Name: an easy and flexible inoculation method for accurately assessing powdery mildew-infection phenotypes of arabidopsis and other plants
Uploaded: 2021-03-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Easy and Flexible Inoculation Method for Accurately Assessing Powdery Mildew-Infection Phenotypes of Arabidopsis and Other Plants at JoVE.com

Le travail a été soutenu par la National Science Foundation (IOS-1901566) à S. Xiao. Les auteurs tiennent à remercier F. Coker et C. Hooks pour l’entretien de l’installation de croissance des plantes, et Jorge Zamora pour l’aide technique associée à la fabrication de la boîte et de la chambre d’inoculation.

1. Fabrication d’une boîte d’inoculation standard avec un couvercle supérieur amovible monté avec un filet
<ol><li>Achetez un rouleau de treillis de membrane en nylon de 50 μm ou de treillis en acier inoxydable de 48 μm (recommandé) dans les magasins. Assurez-vous d’en commander suffisamment pour couper en plusieurs morceaux de 14 po x 26 po pour remplacer les mailles usées.</li>
	<li>Achetez un panneau de fibres ou de contreplaqué de densité moyenne de 1/4 po x 2 pi x 4 pi et coupez deux pièces de 24-1...

<ol>
	<li>Huckelhoven, R., Panstruga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+bi+ology+of+the+plant-powdery+mildew+interaction.">Cell bi ology of the plant-powdery mildew interaction.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 738-746 (2011).</li><li>Dean, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+top+10+fungal+pathogens+in+molecular+plant+pathology.">The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).</li><li>Sakurai, H., Hirata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+observations+on+the+relation+between+the+penetration+hypha+and+haustorium+of+barley+powdery+mildew+and+host+cell.+V.+Influence+of+water+spray+on+the+pathogen+and+host+tissue.">Some observations on the relation between the penetration hypha and haustorium of barley powdery mildew and host cell. V. Influence of water spray on the pathogen and host tissue.</a> Annual Phytopathology Society of Japan. 24, 239-245 (1959).</li><li>Shomari, S. H., Kennedy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+Oidium+anacardii+on+cashew+(Anacardium+occidentale)+in+southern+Tanzania.">Survival of Oidium anacardii on cashew (Anacardium occidentale) in southern Tanzania.</a> Plant Pathology. 48 (4), 505-513 (1999).</li><li>Sitterly, W. R., Spencer, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Powdery Mildews. , 369 (1978).</li><li>Reuveni, M., Agapov, V., Reuveni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+systemic+resistance+to+powdery+mildew+and+growth+increase+in+cucumber+by+phosphates.">Induction of systemic resistance to powdery mildew and growth increase in cucumber by phosphates.</a> Biological Agriculture &amp; Horticulture. 9 (4), 305-315 (1993).</li><li>Reifschneider, F. J. B., Boiteux, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vacuum-operated+settling+tower+for+inoculation+of+powdery+mildew+fungi.">A vacuum-operated settling tower for inoculation of powdery mildew fungi.</a> Phytopathology. 78 (11), 1463-1465 (1988).</li><li>Chowdhury, A., Bremer, G. B., Salt, D. W., Miller, P., Ford, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+of+delivering+Blumeria+graminis+f.+sp+hordei+spores+for+laboratory+experiments.">A novel method of delivering Blumeria graminis f. sp hordei spores for laboratory experiments.</a> Crop Protection. 22 (7), 917-922 (2003).</li><li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad-spectrum+mildew+resistance+in+Arabidopsis+thaliana+mediated+by+RPW8.">Broad-spectrum mildew resistance in Arabidopsis thaliana mediated by RPW8.</a> Science. 291 (5501), 118-120 (2001).</li><li>Xiao, S., Ellwood, S., Findlay, K., Oliver, R. P., Turner, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+three+loci+controlling+resistance+of+Arabidopsis+thaliana+accession+Ms-0+to+two+powdery+mildew+diseases.">Characterization of three loci controlling resistance of Arabidopsis thaliana accession Ms-0 to two powdery mildew diseases.</a> The Plant Journal. 12 (4), 757-768 (1997).</li><li>Reuber, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+defense+gene+induction+defects+with+powdery+mildew+susceptibility+in+Arabidopsis+enhanced+disease+susceptibility+mutants.">Correlation of defense gene induction defects with powdery mildew susceptibility in Arabidopsis enhanced disease susceptibility mutants.</a> The Plant Journal. 16 (4), 473-485 (1998).</li><li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atypical+resistance+gene,+RPW8,+recruits+components+of+basal+defence+for+powdery+mildew+resistance+in+Arabidopsis.">The atypical resistance gene, RPW8, recruits components of basal defence for powdery mildew resistance in Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 42 (1), 95-110 (2005).</li></ol>

