Name: an easy and flexible inoculation method for accurately assessing powdery mildew-infection phenotypes of arabidopsis and other plants
Uploaded: 2021-03-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Easy and Flexible Inoculation Method for Accurately Assessing Powdery Mildew-Infection Phenotypes of Arabidopsis and Other Plants at JoVE.com

Il lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation (IOS-1901566) a S. Xiao. Gli autori desiderano ringraziare F. Coker e C. Hooks per la manutenzione dell'impianto di crescita delle piante e Jorge Zamora per l'aiuto tecnico associato alla fabbricazione della scatola e della camera di inoculazione.

1. Realizzazione di una scatola di inoculazione standard con un coperchio superiore rimovibile montato con una rete
<ol><li>Acquista un rotolo di rete a membrana di nylon da 50 μm o rete in acciaio inossidabile da 48 μm (consigliato) dai negozi. Assicurati di ordinare abbastanza per tagliare in più pezzi da 14 in x 26 pollici per la sostituzione della rete usurata.</li>
	<li>Acquista un pannello di fibra o compensato a media densità da 1/4 in x 2 ft x 4 ft e taglia due 24-1/2 in x 10 in pezzi e due 12 in x 10 in pe...

<ol>
	<li>Huckelhoven, R., Panstruga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+bi+ology+of+the+plant-powdery+mildew+interaction.">Cell bi ology of the plant-powdery mildew interaction.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 738-746 (2011).</li><li>Dean, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+top+10+fungal+pathogens+in+molecular+plant+pathology.">The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).</li><li>Sakurai, H., Hirata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+observations+on+the+relation+between+the+penetration+hypha+and+haustorium+of+barley+powdery+mildew+and+host+cell.+V.+Influence+of+water+spray+on+the+pathogen+and+host+tissue.">Some observations on the relation between the penetration hypha and haustorium of barley powdery mildew and host cell. V. Influence of water spray on the pathogen and host tissue.</a> Annual Phytopathology Society of Japan. 24, 239-245 (1959).</li><li>Shomari, S. H., Kennedy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+Oidium+anacardii+on+cashew+(Anacardium+occidentale)+in+southern+Tanzania.">Survival of Oidium anacardii on cashew (Anacardium occidentale) in southern Tanzania.</a> Plant Pathology. 48 (4), 505-513 (1999).</li><li>Sitterly, W. R., Spencer, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Powdery Mildews. , 369 (1978).</li><li>Reuveni, M., Agapov, V., Reuveni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+systemic+resistance+to+powdery+mildew+and+growth+increase+in+cucumber+by+phosphates.">Induction of systemic resistance to powdery mildew and growth increase in cucumber by phosphates.</a> Biological Agriculture &amp; Horticulture. 9 (4), 305-315 (1993).</li><li>Reifschneider, F. J. B., Boiteux, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vacuum-operated+settling+tower+for+inoculation+of+powdery+mildew+fungi.">A vacuum-operated settling tower for inoculation of powdery mildew fungi.</a> Phytopathology. 78 (11), 1463-1465 (1988).</li><li>Chowdhury, A., Bremer, G. B., Salt, D. W., Miller, P., Ford, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+of+delivering+Blumeria+graminis+f.+sp+hordei+spores+for+laboratory+experiments.">A novel method of delivering Blumeria graminis f. sp hordei spores for laboratory experiments.</a> Crop Protection. 22 (7), 917-922 (2003).</li><li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad-spectrum+mildew+resistance+in+Arabidopsis+thaliana+mediated+by+RPW8.">Broad-spectrum mildew resistance in Arabidopsis thaliana mediated by RPW8.</a> Science. 291 (5501), 118-120 (2001).</li><li>Xiao, S., Ellwood, S., Findlay, K., Oliver, R. P., Turner, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+three+loci+controlling+resistance+of+Arabidopsis+thaliana+accession+Ms-0+to+two+powdery+mildew+diseases.">Characterization of three loci controlling resistance of Arabidopsis thaliana accession Ms-0 to two powdery mildew diseases.</a> The Plant Journal. 12 (4), 757-768 (1997).</li><li>Reuber, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+defense+gene+induction+defects+with+powdery+mildew+susceptibility+in+Arabidopsis+enhanced+disease+susceptibility+mutants.">Correlation of defense gene induction defects with powdery mildew susceptibility in Arabidopsis enhanced disease susceptibility mutants.</a> The Plant Journal. 16 (4), 473-485 (1998).</li><li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atypical+resistance+gene,+RPW8,+recruits+components+of+basal+defence+for+powdery+mildew+resistance+in+Arabidopsis.">The atypical resistance gene, RPW8, recruits components of basal defence for powdery mildew resistance in Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 42 (1), 95-110 (2005).</li></ol>

