Name: staining and high-resolution imaging of three-dimensional organoid and spheroid models
Uploaded: 2021-03-27T14:00:00
Duration: 7 min 35 s
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Este trabajo fue apoyado por el Premio a la Innovación Robert J. Arceci # 604303 de St Baldrick.

<ol>
	<li>Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+system+methods+and+applications+for+mesenchymal+stem+cells.">Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells.</a> Cells. 8 (12), 1-13 (2019).</li><li>Bartfeld, S., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+organoids+and+their+application+for+medical+research+and+patient+treatment.">Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment.</a> Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).</li><li>Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+multicellular+spheroids+formation.">Advances in multicellular spheroids formation.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 14 (127), (2017).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation.">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1724-1743 (2016).</li><li>Rezanejad, H., Lock, J. H., Sullivan, B. A., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+pancreatic+ductal+organoids+and+whole-mount+immunostaining+of+intact+organoids.">Generation of pancreatic ductal organoids and whole-mount immunostaining of intact organoids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 82 (2019).</li><li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+systems+and+their+applications+in+drug+discovery+and+cell-based+biosensors.">Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).</li><li>McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+and+assessment+of+human+primary+prostate+organoid+culture.">Handling and assessment of human primary prostate organoid culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e59051 (2019).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li><li>Lazzari, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+fluorescence+microscopy+versus+confocal+microscopy:+in+quest+of+a+suitable+tool+to+assess+drug+and+nanomedicine+penetration+into+multicellular+tumor+spheroids.">Light sheet fluorescence microscopy versus confocal microscopy: in quest of a suitable tool to assess drug and nanomedicine penetration into multicellular tumor spheroids.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 142, 195-203 (2019).</li><li>Gabriel, J., Brennan, D., Elisseeff, J. H., Beachley, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+embedding/sectioning+for+parallel+analysis+of+3D+cell+spheroids.">Microarray embedding/sectioning for parallel analysis of 3D cell spheroids.</a> Scientific Reports. 9, 16287 (2019).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El cultivo celular es una herramienta indispensable para descubrir mecanismos biológicos fundamentales involucrados en el desarrollo, función, regeneración y alteración de tejidos y órganos, y enfermedades. Aunque el cultivo celular 2D monocapa ha predominado, investigaciones recientes se han desplazado hacia cultivos que generan estructuras 3D que reflejan más las respuestas celulares in vivo, debido en particular a la organización espacial adicional y los contactos célula-célula que influyen en la expresión génica y el comportamiento celular y, por lo tanto, podrían proporcionar datos más predictivos7. Sin embargo, quedan muchos desafíos, incluida la necesidad de técnicas de tinción e imágenes fáciles de usar para la visualización microscópica detallada y la evaluación de estructuras 3D complejas a nivel celular y subcelular. En ese contexto, se han proporcionado protocolos detallados, robustos y complementarios para realizar tinción e imágenes de resolución celular y subcelular de modelos de cultivo celular 3D in vitro fijos que van desde 100 μm hasta varios milímetros de tamaño.
Este procedimiento presenta dos estrategias diferentes para tratar una gran variedad de tamaños y tipos de modelos de cultivo celular 3D in vitro. La elección de uno (análisis 3D de montaje completo) u otro (análisis de sección 2D) dependerá del modelo utilizado y del problema investigado. El análisis 3D de montaje completo por microscopía confocal permite la visualización de células con un campo de profundidad de hasta 200 μm, independientemente del tamaño total de la estructura 3D, mientras que la sección 2D es aplicable a muestras de cualquier tamaño, pero la visualización sigue siendo 2D dimensional. A continuación se presentan algunas sugerencias para la solución de problemas y consideraciones técnicas.
