликованный быстрый и безопасный этап очистки. Кроме того, этот этап очистки является обратимым, и новые антитела могут быть добавлены к первоначальному окрашиванию без потери разрешения или яркости4. Тем не менее, в зависимости от изученной модели 3D-культуры клеток, глубина 150-200 мкм может быть недостаточной для информативного изображения 3D-структуры, и этот протокол очистки может вызвать изменения в общей морфологии сферических, монослойных органоидов с большими люменами4. Пользователи должны тщательно спроектировать свой эксперимент и, при необходимости, оптимизировать время стадии пермеабилизации /блокировки (чтобы обеспечить проникновение антител и раствора), стадии очистки (для проникновения глубже 200 мкм образцы должны быть полностью очищены) и получения изображения. Двумя наиболее распространенными технологиями, доступными в основных помещениях, будут световой лист и конфокальная микроскопия. Пользователям нужно будет тщательно выбрать технологию, основанную на размере их 3D-структур и их биологическом вопросе10. Однако, по сравнению с конфокальной микроскопией, разрешение световой листовой микроскопии, полученное для таких глубоких структур, остается неоптимальным для получения субклеточного разрешения.
Здесь сообщается о подробном и надежном процессе, посвященном встраиванию парафина отдельных образцов. Интересно, что Gabriel et al. недавно разработали протокол встраивания 3D-клеточных культур в парафин с повышенной пропускной способностью. Они использовали форму полидиметилсилоксана (PDMS) для ограничения 96 3D-структур в микрочипе в одном блоке, обеспечивая новые перспективы для исследований 3D-моделей опухолей, охватывающих больше групп, временных точек, условий лечения и реплицирует11. Тем не менее, этот метод требует обширных навыков и оборудования, особенно для изготовления предварительного отлива, используемого для создания пресс-форм PDMS.
Таким образом, в этой статье описываются два различных, взаимодополняющих и адаптируемых подхода, позволяющих получать точную и количественную информацию об архитектурном и клеточном составе 3D-клеточных моделей. Оба параметра имеют решающее значение для изучения биологических процессов, таких как внутриопухолевая клеточная гетерогенность и ее роль в устойчивости к лечению.

