Name: an easy and flexible inoculation method for accurately assessing powdery mildew-infection phenotypes of arabidopsis and other plants
Uploaded: 2021-03-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Easy and Flexible Inoculation Method for Accurately Assessing Powdery Mildew-Infection Phenotypes of Arabidopsis and Other Plants at JoVE.com

この研究は、国立科学財団(IOS-1901566)によってS.シャオに支援されました。著者らは、植物成長施設のメンテナンスについてF.コーカーとC.フックス、および接種ボックスとチャンバーの製造に関連する技術的支援を提供してくれたホルヘサモラに感謝したいと思います。

1.メッシュで取り付けられた取り外し可能な上蓋を備えた標準的な接種ボックスを作る
<ol><li>50μmのナイロンメンブレンメッシュまたは48μmのステンレスメッシュ(推奨)のロールを店舗から購入してください。摩耗したメッシュを交換するために、14インチx26インチの複数の部分に切断するのに十分な量を注文してください。</li>
	<li>1/4インチx 2フィートx4フィートの中密度繊維板または合板を...

<ol>
	<li>Huckelhoven, R., Panstruga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+bi+ology+of+the+plant-powdery+mildew+interaction.">Cell bi ology of the plant-powdery mildew interaction.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 738-746 (2011).</li><li>Dean, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+top+10+fungal+pathogens+in+molecular+plant+pathology.">The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).</li><li>Sakurai, H., Hirata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+observations+on+the+relation+between+the+penetration+hypha+and+haustorium+of+barley+powdery+mildew+and+host+cell.+V.+Influence+of+water+spray+on+the+pathogen+and+host+tissue.">Some observations on the relation between the penetration hypha and haustorium of barley powdery mildew and host cell. V. Influence of water spray on the pathogen and host tissue.</a> Annual Phytopathology Society of Japan. 24, 239-245 (1959).</li><li>Shomari, S. H., Kennedy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+Oidium+anacardii+on+cashew+(Anacardium+occidentale)+in+southern+Tanzania.">Survival of Oidium anacardii on cashew (Anacardium occidentale) in southern Tanzania.</a> Plant Pathology. 48 (4), 505-513 (1999).</li><li>Sitterly, W. R., Spencer, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Powdery Mildews. , 369 (1978).</li><li>Reuveni, M., Agapov, V., Reuveni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+systemic+resistance+to+powdery+mildew+and+growth+increase+in+cucumber+by+phosphates.">Induction of systemic resistance to powdery mildew and growth increase in cucumber by phosphates.</a> Biological Agriculture &amp; Horticulture. 9 (4), 305-315 (1993).</li><li>Reifschneider, F. J. B., Boiteux, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vacuum-operated+settling+tower+for+inoculation+of+powdery+mildew+fungi.">A vacuum-operated settling tower for inoculation of powdery mildew fungi.</a> Phytopathology. 78 (11), 1463-1465 (1988).</li><li>Chowdhury, A., Bremer, G. B., Salt, D. W., Miller, P., Ford, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+of+delivering+Blumeria+graminis+f.+sp+hordei+spores+for+laboratory+experiments.">A novel method of delivering Blumeria graminis f. sp hordei spores for laboratory experiments.</a> Crop Protection. 22 (7), 917-922 (2003).</li><li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad-spectrum+mildew+resistance+in+Arabidopsis+thaliana+mediated+by+RPW8.">Broad-spectrum mildew resistance in Arabidopsis thaliana mediated by RPW8.</a> Science. 291 (5501), 118-120 (2001).</li><li>Xiao, S., Ellwood, S., Findlay, K., Oliver, R. P., Turner, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+three+loci+controlling+resistance+of+Arabidopsis+thaliana+accession+Ms-0+to+two+powdery+mildew+diseases.">Characterization of three loci controlling resistance of Arabidopsis thaliana accession Ms-0 to two powdery mildew diseases.</a> The Plant Journal. 12 (4), 757-768 (1997).</li><li>Reuber, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+defense+gene+induction+defects+with+powdery+mildew+susceptibility+in+Arabidopsis+enhanced+disease+susceptibility+mutants.">Correlation of defense gene induction defects with powdery mildew susceptibility in Arabidopsis enhanced disease susceptibility mutants.</a> The Plant Journal. 16 (4), 473-485 (1998).</li><li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atypical+resistance+gene,+RPW8,+recruits+components+of+basal+defence+for+powdery+mildew+resistance+in+Arabidopsis.">The atypical resistance gene, RPW8, recruits components of basal defence for powdery mildew resistance in Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 42 (1), 95-110 (2005).</li></ol>

メッシュボックスベースの接種方法は、他の接種方法に比べていくつかの利点があります。まず、 図5に示すように、適切に操作すれば胞子の均一な分布を実現できます。第二に、~50μmのメッシュの使用に加えて、感染した葉の穏やかな振とうによる胞子除去は、ソース植物に存在するアザミウマまたは他の植物感染昆虫による植物感染を減らすことができます。第三?...