La pérdida de estructuras 3D durante el flujo de trabajo es el inconveniente más común. Pueden permanecer adheridos a las puntas y tubos, por lo que las puntas y tubos de recubrimiento previo con solución PBS-BSA al 0,1% son clave. Además, es crucial dejar que las estructuras 3D sedimenten entre los cambios de reactivo y realizar todo el pipeteo con mucho cuidado. Como se mencionó en el procedimiento, para todos los pasos, si la sedimentación de la estructura 3D es demasiado larga, las células se pueden girar suavemente a 50 × g durante 5 minutos a RT. Dependiendo del objetivo del estudio, se deben considerar las ventajas / desventajas de tal paso de hilado, ya que la centrifugación puede comprometer la forma de las estructuras 3D. Además, se debe tener cuidado para preservar esta morfología durante la etapa de fijación porque los organoides quísticos tienden a colapsar. La fijación de estructuras de menos de 400 μm de tamaño debe evitar cambios estructurales.
Para un inmunomarcaje óptimo, la recuperación de organoides de sus matrices 3D es un paso crucial. La matriz 3D puede impedir la penetración adecuada de anticuerpos o conducir a una alta tinción de fondo debido a la unión no específica a la matriz. La eliminación de la MCE puede alterar la morfología de los segmentos externos de los organoides (especialmente en el caso de pequeñas protuberancias celulares que se extienden desde estructuras 3D estudiadas) y dificultar parcialmente los análisis. Para tales estructuras 3D, la matriz se puede conservar durante todo el procedimiento; Sin embargo, las condiciones de cultivo deben adaptarse cuidadosamente para cultivar células en una cantidad mínima de matriz para evitar una penetración insuficiente de soluciones y anticuerpos y para evitar pasos sucesivos de lavado destinados a reducir el ruido de fondo excesivo 6,8.
El paso de limpieza óptica descrito en este protocolo en la sección de tinción de montaje completo 3D es pertinente para la obtención de imágenes de estructuras 3D de hasta 150-200 μm de profundidad en lugar de 50-80 μm sin aclaración. En comparación con otras metodologías de limpieza que a menudo requieren varias semanas y utilizan agentes de limpieza tóxicos, eneste protocolo se utilizó un paso de limpieza rápido y seguro previamente publicado 4,9. Además, este paso de limpieza es reversible, y se pueden agregar nuevos anticuerpos a la tinción inicial sin pérdida de resolución o brillo4. Sin embargo, dependiendo del modelo de cultivo celular 3D estudiado, una profundidad de 150-200 μm podría no ser suficiente para obtener imágenes de la estructura 3D de manera informativa, y este protocolo de limpieza puede causar cambios en la morfología general de organoides esféricos monocapa con grandes lúmenes4. Los usuarios deben diseñar cuidadosamente su experimento y, si es necesario, optimizar el tiempo de la etapa de permeabilización / bloqueo (para permitir la penetración de anticuerpos y solución), la etapa de limpieza (para penetrar más profundo que 200 μm, las muestras deben estar totalmente despejadas) y la adquisición de imágenes. Las dos tecnologías más frecuentes disponibles en las instalaciones básicas serían la microscopía de lámina de luz y la microscopía confocal. Los usuarios deberán elegir cuidadosamente una tecnología basada en el tamaño de sus estructuras 3D y su pregunta biológica10. Sin embargo, en comparación con la microscopía confocal, la resolución de microscopía de lámina de luz obtenida para tales estructuras profundas sigue siendo subóptima para obtener la resolución subcelular.
Aquí, se ha informado de un proceso detallado y robusto que se dedica a la incorporación de parafina de muestras individuales. Curiosamente, Gabriel et al. desarrollaron recientemente un protocolo que incorpora cultivos celulares 3D en parafina con un mayor rendimiento. Utilizaron un molde de polidimetilsiloxano (PDMS) para confinar 96 estructuras 3D en un patrón de micromatriz en un bloque, proporcionando nuevas perspectivas para estudios sobre modelos tumorales 3D que abarcan más grupos, puntos de tiempo, condiciones de tratamiento y réplicas11. Sin embargo, este método requiere amplias habilidades y maquinaria, especialmente para la fabricación del premolde utilizado para crear moldes PDMS.
En resumen, este artículo describe dos enfoques diferentes, complementarios y adaptables que permiten la adquisición de información precisa y cuantitativa sobre la composición arquitectónica y celular de los modelos celulares 3D. Ambos parámetros son cruciales para estudiar procesos biológicos como la heterogeneidad celular intratumoral y su papel en la resistencia a los tratamientos.