За последние десятилетия достижения в биологии стволовых клеток и технологиях 3D-культур in vitro ознаменовали революцию в биологии и медицине. Клеточные модели более высокой сложности в 3D стали очень популярными, поскольку они позволяют клеткам расти и взаимодействовать с окружающей внеклеточной структурой, тесно переименовывая аспекты живых тканей, включая их архитектуру, организацию и взаимодействия клеток или даже диффузионные характеристики. Таким образом, 3D-модели клеточных культур могут дать уникальную информацию о поведении клеток в развивающихся или больных тканях in vitro. Органоиды и сфероиды являются многоклеточными 3D-структурами, от нескольких микрометров до миллиметров, и являются наиболее заметными 3D-структурами in vitro. Оба могут культивироваться в поддерживающем каркасе, включая (i) гидрогели, полученные от животных (экстракт базальной мембраны, коллаген), растений (альгинат/агароза) или синтезированные из химических веществ, или (ii) инертные матрицы, содержащие поры для содействия пролиферации и росту клеток.
Органоиды и сфероиды также могут развиваться без присутствия поддерживающего каркаса, полагаясь на клетки для самособирания в кластеры. Это опирается на различные методы, такие как использование неадгезивных материалов для ингибирования прикрепления клеток, поверхностного натяжения и гравитационной силы (например, методы подвешивания капель) или постоянное круговое вращение сосудов (например, культура спиннера). Во всех случаях эти методы облегчают взаимодействие клетка-клетка и клетка-матрица для преодоления ограничений традиционной однослойной клеточной культуры1. Термины «органоиды» и «сфероиды» использовались взаимозаменяемо в прошлом, но между этими двумя моделями 3D-культур клеток есть ключевые различия. Органоиды представляют собой in vitro 3D клеточные кластеры, полученные из плюрипотентных стволовых клеток или тканеспецифических стволовых клеток, в которых клетки спонтанно самоорганизуются в предшественников и дифференцированные типы клеток и которые повторяют, по меньшей мере, некоторые функции интересующего органа2. Сфероиды содержат более широкий спектр многоклеточных 3D-структур, сформированных в условиях несоблюдения, и могут возникать из большого разнообразия типов клеток, таких как увековеченные клеточные линии или первичные клетки3. Следовательно, присущие их внутреннему происхождению стволовых клеток, органоиды имеют более высокую склонность к самосборке, жизнеспособности и стабильности, чем сфероиды.
Тем не менее, по сути, эти две модели являются 3D-структурами, состоящими из нескольких клеток, и методы, разработанные для их изучения, таким образом, очень похожи. Например, мощные подходы к визуализации на уровне одноклеточного разрешения необходимы для исследования клеточной сложности как органоидов, так и сфероидов. Здесь, обобщая опыт этой группы и лидеров в области органоидов4, в этой статье описываются подробные процедуры для выполнения двумерного (2D) и 3D-окрашивания, визуализации и анализа клеточного и субклеточного состава и пространственной организации органоидов и сфероидов в диапазоне от 100 мкм до нескольких миллиметров. Действительно, эта процедура представляет два различных и взаимодополняющих типа окрашивания и получения изображений для анализа большого разнообразия размеров и типов моделей 3D-культур клеток in vitro. Использование одного (3D-анализ всего монтажа) или другого (2D-анализ секций) будет зависеть от изученной модели и искомых ответов. 3D-анализ с помощью конфокальной микроскопии может, например, применяться для визуализации клеток в 3D-культуре глубиной до 200 мкм, независимо от общего размера 3D-структуры, тогда как анализ 2D-секций дает представление о образцах любого размера, хотя и на 2D-уровне. Эта процедура была успешно применена к различным органоидам 4,5 и сфероидам, полученным из клеток человека и мышей, происходящих из различных эмбриональных зародышевых слоев. Обзор процедуры показан на рисунке 1. Указаны основные этапы, взаимосвязи между ними, решительные шаги, ожидаемые сроки.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig01.jpg"> Рисунок 1: Схематический обзор процедуры. Модели 3D-культур клеток in vitro собираются и фиксируются, затем либо подготавливаются для 3D-окрашивания всего крепления (вариант a), либо встраиваются в парафин для 2D-секционирования и окрашивания (вариант b). Для экспериментов по окрашиванию цельного 3D-крепления фиксированные 3D-структуры иммуномепонируются после этапа фиксации. Дополнительный этап оптической очистки может быть выполнен для улучшения качества изображения и глубины оптической микроскопии за счет уменьшения рассеяния света во время обработки изображения. Изображения захватываются на инвертированный конфокальный микроскоп или конфокальную систему высокого содержания и анализируются с помощью соответствующего программного обеспечения. Для встраивания парафина 3D-структуры непосредственно обрабатывают (вариант b.1 для крупных структур ≥ 400 мкм) или включают в гель (b.2; небольшие структуры ≤ 400 мкм) для обезвоживания и встраивания парафина. Затем парафиновые блоки разрезают и окрашивают (гистологическое или иммунохимическое окрашивание). Изображения 2D-участков получаются на цифровом слайд-сканере или вертикальном микроскопе и анализируются на платформе анализа изображений с использованием быстрого цифрового количественного анализа. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy pad Q Path blue</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes macrostar III Blc couv. Char. x1500</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassette microtwin white</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical hood</td>
			<td>Erlab</td>
			<td>FI82 5585-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips 1000 &#181;L</td>
			<td>Star lab Tip-One</td>
			<td>S1122-1730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Pyramid innovation</td>
