Name: staining and high-resolution imaging of three-dimensional organoid and spheroid models
Uploaded: 2021-03-27T14:00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models at JoVE.com

Detta arbete stöddes av St Baldricks Robert J. Arceci Innovation Award #604303.

<ol>
	<li>Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+system+methods+and+applications+for+mesenchymal+stem+cells.">Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells.</a> Cells. 8 (12), 1-13 (2019).</li><li>Bartfeld, S., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+organoids+and+their+application+for+medical+research+and+patient+treatment.">Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment.</a> Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).</li><li>Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+multicellular+spheroids+formation.">Advances in multicellular spheroids formation.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 14 (127), (2017).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation.">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1724-1743 (2016).</li><li>Rezanejad, H., Lock, J. H., Sullivan, B. A., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+pancreatic+ductal+organoids+and+whole-mount+immunostaining+of+intact+organoids.">Generation of pancreatic ductal organoids and whole-mount immunostaining of intact organoids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 82 (2019).</li><li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+systems+and+their+applications+in+drug+discovery+and+cell-based+biosensors.">Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).</li><li>McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+and+assessment+of+human+primary+prostate+organoid+culture.">Handling and assessment of human primary prostate organoid culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e59051 (2019).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li><li>Lazzari, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+fluorescence+microscopy+versus+confocal+microscopy:+in+quest+of+a+suitable+tool+to+assess+drug+and+nanomedicine+penetration+into+multicellular+tumor+spheroids.">Light sheet fluorescence microscopy versus confocal microscopy: in quest of a suitable tool to assess drug and nanomedicine penetration into multicellular tumor spheroids.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 142, 195-203 (2019).</li><li>Gabriel, J., Brennan, D., Elisseeff, J. H., Beachley, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+embedding/sectioning+for+parallel+analysis+of+3D+cell+spheroids.">Microarray embedding/sectioning for parallel analysis of 3D cell spheroids.</a> Scientific Reports. 9, 16287 (2019).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Cellodling är ett oumbärligt verktyg för att avslöja grundläggande biologiska mekanismer som är involverade i vävnads- och organutveckling, funktion, regenerering och störning samt sjukdom. Även om monoskiktad 2D-cellodling har dominerat, har ny forskning skiftat mot kulturer som genererar 3D-strukturer som är mer reflekterande av in vivo-cellulära svar, särskilt på grund av ytterligare rumslig organisation och cell-cellkontakter som påverkar genuttryck och cellulärt beteende och därmed kan ge mer prediktiva data7. Ändå kvarstår många utmaningar, inklusive behovet av användarvänliga färgnings- och avbildningstekniker för detaljerad mikroskopisk visualisering och utvärdering av komplexa 3D-strukturer på cellulär och subcellulär nivå. I detta sammanhang har detaljerade, robusta och kompletterande protokoll tillhandahållits för att utföra färgning och cellulär och subcellulär upplösningsavbildning av fasta in vitro 3D-cellodlingsmodeller som sträcker sig från 100 μm till flera millimeter i storlek.
Denna procedur presenterar två olika strategier för att hantera en mängd olika storlekar och typer av in vitro 3D-cellodlingsmodeller. Valet av den ena (3D-helmonteringsanalys) eller den andra (2D-sektionsanalys) beror på vilken modell som används och vilken fråga som undersöks. 3D-helmonteringsanalys med konfokalmikroskopi möjliggör visualisering av celler med ett djupfält på upp till 200 μm, oavsett den totala storleken på 3D-strukturen, medan 2D-sektionering är tillämplig på prover av alla storlekar, men visualisering förblir 2D-dimensionell. Nedan följer några förslag på felsökning och tekniska överväganden.