En las últimas décadas, los avances en la biología de células madre y las tecnologías de cultivo 3D in vitro han anunciado una revolución en biología y medicina. Los modelos celulares de mayor complejidad en 3D se han vuelto muy populares, ya que permiten que las células crezcan e interactúen con un marco extracelular circundante, recapitulando estrechamente aspectos de los tejidos vivos, incluida su arquitectura, organización celular e interacciones, o incluso características de difusión. Como tal, los modelos de cultivo celular 3D pueden proporcionar información única sobre el comportamiento de las células en tejidos en desarrollo o enfermos in vitro. Los organoides y los esferoides son estructuras 3D multicelulares, que van desde varios micrómetros hasta milímetros, y son las estructuras 3D in vitro más prominentes. Ambos pueden cultivarse dentro de un andamio de soporte que incluye (i) hidrogeles derivados de animales (extracto de membrana basal, colágeno), plantas (alginato / agarosa) o sintetizados a partir de productos químicos, o (ii) matrices inertes que contienen poros para promover la proliferación y el crecimiento celular.
Los organoides y esferoides también pueden desarrollarse sin la presencia de un andamio de soporte al depender de las células para autoensamblarse en grupos. Esto se basa en diferentes técnicas, como el uso de materiales no adhesivos para inhibir la unión celular, la tensión superficial y la fuerza gravitacional (por ejemplo, técnicas de caída colgante) o la rotación circular constante de los vasos (por ejemplo, cultivo de hilanderas). En todos los casos, estas técnicas facilitan las interacciones célula-célula y célula-matriz para superar las limitaciones del cultivo celular monocapa tradicional1. Los términos "organoides" y "esferoides" se han utilizado indistintamente en el pasado, pero existen diferencias clave entre estos dos modelos de cultivo celular 3D. Los organoides son grupos celulares 3D in vitro derivados de células madre pluripotentes o células madre específicas de tejido, en los que las células se autoorganizan espontáneamente en progenitoras y tipos de células diferenciadas y que recapitulan al menos algunas funciones del órgano de interés2. Los esferoides comprenden una gama más amplia de estructuras 3D multicelulares formadas bajo condiciones no adherentes y pueden surgir de una gran diversidad de tipos de células, como líneas celulares inmortalizadas o células primarias3. Por lo tanto, inherentes a sus orígenes intrínsecos de células madre, los organoides tienen una mayor propensión al autoensamblaje, la viabilidad y la estabilidad que los esferoides.
Sin embargo, en esencia, estos dos modelos son estructuras 3D compuestas por múltiples células, y las técnicas desarrolladas para estudiarlas son, por lo tanto, muy similares. Por ejemplo, se necesitan potentes enfoques de imagen a nivel de resolución de una sola célula para sondear la complejidad celular tanto de organoides como de esferoides. Aquí, al resumir la experiencia de este grupo y la de los líderes en el campo de los organoides4, este documento describe procedimientos detallados para realizar tinción bidimensional (2D) y 3D de montaje completo, imágenes y análisis de la composición celular y subcelular y la organización espacial de organoides y esferoides que van desde 100 μm hasta varios milímetros. De hecho, este procedimiento presenta dos tipos diferentes y complementarios de tinción y adquisición de imágenes para analizar una gran variedad de tamaños y tipos de modelos de cultivo celular 3D in vitro. El uso de uno (análisis 3D de montaje completo) u otro (análisis de sección 2D) dependerá del modelo estudiado y de las respuestas buscadas. El análisis 3D de montaje completo por microscopía confocal puede, por ejemplo, aplicarse para visualizar células en cultivo 3D de hasta 200 μm de profundidad, independientemente del tamaño total de la estructura 3D, mientras que el análisis de secciones 2D proporciona información sobre muestras de cualquier tamaño, aunque a nivel 2D. Este procedimiento se ha aplicado con éxito a través de una variedad de organoides4,5 y esferoides derivados de células humanas y murinas, procedentes de diferentes capas germinales embrionarias. La descripción general del procedimiento se muestra en la figura 1. Se indican las etapas principales, las relaciones entre ellas, los pasos decisivos y el momento esperado.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig01.jpg"> Figura 1: Descripción general esquemática del procedimiento. Los modelos de cultivo celular 3D in vitro se recogen y fijan, luego se preparan para la tinción 3D de montaje completo (opción a) o se incrustan en parafina para seccionamiento y tinción 2D (opción b). Para experimentos de tinción 3D de montaje completo, las estructuras 3D fijas se inmunomarcan siguiendo el paso de fijación. Se puede realizar un paso opcional de limpieza óptica para mejorar la calidad de imagen y la profundidad de la microscopía óptica al reducir la dispersión de la luz durante el procesamiento de imágenes. Las imágenes se capturan en un microscopio confocal invertido o en un sistema confocal de alto contenido y se analizan utilizando el software apropiado. Para la incrustación de parafina, las estructuras 3D se procesan directamente (opción b.1 para estructuras grandes ≥ 400 μm) o se incluyen en un gel (b.2; estructuras pequeñas ≤ 400 μm) para deshidratación e incrustación de parafina. Luego se cortan y tiñen los bloques de parafina (tinción histológica o inmunoquímica). Las imágenes de las secciones 2D se obtienen en un escáner de diapositivas digital o un microscopio vertical y se analizan en una plataforma de análisis de imágenes utilizando un análisis cuantitativo digital rápido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy pad Q Path blue</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes macrostar III Blc couv. Char. x1500</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassette microtwin white</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical hood</td>
			<td>Erlab</td>