			<td>R35002-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottom glass tubes with PTFE lined 2 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11784259</td>
			<td>Excellent&#160; for environmental&#160;&#160;&#160; samples,&#160;&#160;&#160; pharmaceuticals and diagnostic reagents. PTFE is designed for the ultimate in product safety. PTFE provides totally inert inner seal and surface facing the sample or product.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish plate 35 mm</td>
			<td>Ibedi</td>
			<td>2018003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal agitation</td>
			<td>N-BIOTEK</td>
			<td>NB-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator prewarmed to 65 &#176;C</td>
			<td>Memmert Incubator</td>
			<td>LAB129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inox molds 15x15</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-1918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides Matsunami TOMO-11/90</td>
			<td>Roche diagnostics</td>
			<td>8082286001</td>
			<td>these slides are used for a better adhesion of sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>HM340E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panoramic scan II</td>
			<td>3dhistech</td>
			<td>2397612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin embedding equipment</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette Pasteur 2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Path flacon 150mL cape blanc x250</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-1308</td>
			<td>Good for environmental&#160;&#160;&#160; samples,&#160;&#160;&#160; pharmaceuticals and diagnostic reagents. Polypropylene (PP) are rigid,&#160; solid, provide excellent&#160; stress&#160; crack&#160; and&#160; impact&#160; resistance and have a&#160; good oil and alcohol barrier and chemical resistance. PE-lined cap is stress crack resistant and offers&#160; excellent&#160; sealing&#160; characteristics.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Set of micropipettors&#160; (p200, p1000)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11877351 (20-200) 11887351(p1000)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPERA PHENIX</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>HH14000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP5 inverted confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LSM780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue cassette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-0228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiomager microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SIP 60549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoblock (kit)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10066588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57648266</td>
			<td>CAUTION: toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin aqueous 1%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT110316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83804.360</td>
			<td>CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.365</td>
			<td>CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin 4%</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>F/40877-36</td>
			<td>CAUTION: Formalin contains formaldehyde which is hazardous. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fructose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gill hematoxylin type II</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>F/CP813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td>CAUTION: Suspected of causing genetic defects.&#160; Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Wax tek III</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS) 1 X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Buffered Saline (TBS) 10X</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>F/00801</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8532</td>
			<td>CAUTION: Triton X&#173;100 is hazardous. Avoid contact with skin and eyes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>534056</td>
			<td>CAUTION: Xylene is toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Clearing solution</td>
			<td>Glycerol-Fructose clearing solution is 60% (vol/w) glycerol and 2.5 M fructose. To prepare 10 mL of this solution, mix 6 mL of glycerol and 4.5 g of fructose. Complete to 10 mL with dH2O. Use a magnetic stirrer overnight. Refractive index = 1.4688 at room temperature (RT: 19&#8211;23 &#176;C). Store at 4 &#176;C in dark for up to 1 month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">PBS-BSA 0,1% solution</td>
			<td>To prepare 0,1% (vol/wt) PBS-BSA 0,1% solution, dissolve 500 mg of BSA in 50 mL of PBS-1X (store at 4&#176;C for up to 2 weeks). And dilute 1mL of this solution into 9mL of PBS-1X. This solution can be used to precoat the tip and centrifugation tube.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Permeabilisation-blocking solution (PB solution)</td>
			<td>The PBSDT blocking solution is PBS-1X supplemented with 0.1% &#8211; 1% Tritonx-100 (depending on the protein localization membrane/nucleus), 1% DMSO, 1% BSA and 1% donkey serum (or from the animal in which the secondary antibodies were raised). This solution can be stored at 4&#176;C for up to 1 month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">PB:PBS-1X &#160;(1:10) solution</td>
			<td>PB:PBS-1X &#160;(1:10) solution is a 10 time diluted PB solution. To prepare 10 mL of this solution dilute 1 mL of PB solution in 9 mL of PBS-1X.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halo software</td>
			<td>Indicalabs</td>
			<td>NM 87114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harmony software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>HH17000010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