Förlust av 3D-strukturer under arbetsflödet är den vanligaste nackdelen. De kan förbli vidhäftande på spetsarna och rören, varför förbeläggningsspetsar och rör med PBS-BSA 0,1% lösning är nyckeln. Dessutom är det viktigt att låta 3D-strukturerna sedimentera mellan reagensbyten och att utföra all pipettering mycket noggrant. Som nämnts i proceduren kan cellerna för alla steg, om 3D-struktursedimenteringen är för lång, snurras försiktigt vid 50 × g i 5 minuter vid RT. Beroende på syftet med studien bör fördelarna / nackdelarna med ett sådant spinnsteg övervägas eftersom centrifugering kan äventyra formen på 3D-strukturerna. Dessutom bör man se till att bevara denna morfologi under fixeringssteget eftersom cystiska organoider tenderar att kollapsa. Fixering av strukturer under 400 μm i storlek bör förhindra strukturella förändringar.
För optimal immunmärkning är återvinning av organoider från deras 3D-matriser ett avgörande steg. 3D-matrisen kan hindra adekvat antikroppspenetration eller leda till hög bakgrundsfärgning på grund av ospecifik bindning till matrisen. ECM-avlägsnande kan förändra morfologin hos de yttre segmenten av organoider (särskilt vid små cellulära utsprång som sträcker sig från studerade 3D-strukturer) och delvis försvåra analyser. För sådana 3D-strukturer kan matrisen behållas under hela proceduren; Odlingsförhållandena bör dock noggrant anpassas för att odla celler i en minimal mängd matris för att förhindra otillräcklig penetration av lösningar och antikroppar och för att undvika på varandra följande tvättsteg som syftar till att minska alltför stort bakgrundsbuller 6,8.
Det optiska rensningssteget som beskrivs i detta protokoll i 3D-färgningssektionen för hela monteringen är relevant för avbildning av 3D-strukturer upp till 150-200 μm djup istället för 50-80 μm utan röjning. Jämfört med andra clearingmetoder som ofta kräver flera veckor och använder giftiga clearingmedel, användes ett tidigare publicerat snabbt och säkert clearingsteg i detta protokoll 4,9. Dessutom är detta rensningssteg reversibelt och nya antikroppar kan läggas till den initiala färgningen utan förlust av upplösning eller ljusstyrka4. Beroende på den studerade 3D-cellodlingsmodellen kanske ett djup på 150-200 μm inte är tillräckligt för att avbilda 3D-strukturen på ett informativt sätt, och detta clearingprotokoll kan orsaka förändringar i den allmänna morfologin hos sfäriska, monoskiktade organoider med stora lumen4. Användare bör noggrant utforma sitt experiment och vid behov optimera tidpunkten för permeabiliserings- / blockeringssteget (för att möjliggöra penetration av antikroppar och lösning), rensningssteget (för att penetrera djupare än 200 μm, prover bör rensas helt) och bildförvärv. De två vanligaste teknikerna som finns tillgängliga i kärnanläggningar skulle vara ljusplåt och konfokalmikroskopi. Användare måste noggrant välja en teknik baserad på storleken på deras 3D-strukturer och deras biologiska fråga10. Jämfört med konfokalmikroskopi förblir emellertid ljusarkmikroskopiupplösningen erhållen för sådana djupa strukturer suboptimal för att erhålla subcellulär upplösning.
Här har en detaljerad och robust process rapporterats som är dedikerad till paraffinininbäddning av enstaka prover. Intressant nog utvecklade Gabriel et al. nyligen ett protokoll som bäddar in 3D-cellkulturer i paraffin med ökad genomströmning. De använde en polydimetylsiloxan (PDMS) -form för att begränsa 96 3D-strukturer i ett mikroarraymönster i ett block, vilket gav nya perspektiv för studier av 3D-tumörmodeller som omfattar fler grupper, tidpunkter, behandlingsförhållanden och replikerar11. Denna metod kräver dock omfattande färdigheter och maskiner, särskilt för tillverkning av förformen som används för att skapa PDMS-formar.
Sammanfattningsvis beskriver detta dokument två olika, kompletterande och anpassningsbara tillvägagångssätt som möjliggör förvärv av exakt och kvantitativ information om arkitektonisk och cellulär sammansättning av 3D-cellulära modeller. Båda parametrarna är avgörande för att studera biologiska processer såsom intratumoral cellulär heterogenitet och dess roll i resistens mot behandlingar.

