Name: staining and high-resolution imaging of three-dimensional organoid and spheroid models
Uploaded: 2021-03-27T14:00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models at JoVE.com

Bu çalışma, St Baldrick'in Robert J. Arceci İnovasyon Ödülü #604303 tarafından desteklenmiştir.

<ol>
	<li>Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+system+methods+and+applications+for+mesenchymal+stem+cells.">Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells.</a> Cells. 8 (12), 1-13 (2019).</li><li>Bartfeld, S., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+organoids+and+their+application+for+medical+research+and+patient+treatment.">Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment.</a> Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).</li><li>Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+multicellular+spheroids+formation.">Advances in multicellular spheroids formation.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 14 (127), (2017).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation.">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1724-1743 (2016).</li><li>Rezanejad, H., Lock, J. H., Sullivan, B. A., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+pancreatic+ductal+organoids+and+whole-mount+immunostaining+of+intact+organoids.">Generation of pancreatic ductal organoids and whole-mount immunostaining of intact organoids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 82 (2019).</li><li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+systems+and+their+applications+in+drug+discovery+and+cell-based+biosensors.">Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).</li><li>McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+and+assessment+of+human+primary+prostate+organoid+culture.">Handling and assessment of human primary prostate organoid culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e59051 (2019).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li><li>Lazzari, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+fluorescence+microscopy+versus+confocal+microscopy:+in+quest+of+a+suitable+tool+to+assess+drug+and+nanomedicine+penetration+into+multicellular+tumor+spheroids.">Light sheet fluorescence microscopy versus confocal microscopy: in quest of a suitable tool to assess drug and nanomedicine penetration into multicellular tumor spheroids.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 142, 195-203 (2019).</li><li>Gabriel, J., Brennan, D., Elisseeff, J. H., Beachley, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+embedding/sectioning+for+parallel+analysis+of+3D+cell+spheroids.">Microarray embedding/sectioning for parallel analysis of 3D cell spheroids.</a> Scientific Reports. 9, 16287 (2019).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Hücre kültürü, doku ve organ gelişimi, fonksiyonu, yenilenmesi ve bozulması ve hastalıkta rol oynayan temel biyolojik mekanizmaları ortaya çıkarmak için vazgeçilmez bir araçtır. Tek katmanlı 2D hücre kültürü baskın olmasına rağmen, son araştırmalar, özellikle gen ekspresyonunu ve hücresel davranışı etkileyen ve böylece daha öngörücü veriler sağlayabilen ek mekansal organizasyon ve hücre-hücre temasları nedeniyle, in vivo hücresel tepkileri daha fazla yansıtan 3D yapılar üreten kültürlere doğru kaymıştır7. Bununla birlikte, ayrıntılı mikroskobik görselleştirme ve hücresel ve hücre altı seviyelerde karmaşık 3D yapıların değerlendirilmesi için kullanıcı dostu boyama ve görüntüleme tekniklerine duyulan ihtiyaç da dahil olmak üzere birçok zorluk devam etmektedir. Bu bağlamda, 100 μm ila birkaç milimetre arasında değişen sabit in vitro 3D hücre kültürü modellerinin boyama ve hücresel ve hücre altı çözünürlüklü görüntülemesini gerçekleştirmek için ayrıntılı, sağlam ve tamamlayıcı protokoller sağlanmıştır.
Bu prosedür, in vitro 3D hücre kültürü modellerinin çok çeşitli boyut ve tipleriyle başa çıkmak için iki farklı strateji sunar. Birinin (3B tam montaj analizi) veya diğerinin (2B kesit analizi) seçimi, kullanılan modele ve araştırılan konuya bağlı olacaktır. Konfokal mikroskopi ile 3D tam montajlı analiz, 3D yapının genel boyutuna bakılmaksızın 200 μm'ye kadar derinlik alanına sahip hücrelerin görselleştirilmesini sağlarken, 2D kesitleme herhangi bir boyuttaki örneklere uygulanabilir, ancak görselleştirme 2D boyutlu kalır. Aşağıda, sorun giderme ve teknik hususlarla ilgili bazı öneriler verilmiştir.
İş akışı sırasında 3D yapıların kaybı en yaygın dezavantajdır. Uçlara ve tüplere yapışkan kalabilirler, bu nedenle PBS-BSA% 0.1 çözeltisi ile ön kaplama uçları ve tüpleri anahtardır. Ayrıca, reaktif değişimleri arasındaki 3D yapıların tortu oluşturmasına izin vermek ve tüm pipetlemeyi çok dikkatli bir şekilde gerçekleştirmek çok önemlidir. Prosedürde de belirtildiği gibi, tüm adımlar için, 3D yapı çökeltmesi çok uzunsa, hücreler RT'de 5 dakika boyunca 50 × g'da hafifçe döndürülebilir. çalışmanın amacına bağlı olarak, böyle bir eğirme adımının avantajları / dezavantajları, santrifüjlemenin 3D yapıların şeklini tehlikeye atabileceği düşünülmelidir. Ayrıca, fiksasyon aşamasında bu morfolojiyi korumaya özen gösterilmelidir, çünkü kistik organoidler çökme eğilimindedir. 400 μm boyutunun altındaki yapıların sabitlenmesi yapısal değişiklikleri önlemelidir.
Optimal immünoetiketleme için, organoidlerin 3D matrislerinden geri kazanılması çok önemli bir adımdır. 3D matris, yeterli antikor penetrasyonunu engelleyebilir veya matrise spesifik olmayan bağlanma nedeniyle yüksek arka plan boyamasına neden olabilir. ECM'nin çıkarılması, organoidlerin dış segmentlerinin morfolojisini değiştirebilir (özellikle çalışılan 3D yapılardan uzanan küçük hücresel çıkıntılar durumunda) ve kısmen analizleri engelleyebilir. Bu tür 3D yapılar için, matris prosedür boyunca korunabilir; Bununla birlikte, çözeltilerin ve antikorların yetersiz penetrasyonunu önlemek ve aşırı arka plan gürültüsünü azaltmayı amaçlayan ardışık yıkama adımlarından kaçınmak için kültür koşulları, hücrelerin minimum miktarda matriste büyümesine dikkatlice uyarlanmalıdır 6,8.
3D tam montaj boyama bölümünde bu protokolde açıklanan optik temizleme adımı, 3D yapıların temizlenmeden 50-80 μm yerine 150-200 μm derinliğe kadar görüntülenmesi için uygundur. Genellikle birkaç hafta süren ve toksik temizleme ajanları kullanan diğer takas metodolojileriyle karşılaştırıldığında, bu protokolde daha önce yayınlanmış hızlı ve güvenli bir temizleme adımı kullanılmıştır 4,9. Ek olarak, bu temizleme adımı geri dönüşümlüdür ve çözünürlük veya parlaklık kaybı olmadan ilk boyamaya yeni antikorlar eklenebilir4. Bununla birlikte, incelenen 3D hücre kültürü modeline bağlı olarak, 3D yapıyı bilgilendirici bir şekilde görüntülemek için 150-200 μm'lik bir derinlik yeterli olmayabilir ve bu temizleme protokolü, büyük lümenli küresel, tek katmanlı organoidlerin genel morfolojisinde değişikliklere neden olabilir4. Kullanıcılar deneylerini dikkatlice tasarlamalı ve gerekirse, geçirgenleştirme / blokaj adımının zamanlamasını optimize etmeli (antikorların ve çözeltinin penetrasyonuna izin vermek için), temizleme adımı (200 μm'den daha derine nüfuz etmek için, örnekler tamamen temizlenmelidir) ve görüntü elde edilmelidir. Çekirdek tesislerde mevcut olan en yaygın iki teknoloji, ışık tabakası ve konfokal mikroskopi olacaktır. Kullanıcıların 3D yapılarının büyüklüğüne ve biyolojik soru10'a göre dikkatlice bir teknoloji seçmeleri gerekecektir. Bununla birlikte, konfokal mikroskopi ile karşılaştırıldığında, bu tür derin yapılar için elde edilen ışık tabakası mikroskobu çözünürlüğü, hücre altı çözünürlük elde etmek için yetersiz kalmaktadır.
Burada, tek numunelerin parafin gömülmesine adanmış ayrıntılı ve sağlam bir süreç bildirilmiştir. İlginçtir ki, Gabriel ve ark. yakın zamanda 3D hücre kültürlerini parafine artan bir verimle gömen bir protokol geliştirdiler. 96 3D yapıyı bir mikroarray deseninde bir blokta sınırlamak için bir polidimetilsiloksan (PDMS) kalıbı kullandılar ve daha fazla grubu, zaman noktasını, tedavi koşullarını kapsayan 3D tümör modelleri üzerindeki çalışmalar için yeni perspektifler sağladılar ve11'i kopyaladılar. Bununla birlikte, bu yöntem, özellikle PDMS kalıpları oluşturmak için kullanılan ön kalıbın imalatı için kapsamlı beceriler ve makineler gerektirir.
Özetle, bu makalede, 3D hücresel modellerin mimari ve hücresel bileşimi hakkında doğru ve nicel bilgilerin edinilmesini sağlayan iki farklı, tamamlayıcı ve uyarlanabilir yaklaşım açıklanmaktadır. Her iki parametre de intratümöral hücresel heterojenite ve tedavilere dirençteki rolü gibi biyolojik süreçleri incelemek için çok önemlidir.