staining and high-resolution imaging of three-dimensional organoid and spheroid models

Трехмерные (3D) модели клеточных культур in vitro, такие как органоиды и сфероиды, являются ценными инструментами для многих применений, включая разработку и моделирование заболеваний, открытие лекарств и регенеративную медицину. Чтобы в полной мере использовать эти модели, крайне важно изучить их на клеточном и субклеточном уровнях. Однако характеристика таких моделей 3D-культур клеток in vitro может быть технически сложной и требует специальных знаний для выполнения эффективного анализа. Здесь в этой статье представлены подробные, надежные и взаимодополняющие протоколы для выполнения окрашивания и визуализации субклеточного разрешения фиксированных моделей 3D-культур клеток in vitro в диапазоне от 100 мкм до нескольких миллиметров. Эти протоколы применимы к широкому спектру органоидов и сфероидов, которые различаются по своим клеткам происхождения, морфологии и условиям культивирования. От сбора 3D-структуры до анализа изображений, эти протоколы могут быть завершены в течение 4-5 дней. Вкратце, 3D-структуры собираются, фиксируются и затем могут быть обработаны либо путем встраивания парафина и гистологического / иммуногистохимического окрашивания, либо непосредственно иммуномаркированы и подготовлены к оптической очистке и 3D-реконструкции (глубина 200 мкм) с помощью конфокальной микроскопии.