Under de senaste decennierna har framsteg inom stamcellsbiologi och in vitro 3D-odlingsteknik förebådat en revolution inom biologi och medicin. Cellmodeller med högre komplexitet i 3D har blivit mycket populära eftersom de tillåter celler att växa och interagera med ett omgivande extracellulärt ramverk, nära rekapitulerande aspekter av levande vävnader inklusive deras arkitektur, cellorganisation och interaktioner, eller till och med diffusionsegenskaper. Som sådan kan 3D-cellodlingsmodeller ge unika insikter i beteendet hos celler i utvecklande eller sjuka vävnader in vitro. Organoider och sfäroider är båda multicellulära 3D-strukturer, som sträcker sig från flera mikrometer till millimeter, och är de mest framträdande in vitro 3D-strukturerna. Båda kan odlas i en stödjande ställning inklusive (i) hydrogeler härrörande från djur (basalmembranextrakt, kollagen), växter (alginat / agaros) eller syntetiseras från kemikalier, eller (ii) inerta matriser som innehåller porer för att främja cellproliferation och tillväxt.
Organoider och sfäroider kan också utvecklas utan närvaro av en stödjande ställning genom att förlita sig på celler för att självmontera i kluster. Detta bygger på olika tekniker såsom användning av icke-vidhäftande material för att hämma cellfästning, ytspänning och gravitationskraft (t.ex. hängande dropptekniker) eller konstant cirkulär rotation av kärl (t.ex. spinnkultur). I samtliga fall underlättar dessa tekniker cell-cell och cell-matrisinteraktioner för att övervinna begränsningarna i traditionell monolagercellodling1. Termerna "organoider" och "sfäroider" har använts omväxlande tidigare, men det finns viktiga skillnader mellan dessa två 3D-cellodlingsmodeller. Organoider är in vitro 3D-cellulära kluster härledda från pluripotenta stamceller eller vävnadsspecifika stamceller, där celler spontant självorganiserar sig i förfäder och differentierade celltyper och som rekapitulerar åtminstone vissa funktioner hos det organ som är av intresse2. Sfäroider innefattar ett bredare spektrum av multicellulära 3D-strukturer bildade under icke-vidhäftande förhållanden och kan uppstå från en stor mångfald av celltyper, såsom odödliga cellinjer eller primära celler3. Organoider har därför en högre benägenhet för självmontering, livskraft och stabilitet än sfäroider.
Ändå är dessa två modeller i huvudsak 3D-strukturer som består av flera celler, och de tekniker som utvecklats för att studera dem är således mycket lika. Till exempel är kraftfulla avbildningsmetoder på encellsupplösningsnivå nödvändiga för att undersöka den cellulära komplexiteten hos både organoider och sfäroider. Här, genom att sammanfatta denna grupps expertis och ledare inom organoider4, beskriver detta dokument detaljerade procedurer för att utföra tvådimensionell (2D) och 3D helmonterad färgning, avbildning och analyser av den cellulära och subcellulära sammansättningen och rumsliga organisationen av organoider och sfäroider som sträcker sig från 100 μm till flera millimeter. Faktum är att denna procedur presenterar två olika och komplementära typer av färgning och bildförvärv för att analysera en mängd olika storlekar och typer av in vitro 3D-cellodlingsmodeller. Användningen av den ena (3D-helmonteringsanalys) eller den andra (2D-sektionsanalys) beror på den studerade modellen och de sökta svaren. 3D-helmonteringsanalys med konfokalmikroskopi kan till exempel tillämpas för att visualisera celler i 3D-kultur upp till 200 μm djup, oavsett 3D-strukturens totala storlek, medan analysen av 2D-sektioner ger insikter i prover av alla storlekar, om än på 2D-nivå. Denna procedur har framgångsrikt tillämpats på en mängd olika organoider4,5 och sfäroider härrörande från humana och murina celler, som härrör från olika embryonala könslager. Översikten över förfarandet visas i figur 1. De stora stadierna, relationerna mellan dem, avgörande steg och den förväntade tidpunkten anges.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig01.jpg"> Figur 1: Schematisk översikt över förfarandet. In vitro 3D-cellodlingsmodeller samlas in och fixeras, sedan antingen förberedda för 3D-helmonteringsfärgning (alternativ a) eller inbäddade i paraffin för 2D-snittning och färgning (alternativ b). För 3D-färgningsexperiment med helmontering immunmärks fasta 3D-strukturer efter fixeringssteget. Ett valfritt optiskt rensningssteg kan utföras för att förbättra bildkvaliteten och djupet i optisk mikroskopi genom att minska ljusspridningen under bildbehandling. Bilder fångas på ett inverterat konfokalmikroskop eller ett konfokalt höginnehållssystem och analyseras med lämplig programvara. För paraffininbäddning bearbetas 3D-strukturer direkt (alternativ b.1 för stora strukturer ≥ 400 μm) eller ingår i en gel (b.2; små strukturer ≤ 400 μm) för dehydrering och paraffininbäddning. Paraffinblock skärs sedan och färgas (histologisk eller immunokemisk färgning). Bilder av 2D-sektioner erhålls på en digital bildskanner eller ett upprätt mikroskop och analyseras på en bildanalysplattform med snabb digital kvantitativ analys. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy pad Q Path blue</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes macrostar III Blc couv. Char. x1500</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassette microtwin white</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical hood</td>
			<td>Erlab</td>
			<td>FI82 5585-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips 1000 &#181;L</td>
			<td>Star lab Tip-One</td>
			<td>S1122-1730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Pyramid innovation</td>
			<td>R35002-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottom glass tubes with PTFE lined 2 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11784259</td>