Son yıllarda, kök hücre biyolojisindeki ve in vitro 3D kültür teknolojilerindeki ilerlemeler, biyoloji ve tıpta bir devrimin habercisidir. 3B'deki daha yüksek karmaşıklıktaki hücre modelleri, hücrelerin büyümesine ve çevredeki hücre dışı bir çerçeveyle etkileşime girmesine, mimarileri, hücre organizasyonu ve etkileşimleri ve hatta difüzyon özellikleri de dahil olmak üzere canlı dokuların yönlerini yakından özetlemesine izin verdiği için çok popüler hale gelmiştir. Bu nedenle, 3D hücre kültürü modelleri, hücrelerin in vitro olarak gelişmekte olan veya hastalıklı dokulardaki davranışları hakkında benzersiz bilgiler sağlayabilir. Organoidler ve sferoidler, birkaç mikrometreden milimetreye kadar değişen çok hücreli 3D yapılardır ve en belirgin in vitro 3D yapılardır. Her ikisi de (i) hayvanlardan (bazal membran ekstresi, kollajen), bitkilerden (aljinat / agaroz) türetilen hidrojeller veya kimyasallardan sentezlenen hidrojeller veya (ii) hücre çoğalmasını ve büyümesini teşvik etmek için gözenekler içeren inert matrisler dahil olmak üzere destekleyici bir iskele içinde kültürlenebilir.
Organoidler ve sferoidler, kümeler halinde kendi kendine bir araya gelmek için hücrelere güvenerek destekleyici bir iskelenin varlığı olmadan da gelişebilir. Bu, hücre tutturmasını, yüzey gerilimini ve yerçekimi kuvvetini (örneğin, asılı damla teknikleri) veya damarların sürekli dairesel dönüşünü (örneğin, iplikçi kültürü) inhibe etmek için yapışkan olmayan malzemelerin kullanılması gibi farklı tekniklere dayanır. Her durumda, bu teknikler geleneksel tek katmanlı hücre kültürünün sınırlamalarının üstesinden gelmek için hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimlerini kolaylaştırır1. "Organoidler" ve "sferoidler" terimleri geçmişte birbirinin yerine kullanılmıştır, ancak bu iki 3D hücre kültürü modeli arasında önemli farklılıklar vardır. Organoidler, pluripotent kök hücrelerden veya dokuya özgü kök hücrelerden türetilen, hücrelerin kendiliğinden progenitörlere ve farklılaşmış hücre tiplerine organize olduğu ve ilgilenilen organın en azından bazı işlevlerini özetlediği in vitro 3D hücresel kümelerdir2. Sferoidler, yapışkan olmayan koşullar altında oluşan çok hücreli 3D yapıların daha geniş bir yelpazesini içerir ve ölümsüzleştirilmiş hücre hatları veyabirincil hücreler 3 gibi çok çeşitli hücre tiplerinden kaynaklanabilir. Bu nedenle, içsel kök hücre kökenlerine özgü olarak, organoidler sferoidlerden daha yüksek bir kendi kendine montaj, canlılık ve stabilite eğilimine sahiptir.
Bununla birlikte, özünde, bu iki model çoklu hücrelerden oluşan 3B yapılardır ve bunları incelemek için geliştirilen teknikler bu nedenle çok benzerdir. Örneğin, hem organoidlerin hem de sferoidlerin hücresel karmaşıklığını araştırmak için tek hücreli çözünürlük düzeyinde güçlü görüntüleme yaklaşımları gereklidir. Burada, bu grubun uzmanlığını ve organoidler4 alanındaki liderlerin uzmanlığını özetleyerek, bu makalede, 100 μm ila birkaç milimetre arasında değişen organoidlerin ve sferoidlerin hücresel ve hücre altı bileşiminin ve mekansal organizasyonunun iki boyutlu (2D) ve 3D tam montajlı boyama, görüntüleme ve analizlerini gerçekleştirmek için ayrıntılı prosedürler açıklanmaktadır. Gerçekten de, bu prosedür, in vitro 3D hücre kültürü modellerinin çok çeşitli boyutlarını ve türlerini analiz etmek için iki farklı ve tamamlayıcı tipte boyama ve görüntüleme kazanımı sunar. Birinin (3D tam montaj analizi) veya diğerinin (2D kesit analizi) kullanımı, çalışılan modele ve aranan cevaplara bağlı olacaktır. Konfokal mikroskopi ile 3D tam montaj analizi, örneğin, 3D yapının genel boyutuna bakılmaksızın, 3D kültürdeki hücreleri 200 μm derinliğe kadar görselleştirmek için uygulanabilirken, 2D bölümlerin analizi, 2D seviyesinde de olsa herhangi bir boyuttaki örnekler hakkında fikir verir. Bu prosedür, farklı embriyonik germ katmanlarından kaynaklanan, insan ve murin hücrelerinden türetilen çeşitli organoidler 4,5 ve sferoidler arasında başarıyla uygulanmıştır. Prosedüre genel bakış Şekil 1'de gösterilmiştir. Ana aşamalar, aralarındaki ilişkiler, belirleyici adımlar ve beklenen zamanlama belirtilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig01.jpg"> Şekil 1: Prosedüre şematik genel bakış. In vitro 3D hücre kültürü modelleri toplanır ve sabitlenir, daha sonra 3D tam montaj boyama için hazırlanır (seçenek a) veya 2D kesitleme ve boyama için parafine gömülür (seçenek b). 3D tam montajlı boyama deneyleri için, sabit 3D yapılar, fiksasyon adımını takiben immüno-etiketlidir. Görüntü işleme sırasında ışık saçılımını azaltarak görüntüleme kalitesini ve optik mikroskopinin derinliğini artırmak için isteğe bağlı bir optik temizleme adımı gerçekleştirilebilir. Görüntüler ters çevrilmiş bir konfokal mikroskopta veya konfokal yüksek içerikli bir sistemde yakalanır ve uygun yazılım kullanılarak analiz edilir. Parafin gömme için, 3D yapılar doğrudan işlenir (400 μm'≥ büyük yapılar için seçenek b.1) veya dehidrasyon ve parafin gömme için bir jele (b.2; 400 μm'≤ küçük yapılar) dahil edilir. Parafin blokları daha sonra kesilir ve boyanır (histolojik veya immünokimyasal boyama). 2D kesitlerin görüntüleri dijital slayt tarayıcı veya dik mikroskop üzerinde elde edilir ve hızlı dijital kantitatif analiz kullanılarak bir görüntü analiz platformunda analiz edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy pad Q Path blue</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes macrostar III Blc couv. Char. x1500</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassette microtwin white</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical hood</td>
			<td>Erlab</td>
			<td>FI82 5585-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips 1000 &#181;L</td>
			<td>Star lab Tip-One</td>
			<td>S1122-1730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Pyramid innovation</td>
