Name: an easy and flexible inoculation method for accurately assessing powdery mildew-infection phenotypes of arabidopsis and other plants
Uploaded: 2021-03-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Easy and Flexible Inoculation Method for Accurately Assessing Powdery Mildew-Infection Phenotypes of Arabidopsis and Other Plants at JoVE.com

El trabajo fue apoyado por la National Science Foundation (IOS-1901566) a S. Xiao. Los autores desean agradecer a F. Coker y C. Hooks por el mantenimiento de la instalación de crecimiento de la planta, y a Jorge Zamora por la ayuda técnica asociada con la fabricación de la caja y la cámara de inoculación.

1. Hacer una caja de inoculación estándar con una tapa superior extraíble montada con una malla
<ol><li>Compre un rollo de malla de membrana de nylon de 50 μm o malla de acero inoxidable de 48 μm (recomendado) en las tiendas. Asegúrese de pedir suficiente para cortar en múltiples piezas de 14 pulgadas x 26 pulgadas para reemplazar la malla desgastada.</li>
	<li>Compre un tablero de fibra de densidad media o madera contrachapada de densidad media de 1/4 de pulgada x 2 pies de 2 pies x 4 pies, y corte dos de 24-1/...

<ol>
	<li>Huckelhoven, R., Panstruga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+bi+ology+of+the+plant-powdery+mildew+interaction.">Cell bi ology of the plant-powdery mildew interaction.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 738-746 (2011).</li><li>Dean, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+top+10+fungal+pathogens+in+molecular+plant+pathology.">The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).</li><li>Sakurai, H., Hirata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+observations+on+the+relation+between+the+penetration+hypha+and+haustorium+of+barley+powdery+mildew+and+host+cell.+V.+Influence+of+water+spray+on+the+pathogen+and+host+tissue.">Some observations on the relation between the penetration hypha and haustorium of barley powdery mildew and host cell. V. Influence of water spray on the pathogen and host tissue.</a> Annual Phytopathology Society of Japan. 24, 239-245 (1959).</li><li>Shomari, S. H., Kennedy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+Oidium+anacardii+on+cashew+(Anacardium+occidentale)+in+southern+Tanzania.">Survival of Oidium anacardii on cashew (Anacardium occidentale) in southern Tanzania.</a> Plant Pathology. 48 (4), 505-513 (1999).</li><li>Sitterly, W. R., Spencer, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Powdery Mildews. , 369 (1978).</li><li>Reuveni, M., Agapov, V., Reuveni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+systemic+resistance+to+powdery+mildew+and+growth+increase+in+cucumber+by+phosphates.">Induction of systemic resistance to powdery mildew and growth increase in cucumber by phosphates.</a> Biological Agriculture &amp; Horticulture. 9 (4), 305-315 (1993).</li><li>Reifschneider, F. J. B., Boiteux, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vacuum-operated+settling+tower+for+inoculation+of+powdery+mildew+fungi.">A vacuum-operated settling tower for inoculation of powdery mildew fungi.</a> Phytopathology. 78 (11), 1463-1465 (1988).</li><li>Chowdhury, A., Bremer, G. B., Salt, D. W., Miller, P., Ford, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+of+delivering+Blumeria+graminis+f.+sp+hordei+spores+for+laboratory+experiments.">A novel method of delivering Blumeria graminis f. sp hordei spores for laboratory experiments.</a> Crop Protection. 22 (7), 917-922 (2003).</li><li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad-spectrum+mildew+resistance+in+Arabidopsis+thaliana+mediated+by+RPW8.">Broad-spectrum mildew resistance in Arabidopsis thaliana mediated by RPW8.</a> Science. 291 (5501), 118-120 (2001).</li><li>Xiao, S., Ellwood, S., Findlay, K., Oliver, R. P., Turner, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+three+loci+controlling+resistance+of+Arabidopsis+thaliana+accession+Ms-0+to+two+powdery+mildew+diseases.">Characterization of three loci controlling resistance of Arabidopsis thaliana accession Ms-0 to two powdery mildew diseases.</a> The Plant Journal. 12 (4), 757-768 (1997).</li><li>Reuber, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+defense+gene+induction+defects+with+powdery+mildew+susceptibility+in+Arabidopsis+enhanced+disease+susceptibility+mutants.">Correlation of defense gene induction defects with powdery mildew susceptibility in Arabidopsis enhanced disease susceptibility mutants.</a> The Plant Journal. 16 (4), 473-485 (1998).</li><li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atypical+resistance+gene,+RPW8,+recruits+components+of+basal+defence+for+powdery+mildew+resistance+in+Arabidopsis.">The atypical resistance gene, RPW8, recruits components of basal defence for powdery mildew resistance in Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 42 (1), 95-110 (2005).</li></ol>