			<td>Excellent&#160; for environmental&#160;&#160;&#160; samples,&#160;&#160;&#160; pharmaceuticals and diagnostic reagents. PTFE is designed for the ultimate in product safety. PTFE provides totally inert inner seal and surface facing the sample or product.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish plate 35 mm</td>
			<td>Ibedi</td>
			<td>2018003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal agitation</td>
			<td>N-BIOTEK</td>
			<td>NB-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator prewarmed to 65 &#176;C</td>
			<td>Memmert Incubator</td>
			<td>LAB129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inox molds 15x15</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-1918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides Matsunami TOMO-11/90</td>
			<td>Roche diagnostics</td>
			<td>8082286001</td>
			<td>these slides are used for a better adhesion of sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>HM340E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panoramic scan II</td>
			<td>3dhistech</td>
			<td>2397612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin embedding equipment</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette Pasteur 2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Path flacon 150mL cape blanc x250</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-1308</td>
			<td>Good for environmental&#160;&#160;&#160; samples,&#160;&#160;&#160; pharmaceuticals and diagnostic reagents. Polypropylene (PP) are rigid,&#160; solid, provide excellent&#160; stress&#160; crack&#160; and&#160; impact&#160; resistance and have a&#160; good oil and alcohol barrier and chemical resistance. PE-lined cap is stress crack resistant and offers&#160; excellent&#160; sealing&#160; characteristics.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Set of micropipettors&#160; (p200, p1000)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11877351 (20-200) 11887351(p1000)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPERA PHENIX</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>HH14000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP5 inverted confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LSM780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue cassette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-0228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiomager microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SIP 60549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoblock (kit)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10066588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57648266</td>
			<td>CAUTION: toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin aqueous 1%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT110316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83804.360</td>
			<td>CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.365</td>
			<td>CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin 4%</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>F/40877-36</td>
			<td>CAUTION: Formalin contains formaldehyde which is hazardous. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fructose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gill hematoxylin type II</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>F/CP813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td>CAUTION: Suspected of causing genetic defects.&#160; Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Wax tek III</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS) 1 X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Buffered Saline (TBS) 10X</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>F/00801</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8532</td>
			<td>CAUTION: Triton X&#173;100 is hazardous. Avoid contact with skin and eyes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>534056</td>
			<td>CAUTION: Xylene is toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Clearing solution</td>
			<td>Glycerol-Fructose clearing solution is 60% (vol/w) glycerol and 2.5 M fructose. To prepare 10 mL of this solution, mix 6 mL of glycerol and 4.5 g of fructose. Complete to 10 mL with dH2O. Use a magnetic stirrer overnight. Refractive index = 1.4688 at room temperature (RT: 19&#8211;23 &#176;C). Store at 4 &#176;C in dark for up to 1 month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">PBS-BSA 0,1% solution</td>
			<td>To prepare 0,1% (vol/wt) PBS-BSA 0,1% solution, dissolve 500 mg of BSA in 50 mL of PBS-1X (store at 4&#176;C for up to 2 weeks). And dilute 1mL of this solution into 9mL of PBS-1X. This solution can be used to precoat the tip and centrifugation tube.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Permeabilisation-blocking solution (PB solution)</td>
			<td>The PBSDT blocking solution is PBS-1X supplemented with 0.1% &#8211; 1% Tritonx-100 (depending on the protein localization membrane/nucleus), 1% DMSO, 1% BSA and 1% donkey serum (or from the animal in which the secondary antibodies were raised). This solution can be stored at 4&#176;C for up to 1 month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">PB:PBS-1X &#160;(1:10) solution</td>
			<td>PB:PBS-1X &#160;(1:10) solution is a 10 time diluted PB solution. To prepare 10 mL of this solution dilute 1 mL of PB solution in 9 mL of PBS-1X.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halo software</td>
			<td>Indicalabs</td>
			<td>NM 87114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harmony software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>HH17000010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

