Name: isolation of primary rat hepatocytes with multiparameter perfusion control
Uploaded: 2021-04-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control at JoVE.com

يتم دعم هذا العمل جزئيا من قبل وزارة التربية والتعليم ARC (MOE2017-T2-1-149) ؛ منحة بذور الابتكار في NUHS 2017 (NUHSRO/2017/051/InnovSeed/02) ؛ معهد علم الأحياء الميكانيكي في سنغافورة (R-714-106-004-135); ومعهد الهندسة الحيوية وتكنولوجيا النانو، مجلس البحوث الطبية الحيوية، وكالة العلوم والتكنولوجيا والبحوث (A*STAR) (أرقام المشاريع IAF-PP H18/01/a0/014، IAF-PP H18/01/a0/K14 و MedCaP-LOA-18-02) تمويل إلى هانري يو. نغ تشان واي هو باحث باحث في جامعة سنغافورة الوطنية. نود أن نشكر وحدة المجهر البؤري ووحدة قياس التدفق الخلوي بجامعة سنغافورة الوطنية على المساعدة والمشورة في تحليل نقاء خلايا الكبد.

تم تنفيذ جميع الإجراءات وإسكان الحيوانات بموجب البروتوكول رقم R15-0027 و R19-0669 وفقا لمتطلبات اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) التابعة لجامعة سنغافورة الوطنية.
1. إعداد المحاليل والأدوات الجراحية
<ol><li>قم بإعداد المخازن المؤقتة ووسائط زراعة الخلايا في الجدول ...

<ol>
	<li>Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. H., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+rat+hepatic+cells.">Isolation and primary culture of rat hepatic cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).</li><li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion.">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).</li><li>Green, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+primary+hepatocytes+from+human+tissue:+optimising+the+use+of+small+non-encapsulated+liver+resection+surplus.">The isolation of primary hepatocytes from human tissue: optimising the use of small non-encapsulated liver resection surplus.</a> Cell and Tissue Banking. 18 (4), 597-604 (2017).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).</li><li>Gopalakrishnan, S., Harris, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+liver+endocytosis+followed+by+purification+of+liver+cells+by+liver+perfusion.">In vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3138 (2011).</li><li>Wen, J. W., Olsen, A. L., Perepelyuk, M., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+rat+portal+fibroblasts+by+in+situ+liver+perfusion.">Isolation of rat portal fibroblasts by in situ liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3669 (2012).</li><li>Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+3D+collagen+sandwich+culture+of+primary+mouse+hepatocytes+to+study+the+role+of+cytoskeleton+in+bile+canalicular+formation+in+vitro.">Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60501 (2019).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+purification+of+immune+cells+from+the+liver.">Isolation and purification of immune cells from the liver.</a> International Immunopharmacology. 85 (95), 106632 (2020).</li><li>Salem, E. S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+mouse+hepatocytes+for+nascent+protein+synthesis+analysis+by+non-radioactive+L-azidohomoalanine+labeling+method.">Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive L-azidohomoalanine labeling method.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323 (2018).</li><li>Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethered+spheroids+as+an+in+vitro+hepatocyte+model+for+drug+safety+screening.">Tethered spheroids as an in vitro hepatocyte model for drug safety screening.</a> Biomaterials. 33 (7), 2165-2176 (2012).</li><li>Kegel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+isolation+of+primary+human+hepatocytes+and+corresponding+major+populations+of+non-parenchymal+liver+cells.">Protocol for isolation of primary human hepatocytes and corresponding major populations of non-parenchymal liver cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53069 (2016).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vertical-flow+bioreactor+array+compacts+hepatocytes+for+enhanced+polarity+and+functions.">A vertical-flow bioreactor array compacts hepatocytes for enhanced polarity and functions.</a> Lab on a Chip. 16 (20), 3898-3908 (2016).</li><li>Du, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+sandwich+culture+of+3D+hepatocyte+monolayer.">Synthetic sandwich culture of 3D hepatocyte monolayer.</a> Biomaterials. 29 (3), 290-301 (2008).</li><li>Tong, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constrained+spheroids+for+prolonged+hepatocyte+culture.">Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture.</a> Biomaterials. 80, 106-120 (2016).</li><li>Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar-flow+immediate-overlay+hepatocyte+sandwich+perfusion+system+for+drug+hepatotoxicity+testing.">Laminar-flow immediate-overlay hepatocyte sandwich perfusion system for drug hepatotoxicity testing.</a> Biomaterials. 30 (30), 5927-5936 (2009).</li><li>Gupta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+canaliculi+contract+autonomously+by+releasing+calcium+into+hepatocytes+via+mechanosensitive+calcium+channel.">Bile canaliculi contract autonomously by releasing calcium into hepatocytes via mechanosensitive calcium channel.</a> Biomaterials. 259, 120283 (2020).</li><li>Horner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Percoll+purification+on+isolation+of+primary+human+hepatocytes.">Impact of Percoll purification on isolation of primary human hepatocytes.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6542 (2019).</li><li>Osypiw, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpopulations+of+rat+hepatocytes+separated+by+Percoll+density-gradient+centrifugation+show+characteristics+consistent+with+different+acinar+locations.">Subpopulations of rat hepatocytes separated by Percoll density-gradient centrifugation show characteristics consistent with different acinar locations.</a> The Biochemical Journal. 304, 617-624 (1994).</li><li>Beal, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+animal+model+of+ex+vivo+normothermic+liver+perfusion.">A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541 (2018).</li><li>Hillebrandt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedure+for+decellularization+of+rat+livers+in+an+oscillating-pressure+perfusion+device.">Procedure for decellularization of rat livers in an oscillating-pressure perfusion device.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), e53029 (2015).</li></ol>