Nuestro método de inoculación basado en caja mallada tiene varias ventajas sobre otros métodos de inoculación. En primer lugar, puede lograr una distribución uniforme de las esporas si se opera correctamente, como se demuestra en la Figura 5. En segundo lugar, el uso de malla de ~ 50 μm, más el desplazamiento de esporas mediante el suave movimiento de las hojas infectadas puede reducir la infección de las plantas por trips u otros insectos que infectan las plantas que están presente...

El mildiú polvoriento es una de las enfermedades más comunes e importantes de numerosos cultivos alimentarios y plantas ornamentales1. Los estudios de las enfermedades del mildiú polvoriento han sido muy populares, como lo demuestran más de 10,500 publicaciones como resultado de la búsqueda con "mildiú polvoriento" como palabra clave en Web of Science (a partir de noviembre de 2020). De hecho, el mildiú polvoriento (representado por Blumeria graminis) es considerado uno de los 10 principales patógenos fúngicos por la revista Molecular Plant Pathology2. La cuantificación de la susceptibilidad a enfermedades es un paso necesario en la caracterización de los genes de las plantas que contribuyen a la resistencia o susceptibilidad a las enfermedades, o la identificación funcional de genes efectores candidatos en el mildiú polvoriento. Sin embargo, el fenotipado confiable de la enfermedad es mucho más difícil con el mildiú polvoriento en comparación con la mayoría de los otros patógenos fúngicos, en parte porque, a diferencia de las esporas de estos últimos, las esporas de especies de mildiú polvoriento (como Golovinomyces cichoracearum UCSC1 según nuestra experiencia de laboratorio) muestran una viabilidad reducida después de pasar por un proceso de suspensión de agua 3,4 . La inoculación inadecuada y/o desigual de plantas de ensayo con un patógeno particular del mildiú polvoriento puede dar lugar a resultados de fenotipado inexactos.
Se informaron varios métodos de inoculación para estudios de mildiú polvoriento. Estos incluyen (i) cepillado de esporas directamente de las hojas infectadas para probar plantas5, (ii) pulverización de una suspensión de esporas para probar plantas6, (iii) soplado de esporas utilizando una torre de sedimentación operada por vacío a las plantas en la parte inferior de la torre7, y (iv) entrega de esporas mediante el uso combinatorio de una membrana de malla de nylon y vibración basada en el sonido8 . El método de cepillado de esporas (o desempolvado) es fácil de realizar pero de naturaleza desigual, por lo que puede no ser preciso para la evaluación cuantitativa. La pulverización de esporas es conveniente y uniforme, pero como se indicó anteriormente puede resultar en una germinación deficiente de las esporas4. Los dos últimos (es decir, iii-iv) son métodos muy mejorados capaces de lograr una inoculación uniforme; Sin embargo, ambos no son flexibles para ajustar su capacidad de inoculación en términos del número de plantas a inocular en un solo evento, por lo que cualquiera de los aparatos no es trivial, y su operación está restringida a áreas de laboratorio donde hay un vacío y / o fuente de electricidad.
Nuestro laboratorio ha estado trabajando con la interacción planta-mildiú polvoriento durante más de 20 años 9,10. Durante la última década, probamos una serie de métodos de inoculación y recientemente desarrollamos un método de inoculación de mildiú polvoriento simple pero efectivo. Este método de cepillado de esporas basado en malla puede garantizar una inoculación uniforme, y es simple y escalable, por lo que debe ser fácilmente adoptado por cualquier laboratorio que trabaje con mildiú polvoriento.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >&#160;48 &#181;m stainless steel grid mesh screen; Size: 24&#34; X 48&#34;&#160;</td>