staining and high-resolution imaging of three-dimensional organoid and spheroid models

In vitro tredimensionella (3D) cellodlingsmodeller, såsom organoider och sfäroider, är värdefulla verktyg för många tillämpningar, inklusive utveckling och sjukdomsmodellering, läkemedelsupptäckt och regenerativ medicin. För att fullt ut utnyttja dessa modeller är det viktigt att studera dem på cellulära och subcellulära nivåer. Att karakterisera sådana in vitro 3D-cellodlingsmodeller kan dock vara tekniskt utmanande och kräver specifik expertis för att utföra effektiva analyser. Här tillhandahåller detta dokument detaljerade, robusta och kompletterande protokoll för att utföra färgning och subcellulär upplösningsavbildning av fasta in vitro 3D-cellodlingsmodeller som sträcker sig från 100 μm till flera millimeter. Dessa protokoll är tillämpliga på en mängd olika organoider och sfäroider som skiljer sig åt i deras ursprungscell, morfologi och odlingsförhållanden. Från 3D-strukturskörd till bildanalys kan dessa protokoll slutföras inom 4-5 dagar. Kortfattat samlas 3D-strukturer, fixeras och kan sedan bearbetas antingen genom paraffinininbäddning och histologisk / immunhistokemisk färgning, eller direkt immunomärkta och förberedda för optisk clearing och 3D-rekonstruktion (200 μm djup) genom konfokalmikroskopi.