Notre méthode d’inoculation à base de boîte à mailles présente plusieurs avantages par rapport aux autres méthodes d’inoculation. Tout d’abord, il peut atteindre une distribution uniforme des spores s’il est utilisé correctement, comme le montre la figure 5. Deuxièmement, l’utilisation d’un maillage de ~50 μm, ainsi que le délogement des spores par agitation douce des feuilles infectées peuvent réduire l’infection des plantes par les thrips ou d’autres insectes in...

L’oïdium est l’une des maladies les plus courantes et les plus importantes de nombreuses cultures vivrières et plantes ornementales1. Les études sur les maladies de l’oïdium ont été très populaires, comme en témoignent plus de 10 500 publications comme résultat de recherche avec « oïdium » comme mot clé sur le Web of Science (en novembre 2020). En effet, l’oïdium (représenté par Blumeria graminis) est considéré comme l’un des 10 principaux pathogènes fongiques par le journal of Molecular Plant Pathology2. La quantification de la sensibilité aux maladies est une étape nécessaire dans la caractérisation des gènes végétaux contribuant à la résistance ou à la sensibilité aux maladies, ou dans l’identification fonctionnelle des gènes effecteurs candidats dans l’oïdium. Cependant, le phénotypage fiable des maladies est beaucoup plus difficile avec l’oïdium que pour la plupart des autres pathogènes fongiques, en partie parce que, contrairement aux spores de ces derniers, les spores d’espèces d’oïdium (telles que Golovinomyces cichoracearum UCSC1 d’après notre expérience de laboratoire) présentent une viabilité réduite après avoir subi un processus de suspensionaqueuse 3,4 . Une inoculation inadéquate et/ou inégale d’un agent pathogène particulier de l’oïdium dans les plantes d’essai peut entraîner des résultats phénotypiques inexacts.
Un certain nombre de méthodes d’inoculation ont été signalées pour les études sur l’oïdium. Il s’agit notamment (i) du brossage des spores directement des feuilles infectées pour testerles plantes 5, (ii) de la pulvérisation d’une suspension de spores pour tester les plantes6, (iii) du soufflage des spores à l’aide d’une tour de décantation sous vide aux plantes situées au bas de la tour7, et (iv) de l’administration de spores par l’utilisation combinatoire d’une membrane à mailles de nylon et de vibrations basées sur le son8 . La méthode de brossage des spores (ou dépoussiérage) est facile à réaliser, mais de nature inégale, elle peut donc ne pas être précise pour l’évaluation quantitative. La pulvérisation de spores est pratique et uniforme, mais comme indiqué ci-dessus, elle peut entraîner une mauvaise germination des spores4. Les deux dernières (c.-à-d. iii-iv) sont des méthodes très améliorées capables d’obtenir une inoculation uniforme; Cependant, les deux ne sont pas flexibles dans l’ajustement de leur capacité d’inoculation en termes de nombre de plantes à inoculer en un seul événement, ce qui rend l’un ou l’autre appareil n’est pas trivial, et leur fonctionnement est limité aux zones de laboratoire où il y a un vide et / ou une source d’électricité.
Notre laboratoire travaille sur l’interaction plantes-oïdium depuis plus de 20 ans 9,10. Au cours de la dernière décennie, nous avons testé un certain nombre de méthodes d’inoculation et avons récemment mis au point une méthode simple et efficace d’inoculation de l’oïdium. Cette méthode de brossage à mailles peut assurer une inoculation uniforme, et est simple et évolutive, devrait donc être facilement adoptée par tout laboratoire travaillant avec l’oïdium.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >&#160;48 &#181;m stainless steel grid mesh screen; Size: 24&#34; X 48&#34;&#160;</td>
			<td >Amazon</td>
			<td >NA</td>