			<td>FI82 5585-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips 1000 &#181;L</td>
			<td>Star lab Tip-One</td>
			<td>S1122-1730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Pyramid innovation</td>
			<td>R35002-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottom glass tubes with PTFE lined 2 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11784259</td>
			<td>Excellent&#160; for environmental&#160;&#160;&#160; samples,&#160;&#160;&#160; pharmaceuticals and diagnostic reagents. PTFE is designed for the ultimate in product safety. PTFE provides totally inert inner seal and surface facing the sample or product.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish plate 35 mm</td>
			<td>Ibedi</td>
			<td>2018003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal agitation</td>
			<td>N-BIOTEK</td>
			<td>NB-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator prewarmed to 65 &#176;C</td>
			<td>Memmert Incubator</td>
			<td>LAB129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inox molds 15x15</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-1918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides Matsunami TOMO-11/90</td>
			<td>Roche diagnostics</td>
			<td>8082286001</td>
			<td>these slides are used for a better adhesion of sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>HM340E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panoramic scan II</td>
			<td>3dhistech</td>
			<td>2397612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin embedding equipment</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette Pasteur 2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Path flacon 150mL cape blanc x250</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-1308</td>
			<td>Good for environmental&#160;&#160;&#160; samples,&#160;&#160;&#160; pharmaceuticals and diagnostic reagents. Polypropylene (PP) are rigid,&#160; solid, provide excellent&#160; stress&#160; crack&#160; and&#160; impact&#160; resistance and have a&#160; good oil and alcohol barrier and chemical resistance. PE-lined cap is stress crack resistant and offers&#160; excellent&#160; sealing&#160; characteristics.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Set of micropipettors&#160; (p200, p1000)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11877351 (20-200) 11887351(p1000)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPERA PHENIX</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>HH14000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP5 inverted confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LSM780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue cassette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-0228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiomager microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SIP 60549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoblock (kit)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10066588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57648266</td>
			<td>CAUTION: toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin aqueous 1%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT110316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83804.360</td>
			<td>CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.365</td>
			<td>CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin 4%</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>F/40877-36</td>
			<td>CAUTION: Formalin contains formaldehyde which is hazardous. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fructose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gill hematoxylin type II</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>F/CP813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td>CAUTION: Suspected of causing genetic defects.&#160; Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Wax tek III</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS) 1 X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Buffered Saline (TBS) 10X</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>F/00801</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8532</td>
			<td>CAUTION: Triton X&#173;100 is hazardous. Avoid contact with skin and eyes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>534056</td>
			<td>CAUTION: Xylene is toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Clearing solution</td>
			<td>Glycerol-Fructose clearing solution is 60% (vol/w) glycerol and 2.5 M fructose. To prepare 10 mL of this solution, mix 6 mL of glycerol and 4.5 g of fructose. Complete to 10 mL with dH2O. Use a magnetic stirrer overnight. Refractive index = 1.4688 at room temperature (RT: 19&#8211;23 &#176;C). Store at 4 &#176;C in dark for up to 1 month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">PBS-BSA 0,1% solution</td>
			<td>To prepare 0,1% (vol/wt) PBS-BSA 0,1% solution, dissolve 500 mg of BSA in 50 mL of PBS-1X (store at 4&#176;C for up to 2 weeks). And dilute 1mL of this solution into 9mL of PBS-1X. This solution can be used to precoat the tip and centrifugation tube.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Permeabilisation-blocking solution (PB solution)</td>
			<td>The PBSDT blocking solution is PBS-1X supplemented with 0.1% &#8211; 1% Tritonx-100 (depending on the protein localization membrane/nucleus), 1% DMSO, 1% BSA and 1% donkey serum (or from the animal in which the secondary antibodies were raised). This solution can be stored at 4&#176;C for up to 1 month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">PB:PBS-1X &#160;(1:10) solution</td>
			<td>PB:PBS-1X &#160;(1:10) solution is a 10 time diluted PB solution. To prepare 10 mL of this solution dilute 1 mL of PB solution in 9 mL of PBS-1X.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halo software</td>
			<td>Indicalabs</td>
			<td>NM 87114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harmony software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>HH17000010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