			<td >Amazon</td>
			<td >NA</td>
			<td >For making the lid of an inoculation box</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >#6-32 x &#190;&#34; machine screws, flat washers and nuts&#160;</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >NA</td>
			<td>For making an inoculation chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >#6-32 zinc plated nylon lock nut (4-Pack)</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >NA</td>
			<td>For making an inoculation chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >#6-32x3/8&#8221; Phillips flat head machine screws, flat washers and nuts&#160;</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >NA</td>
			<td>For securing&#160; magnet door catch plates</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >#8-32x1/2&#34; machine screws, flat washers and nuts</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >NA</td>
			<td>For securing corner braces and door hinge</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet;&#160; Size: 17 &#189;&#34; X 20&#34;</td>
			<td >Professional Plastics</td>
			<td >SACR.250CEF</td>
			<td>For making an inoculation chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18&#34; X 20&#34;&#160;&#160;</td>
			<td >Professional Plastics</td>
			<td >&#160;SACR.250CEF</td>
			<td>For making an inoculation chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18&#34; X 30&#34;&#160;</td>
			<td >Professional Plastics</td>
			<td >SACR.250CEF</td>
			<td>For making an inoculation chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 20&#34; X 29 &#189; &#34;</td>
			<td >Professional Plastics</td>
			<td >SACR.250CEF</td>
			<td>For making an inoculation chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1-5/8&#34; cabinet door magnetic catch white</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >Model #P110-W</td>
			<td>For making an inoculation chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2&#34; steel zinc-plated corner brace (8-Pack)&#160;</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >&#160;Model #13611&#160;</td>
			<td>For making an inoculation box &#38; chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3&#34; Corner Clamp</td>
			<td>Harbor Freight Tools</td>
			<td>SKU 63653, 1852, 60589</td>
			<td>For making inoculation chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3/4&#34;&#160; steel zinc plated corner brace (4-Pack)</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >Model #13542</td>
			<td>For making an inoculation box &#38; chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4-7/8&#34; zinc-plated light duty door pull handles</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >Model #15184</td>
			<td>For making an inoculation box</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fine fan-blender brushes</td>
			<td>Michaels Store</td>
			<td>M10472846&#160;</td>
			<td>For inoculation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kelleher 3/4&#34; x 3/4&#34; x 36&#34; wood square dowel&#160;</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >NA</td>
			<td>For making the lid of an inoculation box</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medium density fiberboard (1/4&#34; x 2&#39; x 4&#39;);&#160;</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >Model# 1508104</td>
			<td>For making an inoculation box</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Round glass coverslips with a 500 &#181;m grid</td>
			<td >ibidi USA Inc.</td>
			<td >10816</td>
			<td>For determining&#160; spore density</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an easy and flexible inoculation method for accurately assessing powdery mildew-infection phenotypes of arabidopsis and other plants