			<td >For making the lid of an inoculation box</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >#6-32 x &#190;&#34; machine screws, flat washers and nuts&#160;</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >NA</td>
			<td>For making an inoculation chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >#6-32 zinc plated nylon lock nut (4-Pack)</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >NA</td>
			<td>For making an inoculation chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >#6-32x3/8&#8221; Phillips flat head machine screws, flat washers and nuts&#160;</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >NA</td>
			<td>For securing&#160; magnet door catch plates</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >#8-32x1/2&#34; machine screws, flat washers and nuts</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >NA</td>
			<td>For securing corner braces and door hinge</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet;&#160; Size: 17 &#189;&#34; X 20&#34;</td>
			<td >Professional Plastics</td>
			<td >SACR.250CEF</td>
			<td>For making an inoculation chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18&#34; X 20&#34;&#160;&#160;</td>
			<td >Professional Plastics</td>
			<td >&#160;SACR.250CEF</td>
			<td>For making an inoculation chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18&#34; X 30&#34;&#160;</td>
			<td >Professional Plastics</td>
			<td >SACR.250CEF</td>
			<td>For making an inoculation chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 20&#34; X 29 &#189; &#34;</td>
			<td >Professional Plastics</td>
			<td >SACR.250CEF</td>
			<td>For making an inoculation chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1-5/8&#34; cabinet door magnetic catch white</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >Model #P110-W</td>
			<td>For making an inoculation chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2&#34; steel zinc-plated corner brace (8-Pack)&#160;</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >&#160;Model #13611&#160;</td>
			<td>For making an inoculation box &#38; chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3&#34; Corner Clamp</td>
			<td>Harbor Freight Tools</td>
			<td>SKU 63653, 1852, 60589</td>
			<td>For making inoculation chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3/4&#34;&#160; steel zinc plated corner brace (4-Pack)</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >Model #13542</td>
			<td>For making an inoculation box &#38; chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4-7/8&#34; zinc-plated light duty door pull handles</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >Model #15184</td>
			<td>For making an inoculation box</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fine fan-blender brushes</td>
			<td>Michaels Store</td>
			<td>M10472846&#160;</td>
			<td>For inoculation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kelleher 3/4&#34; x 3/4&#34; x 36&#34; wood square dowel&#160;</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >NA</td>
			<td>For making the lid of an inoculation box</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medium density fiberboard (1/4&#34; x 2&#39; x 4&#39;);&#160;</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >Model# 1508104</td>
			<td>For making an inoculation box</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Round glass coverslips with a 500 &#181;m grid</td>
			<td >ibidi USA Inc.</td>
			<td >10816</td>
			<td>For determining&#160; spore density</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an easy and flexible inoculation method for accurately assessing powdery mildew-infection phenotypes of arabidopsis and other plants