Detta protokoll ger en översikt över de kritiska stegen för 2D- och 3D-helmonteringsfärgning, samt bildbehandling och kvantitativa analyser av 3D-cellodlingsmodeller (figur 3 och figur 4). Det är tillämpligt på ett brett spektrum av 3D-cellodlingsmodeller - från sfäroider till organoider från olika värdarter eller vävnader - och möjliggör förvärv av exakt och kvantitativ information om arkitektur, cellorganisation och interaktioner på cellulära och subcellulära nivåer (figur 3 och figur 4). Laboratorier kan behöva optimera 2D-histologiska och immunhistokemiska tekniker och antikroppskoncentrationer enligt sina egna behov.
Båda metoderna ger värdefull biologisk information. 3D-färgning och konfokalmikroskopi ger visuell information om cellulär sammansättning och rumslig position med ett djupfält på upp till 200 μm (figur 3B). 2D-sektionering är dock lämplig för större 3D-strukturer för att avslöja detaljerade cellulära morfologiska egenskaper i hela sektionen av 3D-strukturer som annars kan vara utmanande att observera in situ på grund av ljusspridning som äventyrar upplösningen i större prover. Dessutom kan båda teknikerna tillhandahålla kvantitativa data. Faktum är att den erhållna upplösningen möjliggör tillämpning av cellulära och subcellulära segmenteringsalgoritmer för kvantifiering av antalet celler och detektering av närvaron av olika cellmarkörer i olika cellulära subtyper (figur 3F och figur 4). Sammanfattningsvis är de avbildningstekniker som beskrivs här reproducerbara, enkla och komplementära och representerar värdefulla verktyg för att studera cellulär heterogenitet.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig03.jpg"> Figur 3: Representativa resultat för 3D-helmontering, avbildning och analyser av optiska 3D- och 2D-sektioner. (A) Konfokala bilder av människa h) Höggradigt gliomsfäroid odlat i en vecka och märkt med Hoechst (blå), Olig2 (gul) och aktin (röd) (20x vattenmål). För alla förvärvade bilder fastställdes mikroskopinställningar med hjälp av en positiv kontroll (överst), och sedan avbildades den negativa kontrollen med identiska inställningar för att kontrollera bristen på fluorescens i frånvaro av primär antikropp (botten). (B) Ortogonal 3D-helmonteringsrepresentation av Ki67-färgning utförd i (h) höggradig gliomsfäroid odlad i en vecka (glycerol-fruktosrensning; 20x vattenmål, konfokal). (C) Konfokala bilder av (h) höggradigt gliomsfäroid odlat i en vecka och märkt med Hoechst (blå), Olig2 (gul) och Phalloidine-488 (grön) (glycerol-fruktosrensning; 20x vattenmål). (D) Konfokala bilder av humana (h) rabdomyosarkom (överst) och mus (m) neurala kamceller (botten) sfäroider odlade i en vecka och märkta med Hoechst (blå), aktin (röd) respektive Ki67 (grön) (glycerol-fruktosrensning; 20x torrt mål). (E) Konfokala bilder av h) höggradigt gliomsfäroid odlat i en vecka och märkt med Hoechst (blått) och Ki67 (grönt) (glycerol-fruktosröjning; 40x vattenmål) (överst till vänster). Segmenterade bilder på Hoechst-kanalen och Ki67-positiva (+) kärnkraftsregioner på den gröna kanalen genererades med hjälp av programvara för analys med högt innehåll (se kompletterande figur 1 och materialförteckning) (nederst). Utgången som anges är procentandelen Ki67+ -kärnor per segmenterad 3D-struktur (uppe till höger). Skalstapel = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig04.jpg"> Figur 4: Representativa resultat för avbildning och analys av 2D-optiska sektioner. (A, D) 2D-sektionsbilder av en 3D-cellmodell (humana rabdomyosarkomsfäroider odlade i en månad) erhållna med en digital bildskanner och analyserade på en plattform för snabb digital kvantitativ analys. (A) H&E-färgning och detektion av celler i enlighet med deras storlek. Skalstapel = 500 μm. (B) Histogram visar procentandelen celler < 100 μm 2 och > 100 μm2 detekterade med hjälp av programvara för snabb digital kvantitativ analys (vänster: Halo) eller manuell räkning (höger: MC). (C) Ki67-färgning och detektion av celler i enlighet med intensiteten hos deras 3,3'-diaminobensidinsignal (DAB). Negativ (blå), svagt positiv (gul), positiv (röd). Skalstapel = 500 μm. (D) Histogram visar procentandelen Ki67-negativa, svagt positiva och positiva celler. Förkortningar: H&E = hematoxylin och eosin; MC = manuell räkning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
Kompletterande figur 1: Översikt över stegen i programvaran för bildanalys. Analyserna bygger på associationen mellan byggstenar. Varje byggsten motsvarar en funktionssegmentering, beräkning, association, utdatadefinition - och erbjuder flera algoritmer och variabelval för att matcha det biologiska provet som avbildas. Programvaran tillhandahåller flera RMS-analysprotokoll (Ready Made Solution) som enkelt kan användas och modifieras. Integrerade bildanalysprotokoll kan sparas, tillämpas på olika datauppsättningar och delas mellan användare. Kortfattat innebär analysprotokollet sekventiell objektsegmentering: sfäroid, kärnor och slutligen Ki67-fickor (A488). Därefter beräknas den genomsnittliga intensiteten hos Ki67-fickorna för att ytterligare diskriminera de positiva händelserna. Slutligen väljs kärnor som omfattar Ki67-positiva fickor positivt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/Suppl1_Harmony%20analysis_Revised.pdf" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande figur 2: Översikt över procedurstegen i programvaran för kvantitativ analys. Steg 1. Ladda upp filerna med hjälp av fliken Studier. Filer öppnas i avsnittet Bildåtgärder. Steg 2. Öppna fliken Anteckningar och klicka sedan på Lageråtgärder för att designa ett nytt lager runt strukturen med hjälp av cirkelverktyget i verktygsfältet. För icke-cirkulära strukturer kan pennverktyget användas istället. Steg 3. Verktygsfältet kan användas för att designa anteckningar och visualisera kvantifieringen med <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62280/62280eq01.jpg">verktyget. Steg 4. Öppna fliken Analys och välj de bästa förutsättningarna för analys av provet (flera försök kan vara nödvändiga här). Steg 4.1. Använd avsnittet Fläckmarkering för att ställa in färgningstillståndet. I händelse av flera fläckar kan dessa läggas till och byta namn, och den virtuella färgen kan ändras. Lokaliseringsdetekteringen kan specificeras - nukleär eller cytoplasmafärgning. Steg 4.2. Använd avsnittet Cellidentifiering för att konfigurera cellidentifieringen. Detta avsnitt kommer att vara det viktigaste för analysen. Avsnittet Nuclear Contrast Threshold möjliggör detektion av alla kärnor. Uppmärksamhet måste ägnas om det finns flera befolkningsstorlekar, programvaran kan upptäcka flera celler istället för en unik stor. Avsnitt om kärnstorlek och kärnsegmenteringsaggressivitet kan användas för att kvantifiera populationsintervall för cellstorlek. Steg 5. Beskrivning av hur du kör provanalys. Följ stegen som visas i figuren. Avsnittet Anteckningslager kör bara inställningen på den här bilden. Kvantifieringen kan visualiseras med hjälp av <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62280/62280eq01.jpg">verktyget. Upprepa steg 4.1-5 tills lämplig kvantifiering uppnås. Steg 6–6.1. Med dessa steg kan du rita en figur med programvaran. Steg 7. Kvantifieringsgrafik som erhållits via programvara kan sparas. Steg 8. Data kan exporteras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/Suppl2_Halo%20Images_revised.pdf" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models at JoVE.com

Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

Här tillhandahåller vi detaljerade, robusta och kompletterande protokoll för att utföra färgning och subcellulär upplösningsavbildning av fasta tredimensionella cellodlingsmodeller som sträcker sig från 100 μm till flera millimeter, vilket möjliggör visualisering av deras morfologi, celltypskomposition och interaktioner.

Färgning och högupplöst avbildning av tredimensionella organoid- och sfäroidmodeller

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...

Att karakterisera 3D in vitro-modell med cellulär och subcellulär upplösning är avgörande för fullt utnyttjande, men kan vara utmanande. Därför har vi tillhandahållit kompletterande protokoll för färgning och subcellulär upplösningsavbildning av fasta 3D in vitro-modeller som sträcker sig från 100 mikrometer till flera millimeter. 3D-strukturer är radiella och bör manipuleras noggrant.Innan pipettering, kontrollera placeringen av dina 3D-strukturer i röret för att undvika aspiration. Eftersom vi har anpassat klassiska tekniker för inbäddning av små strukturer som organoider eller sfäroider, kan visualiserade instruktioner hjälpa förstagångsanvändare att utföra uppgiften lättare. Att demonstrera proceduren med mig kommer att vara Laura Francols, en laboratorieteknik från patologiforskningsplattformen.För att förbereda prover för 3D-färgning av hela monteringen, använd en en milliliter pipettspets förkodad med BSA för att lägga till en en milliliter 3D-struktursuspension till ett 500 mikroliter rör PBS. När 3D-strukturerna har lagt sig till botten av röret, byt försiktigt ut PBS med 500 mikroliter permeabiliseringsblockerande lösning för en timmes inkubation vid rumstemperatur med mild horisontell omrörning vid 30 till 50 varv per minut. Vid slutet av inkubationen, låt 3D-strukturerna sedimentera igen innan du försiktigt tvättar 3D-strukturerna två gånger i en milliliter 0,1% PBS kompletterat med BSA i tre minuter per tvätt.Efter den sista tvätten, märk 3D-strukturerna med 250 mikroliter primär antikropp i PBS i två till tre dagar med mild horisontell omrörning vid fyra grader Celsius. Vid slutet av inkubationen, tvätta provet med fem tre minuters och två 15 minuters tvättar i en milliliter 0,1% PBS BSA per tvätt. Efter den sista tvätten, märk 3D-strukturerna med 250 mikroliter av lämplig sekundär antikropp i PBS i 24 timmar vid fyra grader Celsius med mild horisontell omrörning skyddad från ljus.Nästa dag, märk 3D-strukturerna med 250 mikroliter av lämplig koncentration av Hoechst 3342 för en två timmars inkubation vid fyra grader Celsius med mild horisontell omrörning. Vid slutet av inkubationen tvättas 3D-strukturerna fem gånger i tre minuter och två gånger i 15 minuter i en milliliter PBS per tvätt enligt beviset. Efter den sista tvätten, överför 3D-strukturerna till en 96 brunn svart polystyrenmikroplatta och tillsätt försiktigt 200 mikroliter rensningslösning på strukturerna och undvik bubblor.Placera sedan plattan täckt med aluminiumfolie vid fyra grader Celsius i minst 48 timmar. För att bädda in stora 3D-cellodlingsmodeller, använd en BSA-belagd en milliliter pipettspets för att försiktigt överföra 3D-strukturerna till ett platt bottenglasrör med ett PTFE-fodrat flasklock. När strukturerna har lagt sig, byt försiktigt ut PBS med 70% etanol under en 30 minuters inkubation vid rumstemperatur.Vid slutet av inkubationen, ersätt 70% etanol med en milliliter färdig att använda eosin Y-lösning. Knäpp röret och färga strukturerna i minst 30 minuter. Vid slutet av inkubationen, dehydrera strukturerna med tre på varandra följande 30 minuters tvättar i en milliliter 100% etanol per tvätt.Efter den sista uttorkningen, rensa 3D-strukturerna med tre på varandra följande 30 minuters tvättar i en milliliter xylen per tvätt under en kemisk huva. Efter den sista xylennedsänkningen, placera en bit xylenblöt biopsiplatta i ett fack i en vit mikrotvillingvävnadskassett och använd en BSA-belagd två milliliter plastpasteurpipett för att överföra 3D-strukturerna på dynan. Täck 