うどんこ病は、多くの食用作物や観賞用植物の最も一般的で重要な病気の1つです1。うどんこ病の研究は非常に人気があり、Web of Scienceでは「うどんこ病」をキーワードにした検索結果として10,500件以上の出版物が掲載されています(2020年11月現在)。確かに、うどんこ病(Blumeria graminisに代表される)は、Molecular Plant Pathology2のジャーナルによってトップ10の真菌病原体の1つと考えられています。病害感受性の定量化は、病害抵抗性または感受性に寄与する植物遺伝子の特性評価、またはうどんこ病における候補エフェクター遺伝子の機能同定に必要なステップです。しかし、うどんこ病の胞子とは異なり、うどんこ病種の胞子(私たちの研究室での経験に基づくGolovinomyces cichoracearum UCSC1など)は、水懸濁プロセスを経た後、生存率の低下を示すため、他のほとんどの真菌性病原体と比較して、信頼性の高い病気の表現型ははるかに困難です3,4.特定のうどんこ病病原体を試験植物に不適切および/または不均一に接種すると、表現型の結果が不正確になる可能性があります。
うどんこ病の研究では、多くの接種方法が報告されています。これらには、(i)感染した葉から試験植物5への胞子のブラッシング、(ii)試験植物6への胞子懸濁液の噴霧、(iii)塔7の下部にある植物への真空作動沈殿塔を使用した胞子の吹き付け、および(iv)ナイロンメッシュ膜と音ベースの振動の組み合わせ使用による胞子送達8.胞子ブラッシング(またはダスティング)法は、実行は簡単ですが、本質的に不均一であるため、定量的評価には正確ではない場合があります。胞子散布は便利で均一ですが、上記のように胞子の発芽が悪くなる可能性があります4。後者の2つ(すなわち、iii-iv)は、均一な接種を達成することができるはるかに改良された方法である。しかし、どちらも1回のイベントで接種する植物の数に関して接種能力を調整するのに柔軟性がなく、どちらの装置も自明ではなく、操作は真空および/または電源がある実験室エリアに限定されます。
私たちの研究室は、20年以上にわたって植物とうどんこ病の相互作用に取り組んできました9,10。過去10年間、私たちは多くの接種方法をテストし、最近、シンプルで効果的なうどんこ病接種方法を開発しました。このメッシュベースの胞子ブラッシング法は、均一な接種を保証することができ、シンプルでスケーラブルであるため、うどんこ病を扱うすべての研究室で簡単に採用できるはずです。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >&#160;48 &#181;m stainless steel grid mesh screen; Size: 24&#34; X 48&#34;&#160;</td>
			<td >Amazon</td>
			<td >NA</td>
			<td >For making the lid of an inoculation box</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >#6-32 x &#190;&#34; machine screws, flat washers and nuts&#160;</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >NA</td>
			<td>For making an inoculation chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >#6-32 zinc plated nylon lock nut (4-Pack)</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >NA</td>
			<td>For making an inoculation chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >#6-32x3/8&#8221; Phillips flat head machine screws, flat washers and nuts&#160;</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >NA</td>
			<td>For securing&#160; magnet door catch plates</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >#8-32x1/2&#34; machine screws, flat washers and nuts</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >NA</td>
			<td>For securing corner braces and door hinge</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet;&#160; Size: 17 &#189;&#34; X 20&#34;</td>
			<td >Professional Plastics</td>
			<td >SACR.250CEF</td>
			<td>For making an inoculation chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18&#34; X 20&#34;&#160;&#160;</td>
			<td >Professional Plastics</td>
			<td >&#160;SACR.250CEF</td>
			<td>For making an inoculation chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18&#34; X 30&#34;&#160;</td>
			<td >Professional Plastics</td>
			<td >SACR.250CEF</td>
			<td>For making an inoculation chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 20&#34; X 29 &#189; &#34;</td>
			<td >Professional Plastics</td>
			<td >SACR.250CEF</td>
			<td>For making an inoculation chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1-5/8&#34; cabinet door magnetic catch white</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >Model #P110-W</td>
			<td>For making an inoculation chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2&#34; steel zinc-plated corner brace (8-Pack)&#160;</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >&#160;Model #13611&#160;</td>
			<td>For making an inoculation box &#38; chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3&#34; Corner Clamp</td>
			<td>Harbor Freight Tools</td>
			<td>SKU 63653, 1852, 60589</td>
			<td>For making inoculation chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3/4&#34;&#160; steel zinc plated corner brace (4-Pack)</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >Model #13542</td>
			<td>For making an inoculation box &#38; chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4-7/8&#34; zinc-plated light duty door pull handles</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >Model #15184</td>
			<td>For making an inoculation box</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fine fan-blender brushes</td>
			<td>Michaels Store</td>
			<td>M10472846&#160;</td>
			<td>For inoculation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kelleher 3/4&#34; x 3/4&#34; x 36&#34; wood square dowel&#160;</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >NA</td>
			<td>For making the lid of an inoculation box</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medium density fiberboard (1/4&#34; x 2&#39; x 4&#39;);&#160;</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >Model# 1508104</td>
			<td>For making an inoculation box</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Round glass coverslips with a 500 &#181;m grid</td>
			<td >ibidi USA Inc.</td>
			<td >10816</td>
			<td>For determining&#160; spore density</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an easy and flexible inoculation method for accurately assessing powdery mildew-infection phenotypes of arabidopsis and other plants