			<td>R35002-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottom glass tubes with PTFE lined 2 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11784259</td>
			<td>Excellent&#160; for environmental&#160;&#160;&#160; samples,&#160;&#160;&#160; pharmaceuticals and diagnostic reagents. PTFE is designed for the ultimate in product safety. PTFE provides totally inert inner seal and surface facing the sample or product.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish plate 35 mm</td>
			<td>Ibedi</td>
			<td>2018003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal agitation</td>
			<td>N-BIOTEK</td>
			<td>NB-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator prewarmed to 65 &#176;C</td>
			<td>Memmert Incubator</td>
			<td>LAB129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inox molds 15x15</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-1918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides Matsunami TOMO-11/90</td>
			<td>Roche diagnostics</td>
			<td>8082286001</td>
			<td>these slides are used for a better adhesion of sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>HM340E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panoramic scan II</td>
			<td>3dhistech</td>
			<td>2397612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin embedding equipment</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette Pasteur 2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Path flacon 150mL cape blanc x250</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-1308</td>
			<td>Good for environmental&#160;&#160;&#160; samples,&#160;&#160;&#160; pharmaceuticals and diagnostic reagents. Polypropylene (PP) are rigid,&#160; solid, provide excellent&#160; stress&#160; crack&#160; and&#160; impact&#160; resistance and have a&#160; good oil and alcohol barrier and chemical resistance. PE-lined cap is stress crack resistant and offers&#160; excellent&#160; sealing&#160; characteristics.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Set of micropipettors&#160; (p200, p1000)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11877351 (20-200) 11887351(p1000)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPERA PHENIX</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>HH14000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP5 inverted confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LSM780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue cassette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-0228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiomager microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SIP 60549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoblock (kit)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10066588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57648266</td>
			<td>CAUTION: toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin aqueous 1%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT110316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83804.360</td>
			<td>CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.365</td>
			<td>CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin 4%</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>F/40877-36</td>
			<td>CAUTION: Formalin contains formaldehyde which is hazardous. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fructose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gill hematoxylin type II</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>F/CP813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td>CAUTION: Suspected of causing genetic defects.&#160; Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Wax tek III</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS) 1 X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Buffered Saline (TBS) 10X</td>
			<td>Microm Microtech France</td>
			<td>F/00801</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8532</td>
			<td>CAUTION: Triton X&#173;100 is hazardous. Avoid contact with skin and eyes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>534056</td>
			<td>CAUTION: Xylene is toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Clearing solution</td>
			<td>Glycerol-Fructose clearing solution is 60% (vol/w) glycerol and 2.5 M fructose. To prepare 10 mL of this solution, mix 6 mL of glycerol and 4.5 g of fructose. Complete to 10 mL with dH2O. Use a magnetic stirrer overnight. Refractive index = 1.4688 at room temperature (RT: 19&#8211;23 &#176;C). Store at 4 &#176;C in dark for up to 1 month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">PBS-BSA 0,1% solution</td>
			<td>To prepare 0,1% (vol/wt) PBS-BSA 0,1% solution, dissolve 500 mg of BSA in 50 mL of PBS-1X (store at 4&#176;C for up to 2 weeks). And dilute 1mL of this solution into 9mL of PBS-1X. This solution can be used to precoat the tip and centrifugation tube.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Permeabilisation-blocking solution (PB solution)</td>
			<td>The PBSDT blocking solution is PBS-1X supplemented with 0.1% &#8211; 1% Tritonx-100 (depending on the protein localization membrane/nucleus), 1% DMSO, 1% BSA and 1% donkey serum (or from the animal in which the secondary antibodies were raised). This solution can be stored at 4&#176;C for up to 1 month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">PB:PBS-1X &#160;(1:10) solution</td>
			<td>PB:PBS-1X &#160;(1:10) solution is a 10 time diluted PB solution. To prepare 10 mL of this solution dilute 1 mL of PB solution in 9 mL of PBS-1X.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halo software</td>
			<td>Indicalabs</td>
			<td>NM 87114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harmony software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>HH17000010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