La reducción de las pérdidas de cultivos debido a enfermedades fúngicas requiere una mejor comprensión de los mecanismos que rigen la inmunidad de las plantas y la patogénesis fúngica, lo que a su vez requiere una determinación precisa de los fenotipos de enfermedades de las plantas tras la infección con un patógeno fúngico en particular. Sin embargo, el fenotipado preciso de la enfermedad con patógenos fúngicos biotróficos no cultivables, como el mildiú polvoriento, no es fácil de lograr y puede ser un paso limitante de la velocidad de un proyecto de investigación. Aquí, hemos desarrollado un sistema de fenotipado de enfermedades seguro, eficiente y fácil de operar utilizando la interacción Arabidopsis-mildiú polvoriento como ejemplo. Este sistema consta principalmente de tres componentes: (i) una caja de inoculación de madera equipada con una tapa extraíble montada con una malla de acero inoxidable o nylon de poros de ~ 50 μm para inocular un plano de plantas con esporas de hongos, (ii) una cámara de plástico transparente con una pequeña abertura frontal para minimizar el escape de esporas mientras se realiza la inoculación en el interior, y iii) un método de distribución y desplazamiento de esporas para una inoculación uniforme y eficaz. Los protocolos descritos aquí incluyen los pasos y parámetros para hacer la caja de inoculación y la cámara de plástico a bajo costo, y una demostración en video de cómo usar el sistema para permitir una inoculación uniforme con esporas de mildiú polvoriento, mejorando así la precisión y la reproducibilidad del fenotipado de la enfermedad.

Aquí, presentamos un nuevo método de inoculación de esporas de mildiú polvoriento que es fácil de preparar, operar y ajustar. La Figura 1 muestra el montaje de la caja de inoculación estándar con énfasis en la marca de la tapa extraíble montada con una malla de membrana de 50 μm. La figura 2 muestra el montaje de la cámara de inoculación. La Figura 3 ilustra los pasos clave del proceso de inoculación utilizando este sis...

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An Easy and Flexible Inoculation Method for Accurately Assessing Powdery Mildew-Infection Phenotypes of Arabidopsis and Other Plants

Presentamos un protocolo para construir un sistema simple de distribución de esporas que consiste en una caja de inoculación con una malla de ~ 50 μm y una cámara de plástico transparente. Esto se puede utilizar para inocular uniformemente las plantas con esporas de mildiú polvoriento, lo que permite una evaluación precisa y reproducible de los fenotipos de enfermedades de las plantas en estudio.

Un método de inoculación fácil y flexible para evaluar con precisión los fenotipos de infección por mildiú polvoriento de Arabidopsis y otras plantas

Reducing crop losses due to fungal diseases requires improved understanding of the mechanisms governing plant immunity and fungal pathogenesis, which in ...