Pour réduire les pertes de récoltes dues aux maladies fongiques, il faut mieux comprendre les mécanismes régissant l’immunité des plantes et la pathogenèse fongique, ce qui nécessite une détermination précise des phénotypes de maladies des plantes lors de l’infection par un pathogène fongique particulier. Cependant, le phénotypage précis de la maladie avec des pathogènes fongiques biotrophes non cultivables tels que l’oïdium n’est pas facile à réaliser et peut être une étape limitant le taux d’un projet de recherche. Ici, nous avons développé un système de phénotypage de maladies sûr, efficace et facile à utiliser en utilisant l’interaction Arabidopsis-oïdium comme exemple. Ce système se compose principalement de trois composants: (i) une boîte d’inoculation en bois munie d’un couvercle amovible monté avec un treillis en acier inoxydable ou en nylon de ~50 μm pores pour inoculer un plat de plantes avec des spores fongiques, (ii) une chambre en plastique transparent avec une petite ouverture frontale pour minimiser la fuite de spores tout en effectuant l’inoculation à l’intérieur, et iii) une méthode de délogement et de distribution des spores pour une inoculation uniforme et efficace. Les protocoles décrits ici comprennent les étapes et les paramètres pour fabriquer la boîte d’inoculation et la chambre en plastique à faible coût, ainsi qu’une démonstration vidéo de la façon d’utiliser le système pour permettre une inoculation uniforme avec des spores d’oïdium, améliorant ainsi la précision et la reproductibilité du phénotypage de la maladie.

Ici, nous présentons une nouvelle méthode d’inoculation des spores de l’oïdium qui est facile à préparer, à utiliser et à ajuster. La figure 1 montre l’assemblage de la boîte d’inoculation standard en mettant l’accent sur la marque du couvercle amovible monté avec un treillis à membrane de 50 μm. La figure 2 montre l’assemblage de la chambre d’inoculation. La figure 3 illustre les principales étapes du proc...

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An Easy and Flexible Inoculation Method for Accurately Assessing Powdery Mildew-Infection Phenotypes of Arabidopsis and Other Plants

Nous présentons un protocole pour la construction d’un système simple de distribution de spores composé d’une boîte d’inoculation avec un maillage de ~50 μm et une chambre en plastique transparente. Cela peut être utilisé pour inoculer uniformément les plantes avec des spores d’oïdium, permettant ainsi une évaluation précise et reproductible des phénotypes de maladies des plantes à l’étude.

Une méthode d’inoculation simple et flexible pour évaluer avec précision les phénotypes d’oïdium d’Arabidopsis et d’autres plantes

Reducing crop losses due to fungal diseases requires improved understanding of the mechanisms governing plant immunity and fungal pathogenesis, which in ...