staining and high-resolution imaging of three-dimensional organoid and spheroid models

Organoidler ve sferoidler gibi in vitro üç boyutlu (3D) hücre kültürü modelleri, geliştirme ve hastalık modellemesi, ilaç keşfi ve rejeneratif tıp dahil olmak üzere birçok uygulama için değerli araçlardır. Bu modellerden tam olarak yararlanmak için, onları hücresel ve hücre altı seviyelerde incelemek çok önemlidir. Bununla birlikte, bu tür in vitro 3D hücre kültürü modellerini karakterize etmek teknik olarak zor olabilir ve etkili analizler yapmak için özel uzmanlık gerektirir. Burada, bu makale, 100 μm ila birkaç milimetre arasında değişen sabit in vitro 3D hücre kültürü modellerinin boyama ve hücre altı çözünürlükte görüntülenmesini gerçekleştirmek için ayrıntılı, sağlam ve tamamlayıcı protokoller sunmaktadır. Bu protokoller, menşe hücreleri, morfolojileri ve kültür koşullarında farklılık gösteren çok çeşitli organoidlere ve sferoidlere uygulanabilir. 3D yapı hasadından görüntü analizine kadar bu protokoller 4-5 gün içinde tamamlanabilir. Kısaca, 3D yapılar toplanır, sabitlenir ve daha sonra parafin gömme ve histolojik / immünohistokimyasal boyama yoluyla işlenebilir veya doğrudan immüno-etiketlenebilir ve konfokal mikroskopi ile optik temizleme ve 3D rekonstrüksiyon (200 μm derinlik) için hazırlanabilir.