真菌病による作物の損失を減らすには、植物の免疫と真菌の病因を支配するメカニズムの理解を深める必要があり、特定の真菌病原体に感染したときの植物の病気の表現型を正確に決定する必要があります。しかし、うどんこ病などの培養不可能な生物栄養性真菌病原体による正確な疾患表現型は、達成が容易ではなく、研究プロジェクトの律速ステップになる可能性があります。ここでは、シロイヌナズナとうどんこ病の相互作用を例に、安全で効率的で操作しやすい疾患表現型システムを開発しました。このシステムは主に3つのコンポーネントで構成されています:(i)真菌胞子を植物のフラットに接種するための~50μmの細孔のステンレス鋼またはナイロンメッシュに取り付けられた取り外し可能な蓋を備えた木製の接種ボックス、(ii)内部で接種を行いながら胞子の脱出を最小限に抑えるための小さな前面開口部を備えた透明なプラスチックチャンバー。 (iii)均一かつ効果的な接種のための胞子の脱落および分布方法。 ここで説明するプロトコルには、接種ボックスとプラスチックチャンバーを低コストで作成するための手順とパラメーター、およびシステムを使用してうどんこ病胞子を均一に接種できるようにし、病気の表現型の精度と再現性を向上させる方法のビデオデモンストレーションが含まれています。

ここでは、準備、操作、調整が容易な新しいうどんこ病胞子接種方法を紹介します。 図1 は、50μmのメンブレンメッシュで取り付けられた取り外し可能な蓋のメーカーに重点を置いた標準接種ボックスの組み立てを示しています。 図2 は、接種室の組み立てを示す。 図3 は、このシステムを使用した接種プロセスの主要なス?...

Watch this Scientific Journal Video about An Easy and Flexible Inoculation Method for Accurately Assessing Powdery Mildew-Infection Phenotypes of Arabidopsis and Other Plants at JoVE.com

An Easy and Flexible Inoculation Method for Accurately Assessing Powdery Mildew-Infection Phenotypes of Arabidopsis and Other Plants

~50 μmメッシュの接種ボックスと透明なプラスチックチャンバーからなる簡単な胞子分布システムを構築するためのプロトコルを提示します。これにより、うどんこ病胞子を植物に均一に接種できるため、研究中の植物の病害表現型を正確かつ再現性よく評価できます。

シロイヌナズナなどのうどんこ病感染表現型を正確に評価するための簡便かつ柔軟な接種法

Reducing crop losses due to fungal diseases requires improved understanding of the mechanisms governing plant immunity and fungal pathogenesis, which in ...