Этот протокол предоставляет обзор критических этапов для 2D и 3D окрашивания цельным креплением, а также визуализацию и количественный анализ 3D-моделей клеточных культур (рисунок 3 и рисунок 4). Он применим к широкому спектру моделей 3D-клеточных культур - от сфероидов до органоидов из разных видов или тканей-хозяев - и позволяет получать точную и количественную информацию об архитектуре, организации клеток и взаимодействиях на клеточном и субклеточном уровнях (рисунок 3 и рисунок 4). Лабораториям может потребоваться оптимизировать 2D гистологические и иммуногистохимические методы и концентрации антител в соответствии с их собственными потребностями.
Оба метода дают ценную биологическую информацию. 3D-окрашивание цельного крепления и конфокальная микроскопия предоставляют визуальную информацию о клеточном составе и пространственном положении с полем глубиной до 200 мкм (рисунок 3B). Тем не менее, 2D-секционирование удобно для более крупных 3D-структур, чтобы выявить подробные клеточные морфологические признаки во всем разделе 3D-структур, которые в противном случае может быть сложно наблюдать на месте из-за рассеяния света, которое ставит под угрозу разрешение в более крупных образцах. Более того, оба метода могут предоставить количественные данные. Действительно, полученное разрешение позволяет применять алгоритмы клеточной и субклеточной сегментации для количественной оценки количества клеток и обнаружения наличия различных клеточных маркеров в разных клеточных подтипах (рис. 3F и фиг.4). Таким образом, методы визуализации, описанные здесь, являются воспроизводимыми, простыми и взаимодополняющими и представляют собой ценные инструменты для изучения клеточной гетерогенности.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig03.jpg"> Рисунок 3: Репрезентативные результаты для 3D-крепления, визуализации и анализа 3D и 2D оптических секций. (A) Конфокальные изображения человеческого (h) полноценного сфероида глиомы, культивируемого в течение недели и помеченного Hoechst (синий), Olig2 (желтый) и Actin (красный) (20x водный объектив). Для всех полученных изображений настройки микроскопа устанавливались с помощью положительного контроля (сверху), а затем отрицательный контроль визуализировали с использованием идентичных настроек для контроля отсутствия флуоресценции при отсутствии первичного антитела (снизу). (B) Ортогональное 3D-изображение окрашивания Ki67, выполненное в (h) полноценном сфероиде глиомы, культивируемом в течение недели (очистка от глицерин-фруктозы; 20x водный объектив, конфокальный). (C) Конфокальные изображения (h) полноценного сфероида глиомы, культивируемого в течение недели и помеченного Hoechst (синий), Olig2 (желтый) и Phalloidine-488 (зеленый) (очистка глицерин-фруктозы; 20x водный объектив). (D) Конфокальные изображения сфероидов человеческих (h) рабдомиосарком (вверху) и мышиных (m) клеток нервного гребня (снизу), культивируемых в течение недели и помеченных Hoechst (синий), Actin (красный) и Ki67 (зеленый), соответственно (очистка глицерин-фруктозы; 20x сухой объектив). (E) Конфокальные изображения (h) полноценного сфероида глиомы, культивируемого в течение недели и помеченного Hoechst (синий) и Ki67 (зеленый) (очистка глицерин-фруктозы; 40x водный объектив) (вверху слева). Сегментированные изображения на канале Hoechst и Ki67-положительных (+) ядерных областях на зеленом канале были сгенерированы с использованием программного обеспечения для анализа высокого содержания (см. Дополнительный рисунок 1 и Таблицу материалов) (внизу). На выходе указан процент ядер Ki67+ на сегментированную 3D-структуру (вверху справа). Шкала = 100 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig04.jpg"> Рисунок 4: Репрезентативные результаты для визуализации и анализа 2D оптических сечений. (A, D) Изображения 2D-секций 3D-модели клеток (сфероиды рабдомиосаркомы человека, культивируемые в течение месяца), полученные с помощью цифрового слайд-сканера и проанализированные на платформе для быстрого цифрового количественного анализа. (A) Окрашивание H&E и обнаружение клеток в соответствии с их размером. Шкала = 500 мкм. (B) Гистограмма показывает процент клеток < 100мкм2 и > 100мкм2 , обнаруженных с помощью программного обеспечения для быстрого цифрового количественного анализа (слева: Halo) или ручного подсчета (справа: MC). (C) Окрашивание Ki67 и обнаружение клеток в соответствии с интенсивностью их сигнала 3,3'-диаминобензидина (DAB). Отрицательный (синий), слабоположительный (желтый), положительный (красный). Шкала = 500 мкм. (D) Гистограмма показывает процент Ki67-отрицательных, слабоположительных и положительных клеток. Сокращения: H&E = гематоксилин и эозин; MC = ручной подсчет. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Дополнительный рисунок 1: Обзор шагов в программном обеспечении для анализа изображений. Анализ основан на ассоциации строительных блоков. Каждый строительный блок, соответствующий функции - сегментации, вычисления, ассоциации, определения вывода - и предлагает несколько алгоритмов и выбор переменных для соответствия визуализируемому биологическому образцу. Программное обеспечение предоставляет несколько протоколов анализа RMS (Ready Made Solution), которые можно легко использовать и изменять. Интегрированные протоколы анализа изображений могут сохраняться, применяться к различным наборам данных и совместно использоваться пользователями. Вкратце, протокол анализа подразумевает последовательную сегментацию объектов: сфероид, ядра и, наконец, карманы Ki67 (A488). Затем подсчитывается средняя интенсивность карманов Ki67 для дальнейшей дискриминации положительных событий. Наконец, положительно отбираются ядра, охватывающие положительные карманы Ki67. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/Suppl1_Harmony%20analysis_Revised.pdf" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>
Дополнительный рисунок 2: Обзор этапов процедуры программного обеспечения для количественного анализа. Шаг 1. Загрузите файлы с помощью вкладки Исследования. Файлы будут открыты в разделе Действия с изображениями. Шаг 2. Откройте вкладку «Аннотации», затем нажмите «Действия слоя», чтобы создать новый слой вокруг структуры с помощью инструмента «Круг» на панели инструментов. Для некруглых структур вместо этого можно использовать инструмент пера. Шаг 3. Панель инструментов можно использовать для разработки аннотаций и визуализации количественной оценки с помощью <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62280/62280eq01.jpg">инструмента. Шаг 4. Откройте вкладку Анализ и выберите наилучшие условия для анализа образца (здесь может потребоваться несколько испытаний). Шаг 4.1. Используйте раздел Выбор пятна для настройки состояния окрашивания. В случае наличия нескольких пятен они могут быть добавлены и переименованы, а виртуальный цвет может быть изменен. Локализация детектирования может быть заданной – окрашивание ядерным или цитоплазмой. Шаг 4.2. Раздел Обнаружение ячеек используется для настройки обнаружения ячеек. Этот раздел будет наиболее важным для анализа. Раздел «Порог ядерного контраста» позволит обнаруживать все ядра. Внимание должно быть обращено на то, что если есть несколько размеров популяции, программное обеспечение может обнаружить несколько клеток вместо уникальной большой. Разделы «Ядерный размер» и «Агрессивность ядерной сегментации» могут использоваться для количественной оценки диапазонов популяции размеров клеток. Шаг 5. Описание выполнения анализа образцов. Выполните действия, показанные на рисунке. Раздел Слой аннотаций будет запускать настройку только на этом слайде. Количественную оценку можно визуализировать с помощью <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62280/62280eq01.jpg">инструмента. Повторяйте шаги 4.1-5 до тех пор, пока не будет достигнута подходящая количественная оценка. Шаги 6-6.1. Эти шаги позволяют нарисовать фигуру с помощью программного обеспечения. Шаг 7. Количественная графика, полученная с помощью программного обеспечения, может быть сохранена. Шаг 8. Данные можно экспортировать. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/Suppl2_Halo%20Images_revised.pdf" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models at JoVE.com

Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

Здесь мы предоставляем подробные, надежные и взаимодополняющие протоколы для выполнения окрашивания и визуализации субклеточного разрешения фиксированных трехмерных моделей клеточных культур в диапазоне от 100 мкм до нескольких миллиметров, что позволяет визуализировать их морфологию, состав клеточного типа и взаимодействия.

Окрашивание и визуализация высокого разрешения трехмерных органоидных и сфероидных моделей

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...

Характеристика 3D-модели in vitro с клеточным и субклеточным разрешением имеет решающее значение для полной эксплуатации, но может быть сложной задачей. Поэтому мы предоставили дополнительный протокол для окрашивания и субклеточного разрешения фиксированных 3D-моделей in vitro в диапазоне от 100 микрометров до нескольких миллиметров. 3D-структуры являются радиальными, и ими следует тщательно манипулировать.Перед пипеткой проверьте расположение ваших 3D-структур внутри трубы, чтобы избежать каких-либо стремлений. Поскольку мы адаптировали классические методы для встраивания небольших структур, таких как органоиды или сфероиды, визуализированные инструкции могут помочь пользователям в первый раз легче выполнять задачу. Демонстрировать процедуру со мной будет Лаура Франкольс, лабораторный техник из Платформы исследований патологии.Чтобы подготовить образцы для окрашивания цельного 3D-крепления, используйте наконечник пипетки в один миллилитр, предварительно закодированный BSA, чтобы добавить одну миллилитровую 3D-структурную суспензию к 500-микролитровой трубке PBS. Когда 3D-структуры осядут на дно трубки, аккуратно замените PBS 500 микролитрами блокационного раствора для пермеабилизации в течение одного часа инкубации при комнатной температуре с мягким горизонтальным перемешиванием со скоростью от 30 до 50 оборотов в минуту. В конце инкубации позвольте 3D-структурам снова отстояться, прежде чем тщательно промыть 3D-структуры два раза в одном миллилитре 0,1% PBS, дополненном BSA, в течение трех минут на одну промывку.После последней промывки маркируйте 3D-структуры 250 микролитрами первичного антитела в PBS в течение двух-трех дней с мягким горизонтальным перемешиванием при четырех градусах Цельсия. В конце инкубации промыть образец пятью трехминутными и двумя 15-минутными промывками в одном миллилитре 0,1% PBS BSA на стирку. После последней промывки маркируйте 3D-структуры 250 микролитрами соответствующего вторичного антитела в PBS в течение 24 часов при четырех градусах Цельсия с мягким горизонтальным перемешиванием, защищенным от света.На следующий день маркируйте 3D-структуры 250 микролитрами соответствующей концентрации Hoechst 3342 для двухчасовой инкубации при четырех градусах Цельсия с мягким горизонтальным перемешиванием. В конце инкубации промывайте 3D-структуры пять раз в течение трех минут и два раза в течение 15 минут по одному миллилитру PBS на одну стирку, как показано на рисунке. После последней промывки переложите 3D-структуры на 96-луночную черную полистирольную микропластинку и аккуратно добавьте 200 микролитров очищающего раствора на конструкции, избегая пузырьков.Затем поместите пластину, покрытую алюминиевой фольгой, при четырех градусах Цельсия на срок не менее 48 часов. Чтобы встроить большие 3D-модели культур клеток, используйте наконечник пипетки с покрытием BSA в один миллилитр, чтобы аккуратно перенести 3D-структуры в стеклянную трубку с плоским дном с крышкой бутылки, выложенной ptFE. После того, как конструкции осядут, осторожно замените PBS 70% этанолом для 30-минутной инкубации при комнатной температуре.В конце инкубации замените 70%-ный этанол одним миллилитром готового к применению раствора эозина Y. Проведите по трубке и окрашивайте структуры не менее 30 минут. В конце инкубации обезвоживают структуры тремя последовательными 30-минутными промывками в одном миллилитре 100% этанола на промывку.После последнего обезвоживания очистите 3D-структуры с тремя последовательными 30-минутными промывками в одном миллилитре ксилола за одну стирку под химическим вытяжкой. После последнего погружения в ксилол поместите кусок пропитанной ксилолом биопсийной прокладки в один отсек белой тканевой кассеты microtwin и используйте двухмиллитровую пластиковую пипетку Пастера с покрытием BSA для переноса 3D-структур на прокладку. Накройте 3D-структуры другой пропитанной ксилолом биопсийной прокладкой, чтобы удерживать 3D-структуры на месте, и закройте кассету.