3D-strukturerna med en annan xylenindränkt biopsidyna för att hålla 3D-strukturerna på plats och stäng kassetten.När alla prover har överförts, placera kassetterna i ett 65 grader Celsius paraffinbad i 30 minuter innan du placerar kassetterna i ett nytt 65 grader Celsius paraffinbad över natten. Nästa morgon, tillsätt flytande paraffin till en 65 grader Celsius uppvärmd inbäddningsform per prov och placera ett paraffinbäddat prov i varje form. Skaka försiktigt formarna tills alla 3D-strukturer faller till botten och använd 65 grader Celsius värmda fina pincett för att placera 3D-strukturerna i mitten av varje form.Kyl formen tills paraffinet bildar ett tunt fast skikt och säkrar 3D-strukturen på plats. Lägg en vävnadskassett och tillsätt hett paraffin över formen. Ta bort formen när paraffinet har stelnat helt.För att bädda in små 3D-cellodlingsmodeller, tvätta försiktigt 3D-strukturerna tre gånger i en milliliter TBS per tvätt. Efter den sista tvätten, ta bort så mycket TBS som möjligt utan att vidröra strukturerna och tillsätt två droppar reagens två från ett kommersiellt paraffinbäddningssats. Blanda försiktigt genom att knacka och tillsätt två droppar reagens, en med tappning, tills gelén stelnar.Använd fina pincett för att överföra gelen från brunnen på den förmonterade kassetten från satsen och torka ut det gelinbäddade provet med 30 minuters stigande etanol- och xyleninkubationer i en dragskåp enligt anvisningarna. Efter den sista xylennedsänkningen, placera kassetten i ett 65 grader Celsius paraffinbad över natten innan du använder fina pincett för att överföra det paraffininbäddade provet till mitten av en flytande paraffinladdad 65 grader Celsius uppvärmd inbäddningsform. Säkra sedan 3D-strukturen med ytterligare ett lager paraffin, vilket demonstreras för de stora 3D-cellodlingsmodellerna.Tredimensionell helfattningsfärgning och konfokalmikroskopi ger visuell information om 3D-odlingsmodellernas cellulära sammansättning och rumsliga position till ett djupfält på upp till 200 mikron. Den höga upplösningen som kan erhållas för 3D-strukturer med hjälp av detta protokoll möjliggör tillämpning av cellulära och subcellulära segmenteringsalgoritmer för kvantifiering av cellantalet och detektering av olika cellmarkörer inom olika cellsubtyper. 3D-analys av hela fästen kan tillämpas på visualiserade celler upp till 200 mikron djupgående, oavsett hela strukturerna.Tvärtom kan 2D-sektionsanalys ge insikter i celler av alla storlekar.

Research

JoVE Journal

Biology

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Högupplöst Mätning av Lukt-Driven Beteende i Drosophila Larver

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronal cellkulturer från Aplysia för högupplöst avbildning av tillväxt Kottar

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the IÃƒâ€šÃ‚Â·Cryo Kit

Mus Spermier Frysförvaring and Recovery med I · Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

Isolering av bröstepitelialceller celler från tre-dimensionell Mixed-cell sfäroid Co-kultur

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Två-och tredimensionell levande cell imaging av svar DNA-skador Proteiner

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Långsiktigt hög upplösning Confocal Time lapse avbildning av<em&gt; Arabidopsis Hjärtblad</em&gt; Epidermis under groning

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

Använda högupplöst datortomografi för att visualisera den tredimensionella strukturen och funktion växt kärlsystem

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Mus Fetal Hela tarm Kultur System för<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Manipulering av signaleringsvägar och Tredimensionell Live avbildning av Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

FRET Imaging i Tredimensionella Hydrogeler

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Högupplöst time-lapse avbildning och automatiserad analys av mikrotubuli Dynamics i Living Human navelsträngsvenendotelceller

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...