staining and high-resolution imaging of three-dimensional organoid and spheroid models

Los modelos de cultivo celular tridimensional (3D) in vitro, como organoides y esferoides, son herramientas valiosas para muchas aplicaciones, incluido el desarrollo y el modelado de enfermedades, el descubrimiento de fármacos y la medicina regenerativa. Para explotar plenamente estos modelos, es crucial estudiarlos a nivel celular y subcelular. Sin embargo, caracterizar tales modelos de cultivo celular 3D in vitro puede ser técnicamente desafiante y requiere experiencia específica para realizar análisis efectivos. Aquí, este documento proporciona protocolos detallados, robustos y complementarios para realizar imágenes de tinción y resolución subcelular de modelos de cultivo celular 3D in vitro fijos que van desde 100 μm hasta varios milímetros. Estos protocolos son aplicables a una amplia variedad de organoides y esferoides que difieren en su célula de origen, morfología y condiciones de cultivo. Desde la recolección de estructuras 3D hasta el análisis de imágenes, estos protocolos se pueden completar en 4-5 días. Brevemente, las estructuras 3D se recolectan, fijan y luego pueden procesarse mediante incrustación de parafina y tinción histológica / inmunohistoquímica, o directamente inmunomarcadas y preparadas para la limpieza óptica y la reconstrucción 3D (200 μm de profundidad) mediante microscopía confocal.