Bu protokol, 2D ve 3D tam montajlı boyama için kritik adımların yanı sıra 3D hücre kültürü modellerinin görüntüleme ve kantitatif analizlerine genel bir bakış sağlar (Şekil 3 ve Şekil 4). Sferoidlerden farklı konakçı türlerden veya dokulardan organoidlere kadar çok çeşitli 3D hücre kültürü modellerine uygulanabilir ve mimari, hücre organizasyonu ve hücresel ve hücre altı düzeylerdeki etkileşimler hakkında doğru ve nicel bilgilerin edinilmesini sağlar (Şekil 3 ve Şekil 4). Laboratuvarların 2D histolojik ve immünohistokimyasal teknikleri ve antikor konsantrasyonlarını kendi ihtiyaçlarına göre optimize etmeleri gerekebilir.
Her iki yöntem de değerli biyolojik bilgiler verir. 3D tam montajlı boyama ve konfokal mikroskopi, 200 μm'ye kadar derinlik alanına sahip hücresel kompozisyon ve uzamsal konum hakkında görsel bilgi sağlar (Şekil 3B). Bununla birlikte, 2B bölümleme, daha büyük 3B yapıların tüm bölümünde, daha büyük örneklerde çözünürlüğü tehlikeye atan ışık saçılması nedeniyle yerinde gözlemlemek zor olabilecek ayrıntılı hücresel morfolojik özellikleri ortaya çıkarmak için daha büyük 3B yapılar için uygundur. Dahası, her iki teknik de nicel veriler sağlayabilir. Gerçekten de, elde edilen çözünürlük, hücre sayısının ölçülmesi ve farklı hücresel alt tiplerde çeşitli hücre belirteçlerinin varlığının tespiti için hücresel ve hücre altı segmentasyon algoritmalarının uygulanmasına izin verir (Şekil 3F ve Şekil 4). Özetle, burada açıklanan görüntüleme teknikleri tekrarlanabilir, basit ve tamamlayıcıdır ve hücresel heterojenliği incelemek için değerli araçları temsil eder.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig03.jpg"> Şekil 3: 3D tüm montaj, görüntüleme ve 3D ve 2D optik kesitlerin analizleri için temsili sonuçlar . (A) Bir hafta boyunca kültürlenmiş ve Hoechst (mavi), Olig2 (sarı) ve Aktin (kırmızı) (20x su hedefi) ile etiketlenmiş insan (h) yüksek dereceli glioma sferoidinin konfokal görüntüleri. Elde edilen tüm görüntüler için, mikroskop ayarları pozitif bir kontrol (üstte) kullanılarak oluşturuldu ve daha sonra negatif kontrol, birincil antikor yokluğunda (altta) floresan eksikliğini kontrol etmek için aynı ayarlar kullanılarak görüntülendi. (B) Bir hafta boyunca kültürlenmiş (h) yüksek dereceli glioma sferoidinde gerçekleştirilen Ki67 boyamasının ortogonal 3D tam montajlı gösterimi (gliserol-fruktoz temizleme; 20x su hedefi, konfokal). (C) Bir hafta boyunca kültürlenmiş ve Hoechst (mavi), Olig2 (sarı) ve Phalloidine-488 (yeşil) (gliserol-fruktoz temizleme; 20x su hedefi) ile etiketlenmiş (h) yüksek dereceli glioma sferoidinin konfokal görüntüleri. (D) İnsan (h) rabdomiyosarkom (üstte) ve fare (m) nöral krest hücresi (altta) sferoidlerinin bir hafta boyunca kültürlenmiş ve sırasıyla Hoechst (mavi), Aktin (kırmızı) ve Ki67 (yeşil) ile etiketlenmiş konfokal görüntüleri (gliserol-fruktoz temizleme; 20x kuru hedef). (E) Bir hafta boyunca kültürlenmiş ve Hoechst (mavi) ve Ki67 (yeşil) (gliserol-fruktoz temizleme; 40x su hedefi) (sol üstte) ile etiketlenmiş (h) yüksek dereceli glioma sferoidinin konfokal görüntüleri. Hoechst kanalındaki bölümlere ayrılmış görüntüler ve yeşil kanaldaki Ki67-pozitif (+) nükleer bölgeler, yüksek içerikli analiz yazılımı kullanılarak oluşturulmuştur (Ek Şekil 1 ve Malzeme Tablosuna bakınız) (altta). Verilen çıktı, segmente edilmiş 3D yapı başına Ki67+ çekirdeğinin yüzdesidir (sağ üstte). Ölçek çubuğu = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig04.jpg"> Şekil 4: Dijital slayt tarayıcı ile elde edilen ve hızlı dijital kantitatif analiz için bir platformda analiz edilen bir 3D hücre modelinin (bir ay boyunca kültürlenmiş insan rabdomiyosarkom sferoidleri) 2D kesit görüntüleri. (A, D) 2D kesit görüntüleri. (A) H&E boyama ve hücrelerin boyutlarına