Il nostro metodo di inoculazione basato su mesh-box presenta diversi vantaggi rispetto ad altri metodi di inoculazione. In primo luogo, può raggiungere una distribuzione uniforme delle spore se utilizzato correttamente, come dimostrato nella Figura 5. In secondo luogo, l'uso di ~ 50 μm di mesh, oltre allo spostamento delle spore mediante un leggero scuotimento delle foglie infette, può ridurre l'infezione delle piante da tripidi o altri insetti che infettano le piante presenti nelle piant...

L'oidio è una delle malattie più comuni e importanti di numerose colture alimentari e piante ornamentali1. Gli studi sulle malattie dell'oidio sono stati molto popolari, come evidenziato da oltre 10.500 pubblicazioni come risultato della ricerca con "oidio" come parola chiave sul Web of Science (a partire da novembre 2020). Infatti, l'oidio (rappresentato da Blumeria graminis) è considerato uno dei primi 10 patogeni fungini dalla rivista Molecular Plant Pathology2. La quantificazione della suscettibilità alla malattia è un passo necessario nella caratterizzazione dei geni vegetali che contribuiscono alla resistenza o alla suscettibilità alle malattie, o nell'identificazione funzionale di geni effettori candidati nell'oidio. Tuttavia, la fenotipizzazione affidabile della malattia è molto più difficile con l'oidio rispetto a quella con la maggior parte degli altri patogeni fungini, in parte perché, a differenza delle spore di questi ultimi, le spore di specie di oidio (come Golovinomyces cichoracearum UCSC1 sulla base della nostra esperienza di laboratorio) mostrano una ridotta vitalità dopo aver attraversato un processo di sospensione dell'acqua 3,4 . L'inoculazione inadeguata e/o irregolare delle piante di prova con un particolare patogeno dell'oidio può portare a risultati di fenotipizzazione imprecisi.
Sono stati riportati diversi metodi di inoculazione per studi sull'oidio. Questi includono (i) spazzolare le spore direttamente dalle foglie infette alle piante di prova5, (ii) spruzzare una sospensione di spore per testare le piante6, (iii) soffiare spore usando una torre di decantazione azionata a vuoto alle piante sul fondo della torre7 e (iv) consegna di spore mediante l'uso combinatorio di una membrana a rete di nylon e vibrazioni basate sul suono8 . Il metodo di spazzolatura delle spore (o spolveratura) è facile da eseguire ma di natura irregolare, quindi potrebbe non essere accurato per la valutazione quantitativa. La spruzzatura di spore è conveniente e uniforme, ma come detto sopra può causare una scarsa germinazione delle spore4. Gli ultimi due (cioè iii-iv) sono metodi molto migliorati in grado di raggiungere anche l'inoculazione; Tuttavia, entrambi non sono flessibili nel regolare la loro capacità di inoculazione in termini di numero di piante da inoculare in un singolo evento, rendendo entrambi gli apparecchi non banali, e il loro funzionamento è limitato alle aree di laboratorio dove c'è un vuoto e / o una fonte di elettricità.
Il nostro laboratorio lavora con l'interazione pianta-oidio da oltre 20 anni 9,10. Negli ultimi dieci anni, abbiamo testato una serie di metodi di inoculazione e recentemente abbiamo sviluppato un metodo di inoculazione dell'oidio semplice ma efficace. Questo metodo di spazzolatura delle spore a rete può garantire un'inoculazione uniforme ed è semplice e scalabile, quindi dovrebbe essere facilmente adottato da qualsiasi laboratorio che lavora con l'oidio.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >&#160;48 &#181;m stainless steel grid mesh screen; Size: 24&#34; X 48&#34;&#160;</td>
			<td >Amazon</td>
			<td >NA</td>