Este protocolo proporciona una visión general de los pasos críticos para la tinción de montaje completo 2D y 3D, así como imágenes y análisis cuantitativos de modelos de cultivo celular 3D (Figura 3 y Figura 4). Es aplicable a una amplia gama de modelos de cultivo celular 3D, desde esferoides hasta organoides de diferentes especies o tejidos huéspedes, y permite la adquisición de información precisa y cuantitativa sobre arquitectura, organización celular e interacciones a nivel celular y subcelular (Figura 3 y Figura 4). Los laboratorios pueden necesitar optimizar las técnicas histológicas e inmunohistoquímicas 2D y las concentraciones de anticuerpos de acuerdo con sus propias necesidades.
Ambos métodos proporcionan información biológica valiosa. La tinción 3D de montaje completo y la microscopía confocal proporcionan información visual sobre la composición celular y la posición espacial con un campo de profundidad de hasta 200 μm (Figura 3B). Sin embargo, la sección 2D es conveniente para que las estructuras 3D más grandes revelen rasgos morfológicos celulares detallados en toda la sección de estructuras 3D que de otro modo pueden ser difíciles de observar in situ debido a la dispersión de la luz que compromete la resolución en muestras más grandes. Además, ambas técnicas pueden proporcionar datos cuantitativos. De hecho, la resolución obtenida permite la aplicación de algoritmos de segmentación celular y subcelular para la cuantificación del número de células y la detección de la presencia de varios marcadores celulares en diferentes subtipos celulares (Figura 3F y Figura 4). En resumen, las técnicas de imagen descritas aquí son reproducibles, simples y complementarias y representan herramientas valiosas para estudiar la heterogeneidad celular.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig03.jpg"> Figura 3: Resultados representativos para montaje completo 3D, imágenes y análisis de secciones ópticas 3D y 2D. (A) Imágenes confocales de esferoide de glioma humano (h) de alto grado cultivado durante una semana y etiquetado con Hoechst (azul), Olig2 (amarillo) y Actina (rojo) (objetivo de agua 20x). Para todas las imágenes adquiridas, los ajustes del microscopio se establecieron utilizando un control positivo (arriba), y luego el control negativo se visualizó utilizando ajustes idénticos para controlar la falta de fluorescencia en ausencia de anticuerpos primarios (abajo). (B) Representación ortogonal 3D de montaje completo de la tinción de Ki67 realizada en (h) esferoide de glioma de alto grado cultivado durante una semana (aclaramiento de glicerol-fructosa; objetivo de agua 20x, confocal). (C) Imágenes confocales de (h) esferoide de glioma de alto grado cultivado durante una semana y marcado con Hoechst (azul), Olig2 (amarillo) y faloidina-488 (verde) (aclaramiento de glicerol-fructosa; objetivo de agua 20x). (D) Imágenes confocales de esferoides humanos (h) de rabdomiosarcoma (arriba) y ratón (m) de células de la cresta neural (abajo) cultivados durante una semana y marcados con Hoechst (azul), Actina (rojo) y Ki67 (verde), respectivamente (eliminación de glicerol-fructosa; objetivo seco 20x). (E) Imágenes confocales de (h) esferoide de glioma de alto grado cultivado durante una semana y etiquetado con Hoechst (azul) y Ki67 (verde) (limpieza de glicerol-fructosa; objetivo de agua 40x) (arriba a la izquierda). Las imágenes segmentadas en el canal Hoechst y las regiones nucleares Ki67-positivas (+) en el canal verde se generaron utilizando software de análisis de alto contenido (ver Figura suplementaria 1 y Tabla de materiales) (abajo). La salida dada es el porcentaje de núcleos Ki67+ por estructura 3D segmentada (arriba a la derecha). Barra de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig04.jpg"> Figura 4: Resultados representativos para imágenes y análisis de secciones ópticas 2D. (A, D) Imágenes de sección 2D de un modelo celular 3D (esferoides de rabdomiosarcoma humano cultivados durante un mes) obtenidas con un escáner digital de diapositivas y analizadas en una plataforma para un análisis cuantitativo digital rápido. (A) Tinción H&E y detección de células según su tamaño. Barra de escala = 500 μm. (B) El histograma muestra el porcentaje de células < 100 μm2 y > 100μm2 detectadas utilizando software para un análisis cuantitativo digital rápido (izquierda: Halo) o conteo manual (derecha: MC). (C) Tinción de Ki67 y detección de células según la intensidad de su señal de 3,3'-diaminobencidina (DAB). Negativo (azul), débilmente positivo (amarillo), positivo (rojo). Barra de escala = 500 μm. (D) El histograma muestra el porcentaje de células Ki67 negativas, débilmente positivas y positivas. Abreviaturas: H&E = hematoxilina y eosina; MC = conteo manual. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figura complementaria 1: Descripción general de los pasos en el software de análisis de imágenes. Los análisis se basan en la asociación de bloques de construcción. Cada bloque de construcción corresponde a una función (segmentación, cálculo, asociación, definición de salida) y ofrece múltiples algoritmos y selecciones de variables para que coincidan con la muestra biológica que se está fotografiando. El software proporciona múltiples protocolos de análisis RMS (Ready Made Solution) que se pueden usar y modificar fácilmente. Los protocolos de análisis de imágenes integrados se pueden guardar, aplicar a diferentes conjuntos de datos y compartir entre usuarios. Brevemente, el protocolo de análisis implica segmentación secuencial de objetos: esferoide, núcleos y, finalmente, bolsas Ki67 (A488). Luego, la intensidad media de los bolsillos Ki67 se calcula para discriminar aún más los eventos positivos. Finalmente, los núcleos que abarcan bolsas positivas de Ki67 se seleccionan positivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/Suppl1_Harmony%20analysis_Revised.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura complementaria 2: Descripción general de los pasos del procedimiento del software de análisis cuantitativo. Paso 1. Cargue los archivos utilizando la pestaña Estudios . Los archivos se abrirán en la sección Acciones de imagen . Paso 2. Abra la pestaña Anotaciones y, a continuación, haga clic en Acciones de capa para diseñar una nueva capa alrededor de la estructura con la herramienta circular de la barra de herramientas. Para estructuras no circulares, se puede utilizar la herramienta de lápiz en su lugar. Paso 3. La barra de herramientas se puede utilizar para diseñar anotaciones y visualizar la cuantificación con la <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62280/62280eq01.jpg">herramienta. Paso 4. Abra la pestaña Análisis y seleccione las mejores condiciones para el análisis de la muestra (pueden ser necesarios varios ensayos aquí). Paso 4.1. Utilice la sección Selección de manchas para configurar la condición de tinción. En el caso de varias manchas, estas se pueden agregar y renombrar, y el color virtual se puede modificar. La detección de localización puede ser específica nuclear o tinción citoplasmática. Paso 4.2. Utilice la sección Detección de celdas para configurar la detección de celdas. Esta sección será la más importante para el análisis. La sección Umbral de contraste nuclear permitirá la detección de todos los núcleos. Se debe prestar atención en caso de que haya múltiples tamaños de población, el software puede detectar varias células en lugar de una grande única. Las secciones de agresividad de tamaño nuclear y segmentación nuclear se pueden usar para cuantificar los rangos de población de tamaño celular. Paso 5. Descripción sobre cómo ejecutar el análisis de muestras. Siga los pasos que se muestran en la figura. La sección Capa de anotación ejecutará la configuración solo en esta diapositiva. La cuantificación se puede visualizar utilizando la <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62280/62280eq01.jpg">herramienta. Repita los pasos 4.1-5 hasta que se logre la cuantificación adecuada. Pasos 6-6.1. Estos pasos le permiten dibujar una figura utilizando el software. Paso 7. Los gráficos de cuantificación obtenidos a través del software se pueden guardar. Paso 8. Los datos se pueden exportar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/Suppl2_Halo%20Images_revised.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