うどんこ病は重要な植物病害です。疾患表現型を正確に決定するには、病原体の接種さえも必要である。既存の方法は非効率的であるため、このプロトコルを開発しました。私たちの胞子接種方法は、簡単に均一な接種を達成でき、シンプルでスケーラブルです。したがって、うどんこ病を扱うラボでは、この方法を簡単に使用できます。研究者は、段ボール箱の上にメッシュを取り付けて、胞子の接種に使用することもできます。胞子を取り除き、メッシュを通してそれらを磨く方法は重要なステップです。したがって、これをビデオで示すことは非常に役立ちます。このプロトコルでは、50マイクロメートルのナイロンメンブレンメッシュまたは48マイクロメートルのステンレス鋼メッシュのロールを入手してください。大きなサイズの中密度合板を24.5X10インチと12X10インチの小片にカットして接種ボックスを作ります。メッシュで取り外し可能な上蓋を作るには、長い木製の四角いダボを26インチと12.75インチの2つのセットにカットします。箱の周りに収まるように4つの部分を接着して釘付けします。アクリルシートを取り、8つのコーナークランプを使用して、すべてのアクリルシートを箱に組み立てます。箱のアクリルシートの前面にある7X2インチの開口部の窓を切り取ります。新鮮なうどんこ病胞子を接種菌として調製するには、摂氏22度、相対湿度65%の成長チャンバーで6〜8週間、きれいなシロイヌナズナ免疫不全pad4-1変異植物を育てます。標準的なフラットで感染表現型を決定するために植物を育てます。pad4-1植物の1つまたは半分を接種して、十分な新鮮なうどんこ病胞子を作成します。感染した植物からの新鮮な胞子が利用可能になったら、感染検査のために接種室内の接種ボックス内に植物のフラットを移動します。重度に感染したシロイヌナズナの葉を15〜20枚切り、凝縮水がある場合は乾燥させます。一対の長い鉗子で片手で1〜2枚の葉を逆さまに持ちます。次に、両手をチャンバーの開口部に通し、接種ボックスに取り付けられたメッシュの上に葉をゆっくりと動かしながら、ハサミで鉗子の腕をそっと叩きます。細かいファンブレンダーブラシで胞子を磨き、メッシュ表面全体をさまざまな方向にブラシで塗り、胞子を植物に均一に分布させます。ブラシでメッシュを数回軽くたたいて、メッシュに付着した胞子を振り落とします。胞子が落ち着いたら、接種植物が入っているフラットを接種ボックスから移動します。フラットをプラスチック製のドームで覆い、摂氏22度、相対湿度65%の成長チャンバーに入れます。疾患の表現型は、接種後5日または8〜12日で実施することができる。段ボール箱を接種箱に変換するには、箱の上面と下面を取り外し、角をテープで固定し、接着剤で上部に50マイクロメートルのメッシュを取り付けます。植物が入っているフラットを接種チャンバー内に移動し、小さな接種ボックスをフラットの上に置いて植物を覆います。次に、胞子を取り除き、磨きます。ペトリ皿より少し大きいミニ接種ボックスを作ります。プレートは、使用するまで冷蔵庫に摂氏4度で保管してください。テストする各植物について、葉柄の根元から1つか2つの完全に拡張した葉を切り取ります。剥離した葉の葉柄を30度の角度で寒天培地に挿入します。接種チャンバー内に葉を接種し、蓋付きのプレートを成長チャンバーに移動します。感染表現型を評価するには、接種後4〜5日で葉を新鮮な無菌MS寒天プレートに移します。葉を新鮮な寒天培地に挿入する前に、葉柄の付け根を切ります。接種後8日または9日で疾患の表現型を評価します。顕微鏡分析では、フラットの底にある顕微鏡スライドに胞子の均一な分布が示されました。光接種後に6つの異なる場所に分布した胞子の計算密度は、有意差を示さなかった。胞子を大量に接種した後も同様の結果が得られました。接種均一性を、重接種後12日目に異なる植物遺伝子型間で調べた。pad4-1植物は、野生型植物であるコロンビア0と比較して病害感受性を高めた。新鮮な胞子は除去しやすく、コロニー形成を確立する可能性が高いため、接種後約10日で生産される適切な新鮮な胞子を感受性植物に使用することが重要です。うどんこ病は植物の表皮細胞にのみコロニーを形成します。表皮を剥離することによるうどんこ病感染細胞の単離、またはレーザーマイクロダイセクションは、宿主応答のより標的を絞ったトランスクリプトームおよびプロテオミクス研究を可能にします。この方法は、研究者がうどんこ病感染表現型をより効率的に決定するのに役立ち、したがって、植物のうどんこ病相互作用に関するより効果的な機能研究を促進するはずです。

Research

JoVE Journal

Biology

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine (P. taeda L.) and Other Conifer Species

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine P. taeda L. and Other Conifer Species

ロボロリーパインからのRNA分離の改良法（ P. taeda L.）及びその他の針葉樹種

Tissues isolated from conifer species, particularly those belonging to the Pinaceae family, such as loblolly pine (Pinus taeda L.), contain high ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

アイスキャップ：成長させる方法シロイヌナズナ</emハイスループットジェノタイピング用96ウェルプレートで>とトマト

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

イメージングのための簡単​​な方法シロイヌナズナ浸潤イメージング媒体としてPerfluorodecalinを使って葉

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

時空のCaを測定する<sup&gt; 2 +</supシロイヌナズナ植物における&gt;シグナル

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Construction of an Affordable and Easy-to-Build Zebrafish Facility

手ごろな価格で簡単に構築ゼブラフィッシュ施設の建設

In vivo biomedical research is pivotal to translate in vitro findings into clinical advances. Small academic institutions with limited resources find it ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

工場ポリソームプロファイリングのための簡単​​な方法

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

発光時計レポーターとシロイヌナズナプロトプラストトランスフェにおける概日表現型の迅速分析

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

3Dスフェロイド生産のための効率的で柔軟な細胞凝集法

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

高スループット シロイヌナズナ種子の殺菌のための標準化された方法

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...