			<td >For making the lid of an inoculation box</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >#6-32 x &#190;&#34; machine screws, flat washers and nuts&#160;</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >NA</td>
			<td>For making an inoculation chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >#6-32 zinc plated nylon lock nut (4-Pack)</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >NA</td>
			<td>For making an inoculation chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >#6-32x3/8&#8221; Phillips flat head machine screws, flat washers and nuts&#160;</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >NA</td>
			<td>For securing&#160; magnet door catch plates</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >#8-32x1/2&#34; machine screws, flat washers and nuts</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >NA</td>
			<td>For securing corner braces and door hinge</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet;&#160; Size: 17 &#189;&#34; X 20&#34;</td>
			<td >Professional Plastics</td>
			<td >SACR.250CEF</td>
			<td>For making an inoculation chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18&#34; X 20&#34;&#160;&#160;</td>
			<td >Professional Plastics</td>
			<td >&#160;SACR.250CEF</td>
			<td>For making an inoculation chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18&#34; X 30&#34;&#160;</td>
			<td >Professional Plastics</td>
			<td >SACR.250CEF</td>
			<td>For making an inoculation chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 20&#34; X 29 &#189; &#34;</td>
			<td >Professional Plastics</td>
			<td >SACR.250CEF</td>
			<td>For making an inoculation chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1-5/8&#34; cabinet door magnetic catch white</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >Model #P110-W</td>
			<td>For making an inoculation chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2&#34; steel zinc-plated corner brace (8-Pack)&#160;</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >&#160;Model #13611&#160;</td>
			<td>For making an inoculation box &#38; chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3&#34; Corner Clamp</td>
			<td>Harbor Freight Tools</td>
			<td>SKU 63653, 1852, 60589</td>
			<td>For making inoculation chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3/4&#34;&#160; steel zinc plated corner brace (4-Pack)</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >Model #13542</td>
			<td>For making an inoculation box &#38; chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4-7/8&#34; zinc-plated light duty door pull handles</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >Model #15184</td>
			<td>For making an inoculation box</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fine fan-blender brushes</td>
			<td>Michaels Store</td>
			<td>M10472846&#160;</td>
			<td>For inoculation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kelleher 3/4&#34; x 3/4&#34; x 36&#34; wood square dowel&#160;</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >NA</td>
			<td>For making the lid of an inoculation box</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medium density fiberboard (1/4&#34; x 2&#39; x 4&#39;);&#160;</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >Model# 1508104</td>
			<td>For making an inoculation box</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Round glass coverslips with a 500 &#181;m grid</td>
			<td >ibidi USA Inc.</td>
			<td >10816</td>
			<td>For determining&#160; spore density</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an easy and flexible inoculation method for accurately assessing powdery mildew-infection phenotypes of arabidopsis and other plants