L’oïdium est une maladie importante des plantes. La détermination précise du phénotype de la maladie nécessite une inoculation uniforme de l’agent pathogène. Comme les méthodes existantes sont inefficaces, nous avons développé ce protocole.Notre méthode d’inoculation des spores peut facilement atteindre une inoculation uniforme, et elle est simple et évolutive. Par conséquent, tout laboratoire travaillant avec de l’oïdium peut facilement utiliser cette méthode. Les chercheurs peuvent également monter un treillis sur une boîte en carton et l’utiliser pour l’inoculation des spores.Comment déloger les spores et les brosser à travers les mailles est une étape critique. Donc, démontrer cela sur vidéo pourrait être très utile. Pour ce protocole, procurez-vous un rouleau de maille de membrane en nylon de 50 micromètres ou un treillis en acier inoxydable de 48 micromètres.Coupez le contreplaqué de grande taille et de densité moyenne en morceaux de 24,5 X 10 pouces et 12 X 10 pouces pour faire une boîte d’inoculation. Pour faire un couvercle supérieur amovible avec un treillis, coupez le long goujon carré en bois en deux ensembles de 26 pouces et 12,75 pouces. Collez et clouez les quatre pièces pour les adapter autour de la boîte.Prenez des feuilles d’acrylique et assemblez toutes les feuilles d’acrylique dans une boîte, à l’aide de huit pinces d’angle. Coupez une fenêtre ouvrante de 7 X 2 pouces sur la face avant de la feuille d’acrylique de la boîte. Pour préparer des spores fraîches d’oïdium comme inocula, cultivez des plantes mutantes Arabidopsis immunodéprimées pad4-1 dans une chambre de croissance à 22 degrés Celsius et 65% d’humidité relative pendant six à huit semaines.Cultivez les plantes pour déterminer les phénotypes d’infection dans les appartements standard. Inoculer une ou la moitié des plants de pad4-1 pour produire suffisamment de spores fraîches d’oïdium. Lorsque des spores fraîches de plantes infectées sont disponibles, déplacer un plat de plantes dans la boîte d’inoculation à l’intérieur de la chambre d’inoculation pour un test d’infection.Coupez 15 à 20 feuilles d’Arabidopsis fortement infectées et laissez-les sécher s’il y a de l’eau condensée. Tenez une à deux feuilles à l’envers dans une main avec une paire de pinces longues. Ensuite, passez les deux mains à travers l’ouverture de la chambre et frappez doucement le bras de la pince avec une paire de ciseaux, tout en déplaçant lentement les feuilles au-dessus du filet monté sur la boîte d’inoculation.Brossez les spores avec de fines brosses mélangeuses à ventilateur sur toute la surface du maillage dans différentes directions pour maximiser la répartition uniforme des spores sur les plantes. Tapotez doucement le filet plusieurs fois avec les brosses pour secouer les spores coincées dans le filet. Une fois que les spores se sont installées, sortez l’appartement contenant les plantes inoculées de la boîte d’inoculation.Couvrez l’appartement avec un dôme en plastique et placez-le dans une chambre de croissance à 22 degrés Celsius et 65% d’humidité relative. Le phénotypage de la maladie peut être effectué 5 ou 8 à 12 jours après l’inoculation. Convertissez les boîtes en carton en boîte d’inoculation en enlevant les côtés supérieur et inférieur de la boîte, en collant le coin pour la raffermir et en montant un maillage de 50 micromètres sur le dessus avec de la colle.Déplacez l’appartement contenant les plantes à l’intérieur de la chambre d’inoculation et placez la plus petite boîte d’inoculation sur le dessus de l’appartement pour couvrir les plantes. Ensuite, délogez et brossez les spores. Faites une mini boîte d’inoculation légèrement plus grande qu’une boîte de Pétri.Conservez les assiettes à quatre degrés Celsius au réfrigérateur jusqu’à utilisation. Coupez une ou deux feuilles complètement expansées à partir de la base du pétiole pour chaque plante à tester. Insérez le pétiole des feuilles détachées dans le milieu gélosé à un angle de 30 degrés.Inoculer les feuilles à l’intérieur de la chambre d’inoculation et déplacer la plaque avec le couvercle vers une chambre de croissance. Pour évaluer les phénotypes d’infection, transférer les feuilles dans une nouvelle plaque aseptique de gélose MS quatre ou cinq jours après l’inoculation. Couper la base du pétiole avant d’insérer les feuilles dans le milieu gélosé frais.Évaluer les phénotypes de la maladie huit ou neuf jours après l’inoculation. L’analyse microscopique a montré une répartition uniforme des spores sur les lames microscopiques au fond de l’appartement. La densité calculée des spores, réparties à six endroits différents après inoculation de lumière, n’a montré aucune différence significative.Des résultats similaires ont été obtenus après des inoculations lourdes avec des spores. La régularité de l’inoculation a été examinée parmi différents génotypes de plantes 12 jours après l’inoculation lourde. Les plantes pad4-1 ont montré une sensibilité accrue aux maladies par rapport à Columbia 0, les plantes de type sauvage.L’utilisation de spores fraîches adéquates, produites environ 10 jours après l’inoculation, sur les plantes sensibles, est importante, car les spores fraîches sont plus faciles à déloger et plus susceptibles d’établir une colonisation. L’oïdium ne colonise que les cellules épidermiques des plantes. L’isolement des cellules infectées par l’oïdium par pelage de l’épiderme, ou microdissection laser, permettrait une étude transcriptomique et protéomique plus ciblée des réponses de l’hôte.Cette méthode aidera les chercheurs à déterminer plus efficacement les phénotypes d’infection par le mildiou en poudre et, par conséquent, devrait faciliter des études fonctionnelles plus efficaces sur les interactions entre l’oïdium des plantes.

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