El mildiú polvoriento es una enfermedad importante de las plantas. La determinación precisa del fenotipo de la enfermedad requiere incluso la inoculación del patógeno. Dado que los métodos existentes son ineficientes, hemos desarrollado este protocolo.Nuestro método de inoculación de esporas puede lograr fácilmente una inoculación uniforme, y es simple y escalable. Por lo tanto, cualquier laboratorio que trabaje con mildiú polvoriento puede usar fácilmente este método. Los investigadores también pueden montar malla sobre una caja de cartón y usarla para la inoculación de esporas.Cómo desalojar las esporas y cepillarlas a través de la malla es un paso crítico. Así que demostrar esto en video podría ser muy útil. Para este protocolo, obtenga un rollo de malla de membrana de nylon de 50 micrómetros o malla de acero inoxidable de 48 micrómetros.Corte madera contrachapada de tamaño grande y densidad media en trozos de 24.5X10 pulgadas y 12X10 pulgadas para hacer una caja de inoculación. Para hacer una tapa superior extraíble con una malla, corte la clavija cuadrada larga de madera en dos juegos de 26 pulgadas y 12.75 pulgadas. Pegue y clave las cuatro piezas para que quepan alrededor de la caja.Tome láminas de acrílico y ensamble todas las hojas de acrílico en una caja, usando ocho abrazaderas de esquina. Corte una ventana de apertura de 7X2 pulgadas en la parte frontal de la lámina de acrílico de la caja. Para preparar esporas frescas de mildiú polvoriento como inóculos, cultive plantas mutantes limpias de Arabidopsis inmunocomprometidas pad4-1 en una cámara de crecimiento a 22 grados centígrados y 65% de humedad relativa durante seis a ocho semanas.Cultive las plantas para determinar los fenotipos de infección en pisos estándar. Inocular una o la mitad de las plantas pad4-1 para construir suficientes esporas frescas de mildiú polvoriento. Cuando haya esporas frescas de plantas infectadas disponibles, mueva un plano de plantas a la caja de inoculación dentro de la cámara de inoculación para una prueba de infección.Corte de 15 a 20 hojas de Arabidopsis muy infectadas y déjelas secar si hay agua condensada. Sostenga una o dos hojas boca abajo en una mano con un par de pinzas largas. Luego coloque ambas manos a través de la abertura de la cámara y golpee suavemente el brazo de los fórceps con un par de tijeras, mientras mueve lentamente las hojas por encima de la malla montada en la caja de inoculación.Cepille las esporas con cepillos finos de licuadora de ventilador a través de toda la superficie de la malla en diferentes direcciones para maximizar la distribución uniforme de las esporas en las plantas. Acaricia suavemente la malla varias veces con los cepillos para sacudir las esporas atrapadas en la malla. Una vez que las esporas se asienten, saque el plano que contiene las plantas inoculadas de la caja de inoculación.Cubra el piso con una cúpula de plástico y colóquelo en una cámara de crecimiento a 22 grados centígrados y 65% de humedad relativa. El fenotipado de la enfermedad se puede realizar a los 5 u 8 a 12 días después de la inoculación. Convierta las cajas de cartón en una caja de inoculación quitando los lados superior e inferior de la caja, pegando la esquina para reafirmarla y montando una malla de 50 micrómetros en la parte superior con pegamento.Mueva el plano que contiene las plantas dentro de la cámara de inoculación y coloque la caja de inoculación más pequeña en la parte superior del plano para cubrir las plantas. Luego desaloje y cepille las esporas. Haga una mini caja de inoculación un poco más grande que una placa de Petri.Guarde los platos a cuatro grados centígrados en un refrigerador hasta que los use. Corte una o dos hojas completamente expandidas de la base del pecíolo para cada planta a probar. Inserte el pecíolo de las hojas separadas en el medio de agar en un ángulo de 30 grados.Inocular las hojas dentro de la cámara de inoculación y mover la placa con la tapa a una cámara de crecimiento. Para evaluar los fenotipos de infección, transfiera las hojas a una placa de agar MS aséptica fresca a los cuatro o cinco días después de la inoculación. Corte la base del pecíolo antes de insertar las hojas en el medio de agar fresco.Evaluar los fenotipos de la enfermedad a los ocho o nueve días después de la inoculación. El análisis microscópico mostró una distribución uniforme de las esporas en los portaobjetos microscópicos en la parte inferior del plano. La densidad calculada de esporas, distribuidas en seis lugares diferentes después de las inoculaciones ligeras, no mostró diferencias significativas.Se lograron resultados similares después de fuertes inoculaciones con esporas. La uniformidad de la inoculación se examinó entre diferentes genotipos de plantas a los 12 días después de la inoculación pesada. Las plantas pad4-1 mostraron una mayor susceptibilidad a las enfermedades en comparación con Columbia 0, las plantas de tipo silvestre.El uso de esporas frescas adecuadas, producidas alrededor de 10 días después de la inoculación, en plantas susceptibles, es importante, porque las esporas frescas son más fáciles de desalojar y más propensas a establecer la colonización. El mildiú polvoriento solo coloniza las células epidérmicas de las plantas. El aislamiento de células infectadas por mildiú polvoriento mediante la descamación de la epidermis, o microdisección con láser, permitiría un estudio transcriptómico y proteómico más específico de las respuestas del huésped.Este método ayudará a los investigadores a determinar de manera más eficiente los fenotipos de infección por mildiú en polvo y, por lo tanto, debería facilitar estudios funcionales más efectivos sobre las interacciones del mildiú polvoriento de las plantas.

Research

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