Когда все образцы будут переданы, поместите кассеты в парафиновую ванну с температурой 65 градусов Цельсия на 30 минут, прежде чем поместить кассеты в свежую парафиновую ванну с температурой 65 градусов Цельсия на ночь. На следующее утро добавьте жидкий парафин в одну нагретую встраиваемую форму на 65 градусов Цельсия на образец и поместите один встроенный образец парафина в каждую форму. Осторожно перемешивайте формы до тех пор, пока все 3D-структуры не упадут на дно, и используйте нагретые тонкие щипцы с температурой 65 градусов Цельсия, чтобы расположить 3D-структуры в центре каждой формы.Охладите форму до тех пор, пока парафин не образует тонкий твердый слой, закрепляя 3D-структуру на месте. Поместите тканевую кассету и добавьте горячий парафин поверх формы. Удалите форму, когда парафин полностью затвердеет.Чтобы встроить небольшие 3D-модели клеточных культур, аккуратно промывайте 3D-структуры три раза в одном миллилитре TBS за одну промывку. После последней промывки удалите как можно больше TBS, не касаясь структур, и добавьте две капли реагента две из коммерческого набора для встраивания парафина. Аккуратно перемешайте постукиванием и добавьте две капли реагента в одну с постукиванием, пока гель не затвердеет.Используйте тонкие щипцы для переноса геля из колодца предварительно собранной кассеты из комплекта и обезвоживайте образец геля с помощью 30-минутных восходящих инкубаций этанола и ксилола в вытяжной вытяжке, как указано. После последнего погружения ксилола поместите кассету в парафиновую ванну с температурой 65 градусов Цельсия на ночь, прежде чем использовать тонкие щипцы для переноса образца парафина в центр жидкого парафина, загруженного на 65 градусов Цельсия, нагретой встраиваемой формы. Затем закрепите 3D-структуру еще одним слоем парафина, как показано для больших моделей 3D-культур клеток.Трехмерное окрашивание целых креплений и конфокальная микроскопия предоставляют визуальную информацию о клеточном составе и пространственном положении моделей 3D-культур на поле глубиной до 200 мкм. Высокое разрешение, которое может быть получено для 3D-структур с использованием этого протокола, позволяет применять алгоритмы клеточной и субклеточной сегментации для количественной оценки числа клеток и обнаружения различных клеточных маркеров в пределах разных подтипов клеток. 3D-анализ целых креплений может быть применен к визуализированным ячейкам глубиной до 200 микрон, независимо от целых структур.Напротив, 2D-анализ разделов может дать представление о клетках любого размера.

Research

JoVE Journal

Biology

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Высокое разрешение Измерение Запах-Driven Поведение в личинки дрозофилы

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Нейронные клеточные культуры из Aplysia для изображений с высоким разрешением роста конусов

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the IÃƒâ€šÃ‚Â·Cryo Kit

Мышь Криоконсервация спермы и восстановление использованием I · Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

Выделение молочной эпителиальные клетки трехмерных смешанных клеток сфероид Co-культуры

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Двух-и трехмерных изображений живых клеток ДНК, белков реакции на повреждения

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Долгосрочные, Высокое разрешение конфокальной микроскопии Lapse время<em&gt; Arabidopsis семядолей</em&gt; Эпидермиса во время прорастания

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

Использование компьютерной томографии высокого разрешения для визуализации трехмерной структуры и функции сосудистой завод

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Мышь плода Всего кишка Культура Система для<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Манипуляция сигнальных путей и трехмерных живых изображений развития ворсинки

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

FRET визуализации в трехмерных гидрогелей

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Высокое разрешение Покадровый изображений и автоматизированный анализ динамики микротрубочек в живых человеческих эндотелиальных клеток пупочной вены

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...