Ridurre le perdite di raccolto dovute a malattie fungine richiede una migliore comprensione dei meccanismi che regolano l'immunità delle piante e la patogenesi fungina, che a sua volta richiede una determinazione accurata dei fenotipi di malattia delle piante in seguito all'infezione con un particolare agente patogeno fungino. Tuttavia, un'accurata fenotipizzazione della malattia con patogeni fungini biotrofici non coltivabili come l'oidio non è facile da raggiungere e può essere un passo limitante di un progetto di ricerca. Qui, abbiamo sviluppato un sistema di fenotipizzazione della malattia sicuro, efficiente e facile da usare utilizzando l'interazione Arabidopsis-oidio come esempio. Questo sistema consiste principalmente di tre componenti: (i) una scatola di inoculazione in legno dotata di un coperchio rimovibile montato con una rete in acciaio inossidabile o nylon di ~ 50 μm pori per inoculare un piatto di piante con spore fungine, (ii) una camera di plastica trasparente con una piccola apertura frontale per ridurre al minimo la fuoriuscita di spore durante l'inoculazione all'interno, e iii) un metodo di rimozione e distribuzione delle spore per un'inoculazione uniforme ed efficace. I protocolli qui descritti includono i passaggi e i parametri per realizzare la scatola di inoculazione e la camera di plastica a basso costo e una dimostrazione video di come utilizzare il sistema per consentire l'inoculazione uniforme con spore di oidio, migliorando così l'accuratezza e la riproducibilità della fenotipizzazione della malattia.

Qui presentiamo un nuovo metodo di inoculazione delle spore di oidio che è facile da preparare, utilizzare e regolare. La figura 1 mostra l'assemblaggio della scatola di inoculazione standard con enfasi sulla marca del coperchio rimovibile montato con una maglia a membrana da 50 μm. La figura 2 mostra l'assemblaggio della camera di inoculazione. La figura 3 illustra le fasi chiave del processo di inoculazione utilizzando questo si...

Watch this Scientific Journal Video about An Easy and Flexible Inoculation Method for Accurately Assessing Powdery Mildew-Infection Phenotypes of Arabidopsis and Other Plants at JoVE.com

An Easy and Flexible Inoculation Method for Accurately Assessing Powdery Mildew-Infection Phenotypes of Arabidopsis and Other Plants

Presentiamo un protocollo per la costruzione di un semplice sistema di distribuzione delle spore costituito da una scatola di inoculazione con una maglia di ~ 50 μm e una camera di plastica trasparente. Questo può essere utilizzato per inoculare uniformemente le piante con spore di oidio, consentendo così una valutazione accurata e riproducibile dei fenotipi di malattia delle piante in studio.

Un metodo di inoculazione semplice e flessibile per valutare accuratamente i fenotipi di infezione da oidio di Arabidopsis e altre piante

Reducing crop losses due to fungal diseases requires improved understanding of the mechanisms governing plant immunity and fungal pathogenesis, which in ...