Aquí, proporcionamos protocolos detallados, robustos y complementarios para realizar imágenes de tinción y resolución subcelular de modelos de cultivo celular tridimensionales fijos que van desde 100 μm hasta varios milímetros, lo que permite la visualización de su morfología, composición de tipo celular e interacciones.

Tinción e imágenes de alta resolución de modelos organoides y esferoides tridimensionales

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...

La caracterización del modelo 3D in vitro a resolución celular y subcelular es crucial para la explotación completa, pero puede ser un desafío. Por lo tanto, hemos proporcionado un protocolo complementario para la tinción y la resolución subcelular de imágenes de modelos 3D fijos in vitro que van desde 100 micrómetros hasta varios milímetros. Las estructuras 3D son radiales y deben manipularse cuidadosamente.Antes de pipetear, verifique la ubicación de sus estructuras 3D dentro del tubo para evitar cualquier aspiración. Como hemos adaptado técnicas clásicas para la incrustación de estructuras pequeñas como organoides o esferoides, las instrucciones visualizadas pueden ayudar a los usuarios primerizos a realizar la tarea más fácilmente. Demostrando el procedimiento conmigo estará Laura Francols, una técnica de laboratorio de la Plataforma de Investigación de Patología.Para preparar muestras para la tinción 3D de montaje completo, use una punta de pipeta de un mililitro precodificada con BSA para agregar una suspensión de estructura 3D de un mililitro a un tubo de 500 microlitros de PBS. Cuando las estructuras 3D se hayan asentado en el fondo del tubo, reemplace cuidadosamente el PBS con 500 microlitros de solución de bloqueo de permeabilización durante una incubación de una hora a temperatura ambiente con agitación horizontal suave a 30 a 50 revoluciones por minuto. Al final de la incubación, deje que las estructuras 3D sedimenten nuevamente antes de lavar cuidadosamente las estructuras 3D dos veces en un mililitro de 0.1% PBS suplementado con BSA durante tres minutos por lavado.Después del último lavado, etiquete las estructuras 3D con 250 microlitros de anticuerpos primarios en PBS durante dos o tres días con una suave agitación horizontal a cuatro grados centígrados. Al final de la incubación, lavar la muestra con cinco lavados de tres minutos y dos de 15 minutos en un mililitro de BSA al 0,1% de PBS por lavado. Después del último lavado, etiquete las estructuras 3D con 250 microlitros del anticuerpo secundario apropiado en PBS durante 24 horas a cuatro grados centígrados con una suave agitación horizontal protegida de la luz.Al día siguiente, etiquete las estructuras 3D con 250 microlitros de la concentración apropiada de Hoechst 3342 durante una incubación de dos horas a cuatro grados centígrados con una suave agitación horizontal. Al final de la incubación, lavar las estructuras 3D cinco veces durante tres minutos y dos veces durante 15 minutos en un mililitro de PBS por lavado como se demuestra. Después del último lavado, transfiera las estructuras 3D a una microplaca de poliestireno negro de 96 pocillos y agregue suavemente 200 microlitros de solución de limpieza a las estructuras, evitando burbujas.Luego coloque la placa cubierta con papel de aluminio a cuatro grados centígrados durante al menos 48 horas. Para incrustar grandes modelos de cultivo celular 3D, use una punta de pipeta de un mililitro recubierta con BSA para transferir cuidadosamente las estructuras 3D a un tubo de vidrio de fondo plano con una tapa de botella forrada de PTFE. Después de que las estructuras se hayan asentado, reemplace cuidadosamente el PBS con etanol al 70% para una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente.Al final de la incubación, reemplace el etanol al 70% con un mililitro de solución Y de eosina lista para usar. Mueva el tubo y manche las estructuras durante al menos 30 minutos. Al final de la incubación, deshidratar las estructuras con tres lavados sucesivos de 30 minutos en un mililitro de etanol al 100% por lavado.Después de la última deshidratación, limpie las estructuras 3D con tres lavados sucesivos de 30 minutos en un mililitro de xileno por lavado bajo una campana química. Después de la última inmersión en xileno, coloque un trozo de almohadilla de biopsia empapada en xileno en un compartimento de un casete de tejido microgemelo blanco y use una pipeta Pasteur de plástico de dos mililitros recubierta de BSA para transferir las estructuras 3D a la almohadilla. Cubra las estructuras 3D con otra almohadilla de biopsia empapada en xileno para mantener las estructuras 3D en su lugar y cierre el casete.Cuando todas las muestras hayan sido transferidas, coloque los casetes en un baño de parafina de 65 grados centígrados durante 30 minutos antes de colocar los casetes en un baño de parafina fresco de 65 grados centígrados durante la noche. A la mañana siguiente, agregue parafina líquida a un molde de incrustación calentado a 65 grados centígrados por muestra y coloque una muestra incrustada en parafina en cada molde. Agite suavemente los moldes hasta que todas las estructuras 3D caigan al fondo, y use pinzas finas calentadas a 65 grados centígrados para colocar las estructuras 3D en el centro de cada molde.Enfríe el molde hasta que la parafina forme una capa sólida delgada, asegurando la estructura 3D en su lugar. Coloque un cassette de pañuelo de papel y agregue parafina caliente sobre el molde. Retire el molde cuando la parafina se haya solidificado completamente.Para incrustar pequeños modelos de cultivo celular 3D, lave suavemente las estructuras 3D tres veces en un mililitro de TBS por lavado. Después del último lavado, retire la mayor cantidad de TBS posible sin tocar las estructuras y agregue dos gotas de reactivo dos de un kit de incrustación de parafina comercial. Mezclar suavemente dando golpecitos, y añadir dos gotas de reactivo una con golpeteo hasta que el gel se solidifique.Use pinzas finas para transferir el gel del pocillo del casete preensamblado del kit y deshidrate la muestra incrustada en gel con incubaciones ascendentes de etanol y xileno de 30 minutos en una campana extractora, según se indique. Después de la última inmersión en xileno, coloque el casete en un baño de parafina de 65 grados centígrados durante la noche antes de usar pinzas finas para transferir la muestra incrustada en parafina al centro de un molde de parafina líquida cargado a 65 grados centígrados. Luego asegure la estructura 3D con una capa más de parafina como se demostró para los grandes modelos de cultivo celular 3D.La tinción tridimensional de montaje completo y la microscopía confocal proporcionan información visual sobre la composición celular y la posición espacial de los modelos de cultivo 3D a un campo de profundidad de hasta 200 micras. La alta resolución que se puede obtener para estructuras 3D utilizando este protocolo permite la aplicación de algoritmos de segmentación celular y subcelular para la cuantificación del número celular y la detección de varios marcadores celulares dentro de diferentes subtipos celulares. El análisis de montajes completos 3D se puede aplicar a células visualizadas de hasta 200 micras de profundidad, independientemente de las estructuras completas.Por el contrario, el análisis de secciones 2D puede proporcionar información sobre celdas de cualquier tamaño.

Research

JoVE Journal

Biology

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

De alta resolución de medición del comportamiento de olor-Driven en larvas de Drosophila

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Investigación

Biología

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Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

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Criopreservación de espermatozoides de ratón y de recuperación con el I · Kit de Cryo

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Aislamiento de células epiteliales mamarias de tridimensional mixto de células Esferoide Co-cultura

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Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

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Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

A largo plazo, de alta resolución de imagen confocal Time Lapse de<em&gt; Cotiledones Arabidopsis</em&gt; Epidermis durante la germinación

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Sistema de Cultura ratón fetal Whole Intestino para<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Manipulación de vías de señalización y tridimensional de imágenes en vivo del desarrollo de vellosidades

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High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

-Alta resolución de imagen de lapso de tiempo y análisis automatizado de los microtúbulos en la dinámica de estar umbilical humana Las células endoteliales de vena

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...