göre tespiti. Ölçek çubuğu = 500 μm. (B) Histogram, hızlı dijital kantitatif analiz (solda: Halo) veya manuelsayım (sağda: MC) için yazılım kullanılarak tespit edilen 100 μm2 ve < 100μm2'> hücrelerin yüzdesini gösterir. (C) Ki67 boyama ve hücrelerin 3,3'-diaminobenzidin (DAB) sinyallerinin yoğunluğuna göre tespiti. Negatif (mavi), zayıf pozitif (sarı), pozitif (kırmızı). Ölçek çubuğu = 500 μm. (D) Histogram, Ki67-negatif, zayıf pozitif ve pozitif hücrelerin yüzdesini gösterir. Kısaltmalar: H & E = hematoksilin ve eozin; MC = manuel sayma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 1: Görüntüleme analiz yazılımındaki adımlara genel bakış. Analizler yapı taşlarının ilişkisine dayanmaktadır. Bir fonksiyon segmentasyonuna, hesaplamaya, ilişkilendirmeye, çıktı tanımına karşılık gelen her yapı taşı ve görüntülenen biyolojik numuneyle eşleşmesi için çoklu algoritmalar ve değişken seçimleri sunar. Yazılım, kolayca kullanılabilen ve değiştirilebilen birden fazla RMS (Hazır Çözüm) analiz protokolü sağlar. Entegre görüntü analizi protokolleri kaydedilebilir, farklı veri kümelerine uygulanabilir ve kullanıcılar arasında paylaşılabilir. Kısaca, analiz protokolü sıralı nesne segmentasyonu anlamına gelir: küresel, çekirdekler ve son olarak Ki67 cepleri (A488). Daha sonra, olumlu olayları daha da ayırt etmek için Ki67 ceplerinin ortalama yoğunluğu hesaplanır. Son olarak, Ki67 pozitif ceplerini kapsayan çekirdekler pozitif olarak seçilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/Suppl1_Harmony%20analysis_Revised.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Şekil 2: Kantitatif analiz yazılımının prosedür adımlarına genel bakış. 1. Adım. Etütler sekmesini kullanarak dosyaları yükleyin. Dosyalar Görüntü Eylemleri bölümünde açılacaktır. 2. Adım. Ek Açıklamalar sekmesini açın, ardından araç çubuğunun daire aracını kullanarak yapının her yerinde yeni bir katman tasarlamak için Katman Eylemleri'ne tıklayın. Dairesel olmayan yapılar için, bunun yerine kalem aleti kullanılabilir. 3. Adım. Araç çubuğu, ek açıklamalar tasarlamak ve araçla nicelemeyi görselleştirmek için <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62280/62280eq01.jpg">kullanılabilir. 4. Adım. Analiz sekmesini açın ve numunenin analizi için en iyi koşulları seçin (burada birkaç deneme gerekebilir). Adım 4.1. Boyama durumunu ayarlamak için Leke Seçimi bölümünü kullanın. Birkaç leke olması durumunda, bunlar eklenebilir ve yeniden adlandırılabilir ve sanal renk değiştirilebilir. Lokalizasyon tespiti belirtilebilir - nükleer veya sitoplazma boyaması. Adım 4.2. Hücre algılamayı ayarlamak için Hücre Algılama bölümünü kullanın. Bu bölüm analiz için en önemli bölüm olacaktır. Nükleer Kontrast Eşiği bölümü, tüm çekirdeklerin algılanmasını sağlayacaktır. Birden fazla popülasyon büyüklüğü olması durumunda dikkat edilmelidir, yazılım benzersiz bir büyük hücre yerine birkaç hücreyi tespit edebilir. Nükleer Boyut ve Nükleer segmentasyon agresiflik bölümleri, hücre büyüklüğü popülasyon aralıklarını ölçmek için kullanılabilir. 5. Adım. Örnek analizin nasıl çalıştırılacağına ilişkin açıklama. Şekilde gösterilen adımları izleyin. Ek Açıklama Katmanı bölümü, ayarı yalnızca bu slaytta çalıştırır. Niceliklendirme, araç kullanılarak <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62280/62280eq01.jpg">görselleştirilebilir. Uygun niceleme elde edilene kadar 4.1-5 arasındaki adımları tekrarlayın. Adım 6-6.1. Bu adımlar, yazılımı kullanarak bir şekil çizmenizi sağlar. 7. Adım. Yazılım aracılığıyla elde edilen niceleme grafikleri kaydedilebilir. 8. Adım. Veriler dışa aktarılabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/Suppl2_Halo%20Images_revised.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models at JoVE.com

Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

Burada, 100 μm'den birkaç milimetreye kadar değişen sabit üç boyutlu hücre kültürü modellerinin boyama ve hücre altı çözünürlükte görüntülenmesini gerçekleştirmek için ayrıntılı, sağlam ve tamamlayıcı protokoller sunuyoruz, böylece morfolojilerinin, hücre tipi bileşimlerinin ve etkileşimlerinin görselleştirilmesini sağlıyoruz.

Üç Boyutlu Organoid ve Küresel Modellerin Boyama ve Yüksek Çözünürlüklü Görüntülenmesi

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...

3D in vitro modeli hücresel ve hücre altı çözünürlükte karakterize etmek, tam kullanım için çok önemlidir, ancak zor olabilir. Bu nedenle, 100 mikrometreden birkaç milimetreye kadar değişen sabit 3D in vitro modellerin boyama ve hücre altı çözünürlüklü görüntülemesi için ücretsiz protokol sağladık. 3B yapılar radyaldir ve dikkatlice manipüle edilmelidir.Pipetlemeden önce, herhangi bir aspirasyonu önlemek için tüp içindeki 3B yapılarınızın konumunu kontrol edin. Organoidler veya sferoidler gibi küçük yapıların gömülmesi için klasik teknikleri uyarladığımızdan, görselleştirilmiş talimatlar ilk kez kullanıcıların görevi daha kolay yerine getirmelerine yardımcı olabilir. Prosedürü benimle birlikte gösteren, Patoloji Araştırma Platformu'ndan bir laboratuvar teknolojisi olan Laura Scols olacak.3D tam montaj boyama için numuneler hazırlamak üzere BSA ile önceden kodlanmış bir mililitrelik pipet ucu kullanarak 500 mikrolitrelik PBS tüpüne bir mililitrelik 3D yapı süspansiyonu ekleyin. 3D yapılar tüpün dibine yerleştiğinde, PBS'yi dakikada 30 ila 50 devirde yumuşak yatay ajitasyon ile oda sıcaklığında bir saatlik inkübasyon için 500 mikrolitre geçirgenlik engelleme çözeltisi ile dikkatlice değiştirin. Kuluçkanın sonunda, 3D yapıları, yıkama başına üç dakika boyunca BSA ile desteklenmiş% 0.1 PBS'lik bir mililitrede iki kez dikkatlice yıkamadan önce 3D yapıların tekrar tortulanmasına izin verin.Son yıkamadan sonra, 3D yapıları PBS'de 250 mikrolitre birincil antikor ile iki ila üç gün boyunca dört santigrat derecede hafif yatay ajitasyon ile etiketleyin. Kuluçkanın sonunda, numuneyi yıkama başına% 0.1 PBS BSA'lık bir mililitrede beş üç dakika ve iki 15 dakikalık yıkama ile yıkayın. Son yıkamadan sonra, 3D yapıları, ışıktan korunan nazik yatay ajitasyon ile dört santigrat derecede 24 saat boyunca PBS'de 250 mikrolitre uygun ikincil antikor ile etiketleyin.Ertesi gün, 3D yapıları, nazik yatay ajitasyonla dört santigrat derecede iki saatlik bir inkübasyon için uygun Hoechst 3342 konsantrasyonundan 250 mikrolitre ile etiketleyin. Kuluçkanın sonunda, 3D yapıları üç dakika boyunca beş kez ve 15 dakika boyunca iki kez, gösterildiği gibi yıkama başına bir mililitre PBS'de yıkayın. Son yıkamadan sonra, 3D yapıları 96 kuyucuklu siyah polistiren mikro plakaya aktarın ve kabarcıklardan kaçınarak yapılara nazikçe 200 mikrolitre temizleme çözeltisi ekleyin.Ardından, alüminyum folyo ile kaplı plakayı en az 48 saat boyunca dört santigrat dereceye yerleştirin. Büyük 3B hücre kültürü modellerini gömmek için, BSA kaplamalı bir mililitrelik pipet ucu kullanarak 3B yapıları PTFE astarlı şişe kapağına sahip düz tabanlı cam bir tüpe dikkatlice aktarın. Yapılar yerleştikten sonra, PBS'yi oda sıcaklığında 30 dakikalık bir inkübasyon için% 70 etanol ile dikkatlice değiştirin.Kuluçka sonunda,% 70 etanol'ü bir mililitre kullanıma hazır eozin Y çözeltisi ile değiştirin. Tüpe hafifçe vurun ve yapıları en az 30 dakika boyunca lekeleyin. Kuluçka sonunda, yapıları yıkama başına bir mililitre% 100 etanol içinde üç ardışık 30 dakikalık yıkama ile dehidrate edin.Son dehidrasyondan sonra, 3D yapıları, kimyasal bir başlık altında yıkama başına bir mililitre ksilen içinde üç ardışık 30 dakikalık yıkama ile temizleyin. Son ksilen daldırmasından sonra, beyaz bir mikroikiz doku kasetinin bir bölmesine bir parça ksilen batırılmış biyopsi pedi yerleştirin ve 3D yapıları pedin üzerine aktarmak için BSA kaplı iki mililitrelik plastik Pasteur pipet kullanın. 3D yapıları yerinde tutmak ve kaseti kapatmak için 3D yapıları başka bir ksilene batırılmış biyopsi pedi ile örtün.Tüm numuneler aktarıldığında, kasetleri gece boyunca taze bir 65 santigrat derece parafin banyosuna yerleştirmeden önce kasetleri 30 dakika boyunca 65 santigrat derece parafin banyosuna yerleştirin. Ertesi sabah, numune başına bir 65 santigrat derece ısıtılmış gömme kalıbına sıvı parafin ekleyin ve her kalıba bir parafin gömülü numune yerleştirin. Tüm 3D yapılar diplere düşene kadar kalıpları nazikçe çalkalayın ve 3D yapıları her kalıbın merkezine yerleştirmek için 65 santigrat derece ısıtılmış ince forseps kullanın.Parafin ince bir katı tabaka oluşturana kadar kalıbı soğutun ve 3D yapıyı yerine sabitleyin. Bir doku kaseti yerleştirin ve kalıbın üzerine sıcak parafin ekleyin. Parafin tamamen katılaştığında kalıbı çıkarın.Küçük 3B hücre kültürü modellerini gömmek için, 3B yapıları yıkama başına bir mililitre TBS'de üç kez nazikçe yıkayın. Son yıkamadan sonra, yapılara dokunmadan mümkün olduğunca fazla TBS'yi çıkarın ve ticari bir parafin gömme kitinden iki damla reaktif ekleyin. Dokunarak hafifçe karıştırın ve jel katılaşana kadar iki damla reaktif ekleyin.Jeli önceden monte edilmiş kasetin kuyusundan kitten aktarmak için ince forseps kullanın ve jel gömülü numuneyi, belirtildiği gibi bir duman davlumbazında 30 dakikalık artan etanol ve ksilen inkübasyonları ile dehidre edin. Son ksilen daldırmasından sonra, parafin gömülü numuneyi 65 santigrat derece ısıtılmış gömme kalıbının ortasına aktarmak için ince forseps kullanmadan önce kaseti gece boyunca 65 santigrat derece parafin banyosuna yerleştirin. Ardından, 3D yapıyı, büyük 3D hücre kültürü modelleri için gösterildiği gibi bir tane daha parafin tabakasıyla sabitleyin.Üç boyutlu tam montaj boyama ve konfokal mikroskopi, 3D kültür modellerinin hücresel bileşimi ve uzamsal konumu hakkında 200 mikrona kadar derinlik alanına görsel bilgi sağlar. Bu protokolü kullanarak 3D yapılar için elde edilebilen yüksek çözünürlük, hücre sayısının ölçülmesi ve farklı hücre alt tipleri içindeki çeşitli hücre belirteçlerinin tespiti için hücresel ve hücre altı segmentasyon algoritmalarının uygulanmasına izin verir. 3D bütün montaj analizi, tüm yapılardan bağımsız olarak 200 mikron derinliğe kadar görselleştirilmiş hücrelere uygulanabilir.Aksine, 2B bölüm analizi, herhangi bir boyuttaki hücrelere ilişkin içgörüler sağlayabilir.