L'oidio è un'importante malattia delle piante. La determinazione accurata del fenotipo della malattia richiede anche l'inoculazione del patogeno. Poiché i metodi esistenti sono inefficienti, abbiamo sviluppato questo protocollo.Il nostro metodo di inoculazione delle spore può facilmente raggiungere un'inoculazione uniforme ed è semplice e scalabile. Quindi, qualsiasi laboratorio che lavora con l'oidio può facilmente utilizzare questo metodo. I ricercatori possono anche montare la rete su una scatola di cartone e usarla per l'inoculazione delle spore.Come rimuovere le spore e spazzolarle attraverso la rete è un passaggio critico. Quindi dimostrarlo in video potrebbe essere molto utile. Per questo protocollo, ottenere un rotolo di rete a membrana di nylon da 50 micrometri o da 48 micrometri in acciaio inossidabile.Tagliare compensato di grandi dimensioni e media densità in pezzi di 24,5X10 pollici e 12X10 pollici per realizzare una scatola di inoculazione. Per realizzare un coperchio superiore rimovibile con una rete, tagliare il lungo tassello quadrato di legno in due set da 26 pollici e 12,75 pollici. Incollare e inchiodare i quattro pezzi per adattarli alla scatola.Prendi i fogli acrilici e assembla tutti i fogli acrilici in una scatola, usando otto morsetti angolari. Tagliare una finestra di apertura da 7X2 pollici sul lato anteriore del foglio acrilico della scatola. Per preparare spore fresche di oidio come inocula, coltivare piante mutanti pad4-1 immuno-compromesse di Arabidopsis pulite in una camera di crescita a 22 gradi Celsius e 65% di umidità relativa per sei-otto settimane.Coltiva le piante per determinare i fenotipi di infezione negli appartamenti standard. Inoculare una o metà delle piante pad4-1 per costruire sufficienti spore fresche di oidio. Quando sono disponibili spore fresche di piante infette, spostare un piatto di piante nella scatola di inoculazione all'interno della camera di inoculazione per un test di infezione.Tagliare da 15 a 20 foglie di Arabidopsis fortemente infette e lasciarle asciugare se c'è acqua condensata. Tenere una o due foglie capovolte in una mano con un paio di lunghe pinze. Quindi mettere entrambe le mani attraverso l'apertura della camera e colpire delicatamente il braccio della pinza con un paio di forbici, mentre si muovono lentamente le foglie sopra la rete montata sulla scatola di inoculazione.Spazzolare le spore con spazzole sottili del frullatore a ventaglio attraverso l'intera superficie della rete in direzioni diverse per massimizzare la distribuzione uniforme delle spore sulle piante. Picchiettare delicatamente la rete un paio di volte con i pennelli per scrollarsi di dosso le spore bloccate nella rete. Una volta che le spore si depositano, spostare fuori l'appartamento contenente le piante inoculate dalla scatola di inoculazione.Coprire l'appartamento con una cupola di plastica e posizionarlo in una camera di crescita a 22 gradi Celsius e 65% di umidità relativa. La fenotipizzazione della malattia può essere eseguita a 5 o 8-12 giorni dopo l'inoculazione. Converti le scatole di cartone in una scatola di inoculazione rimuovendo i lati superiore e inferiore della scatola, nastrando l'angolo per rassodarlo e montando una rete di 50 micrometri sulla parte superiore con colla.Spostare l'appartamento contenente le piante all'interno della camera di inoculazione e posizionare la scatola di inoculazione più piccola sopra l'appartamento per coprire le piante. Quindi rimuovere e spazzolare le spore. Crea una mini scatola di inoculazione leggermente più grande di una capsula di Petri.Conservare i piatti a quattro gradi Celsius in frigorifero fino all'uso. Tagliare una o due foglie completamente espanse dalla base del picciolo per ogni pianta da testare. Inserire il picciolo delle foglie staccate nel mezzo agar con un angolo di 30 gradi.Inoculare le foglie all'interno della camera di inoculazione e spostare la piastra con il coperchio in una camera di crescita. Per valutare i fenotipi dell'infezione, trasferire le foglie in una piastra di agar MS asettico fresco a quattro o cinque giorni dopo l'inoculazione. Tagliare la base del picciolo prima di inserire le foglie nel mezzo di agar fresco.Valutare i fenotipi della malattia a otto o nove giorni dopo l'inoculazione. L'analisi microscopica ha mostrato una distribuzione uniforme delle spore sui vetrini microscopici sul fondo dell'appartamento. La densità calcolata delle spore, distribuite in sei diverse posizioni dopo inoculazioni leggere, non ha mostrato differenze significative.Risultati simili sono stati raggiunti a seguito di pesanti inoculazioni con spore. L'uniformità dell'inoculazione è stata esaminata tra diversi genotipi vegetali a 12 giorni dopo l'inoculazione pesante. Le piante pad4-1 hanno mostrato una maggiore suscettibilità alla malattia rispetto alla Columbia 0, le piante selvatiche.L'uso di spore fresche adeguate, prodotte circa 10 giorni dopo l'inoculazione, su piante sensibili, è importante, perché le spore fresche sono più facili da rimuovere e hanno maggiori probabilità di stabilire la colonizzazione. L'oidio colonizza solo le cellule epidermiche delle piante. L'isolamento delle cellule infette da oidio mediante peeling dell'epidermide, o microdissezione laser, consentirebbe uno studio trascrittomico e proteomico più mirato delle risposte dell'ospite.Questo metodo aiuterà i ricercatori a determinare in modo più efficiente i fenotipi di infezione da muffa da polvere e quindi dovrebbe facilitare studi funzionali più efficaci sulle interazioni dell'oidio delle piante.

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