Research

JoVE Journal

Biology

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Yüksek çözünürlüklü Ölçüm Drosophila Larva Koku-Driven Davranış

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Büyüme Konileri Yüksek Çözünürlüklü Görüntüleme için Aplysia Nöronal Hücre Kültürleri

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the IÃƒâ€šÃ‚Â·Cryo Kit

I · Cryo Kit kullanarak Fare Sperm Kriyoprezervasyon ve Kurtarma

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

Üç boyutlu Karışık-hücre Sfero Co-kültürden Meme Epitel Hücrelerinin İzolasyonu

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

DNA Hasarı Tepki Proteinler İki ve Üç Boyutlu Canlı Hücre Görüntüleme

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Uzun süreli, yüksek çözünürlüklü Konfokal Time Lapse Görüntüleme<em&gt; Arabidopsis Kotiledon</emÇimlenme sırasında&gt; Epidermis

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

Bitki damarları ve Üç Boyutlu Yapı ve Fonksiyon Visualize&#39;a Yüksek Çözünürlüklü Bilgisayarlı Tomografi Kullanımı

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Için Fare Fetal Tüm Bağırsak Kültür Sistemi<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sinyal facebook ve villus Kalkınma Üç boyutlu Canlı Görüntüleme Manipülasyon

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Üç boyutlu Hidrojeller içinde Görüntüleme FRET

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Yüksek çözünürlüklü Time-lapse Görüntüleme ve Yaşayan İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde Mikrotubul Dinamiği Otomatik Analizi

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...