هناك بعض النقاط التي من المهم بشكل خاص ملاحظتها لإجراء تروية الكولاجيناز المكون من خطوتين بشكل عام. أولا ، يجب إيلاء عناية خاصة عند استئصال الكبد. تأكد من عدم تلف الجهاز الهضمي لأن تسرب المحتويات سيؤدي إلى تلوث بكتيري. بالإضافة إلى ذلك ، تجنب إتلاف كبسولة غليسون ، التي تغطي سطح الكبد أثناء ...

خلايا الكبد الأولية هي أدوات مهمة للبحوث الأساسية المتعلقة بالكبد ، وعلاج الأمراض ، والتطبيق مثل اختبار المخدرات. المعيار الذهبي الحالي لعزل خلايا الكبد الأولية هو إجراء تروية الكولاجيناز المكون من خطوتين 1،2،3 الذي قدمه Seglen في 1970s4. ومع ذلك ، فإن هذا الإجراء يمثل تحديا تقنيا ولديه معدل فشل مرتفع عند إجرائه من قبل الجراحين المبتدئين. حتى عندما يعتبر التروية ناجحا ، يمكن ملاحظة اختلافات جذرية في صلاحية خلايا الكبد (عادة 60٪ -95٪) والعائد (0.5-5 × 108 لكل 200-300 غرام من الفئران) بين العزلات. وهذا يؤثر على جودة وحجم التجارب النهائية. بصرف النظر عن الإجراء الفني ، فإن إعداد التروية المستخدم في العزل ، سواء كان متاحا تجاريا أو مخصصا ، هو عامل مساهم. يجب إيلاء الاهتمام لتجميع وتحسين وصيانة إعداد التروية. الغرض من هذا البروتوكول هو تحسين معدل النجاح والاستقرار بين عزل خلايا كبد الفئران الأولية من خلال التحكم في التروية متعددة المعلمات للإجراء الفني وإعداد التروية لإجراء تروية الكولاجيناز المكون من خطوتين.
من الجانب التقني ، فإن الخطوة الأكثر صعوبة في الإجراء هي تعليب الوريد البابي. أما بالنسبة للخطوات الأخرى ، إذا لوحظت الممارسة الجيدة وتم اتخاذ الاحتياطات العامة ، يمكن تحسين استقرار العزل. لذلك ، فإن فهم المنطق لكل خطوة مهم حتى يتمكن الجراح من الاستجابة للمتغيرات المختلفة التي قد تحدث أثناء الإجراء.
تم نشر بروتوكولات مختلفة لعزل خلايا الكبد وخلايا الكبد غير المتنية من الفئران والفئران1،2،5،6،7،8،9. كان لإعدادات التروية المستخدمة في هذه البروتوكولات العديد من العيوب ، والتي تشمل إعادة استخدام أنابيب التروية ، ومشاكل في التحكم في درجة الحرارة ، والحاجة إلى التحسين الروتيني لمعلمات التروية ، و / أو استخدام نوع غير مناسب من القسطرة الوريدية (IV) لقنية الوريد البابي. ستزيد إعادة استخدام أنابيب التروية من فرص التلوث ، خاصة إذا لم يتم تنظيف الأنابيب وتطهيرها بشكل صحيح. كما أن إعادة استخدام الأنابيب دون استبدال روتيني سيعرض إعداد التروية لمشاكل مثل الأنابيب أو الموصلات المتسربة ، ومصيدة الفقاعات المسدودة والأنابيب الضيقة ، وكلها ستقلل بشكل كبير من ضغط البيرفوسات ومعدل التدفق ، وبالتالي ، مما يؤثر على كفاءة هضم الكبد. بدون مصدر حرارة ثابت في بعض الإعدادات للتحكم في درجة الحرارة ، سوف تبرد المخازن المؤقتة التي تم تسخينها مسبقا بمرور الوقت ، مما يؤدي إلى انخفاض نشاط الكولاجيناز والهضم. على الرغم من أن الإعدادات الأخرى تستخدم مكثفا زجاجيا مغلفا متصلا بجهاز تدوير المياه لتدفئة المخزن المؤقت ، إلا أنها ضخمة وتتطلب تنظيفا دقيقا. يجب قياس درجة الحرارة والضغط ومعدل تدفق المخزن المؤقت الخارج من القسطرة وتحسينه قبل بدء العزل لضمان حالة تروية مستقرة. حتى بعد التحسين ، لا يزال من الممكن أن تتغير المعلمات في منتصف الطريق أثناء العزل بسبب تصرفات المشغل ، مما يؤدي إلى التروية والهضم دون المستوى الأمثل. معظم أنواع القسطرة الوريدية ليست مناسبة لتعليب الوريد البابي لأنها لا تسمح بالتروية المستمرة أثناء التعليب. إنهم غير قادرين على إبلاغ الجراح على الفور عند نجاح القنية. علاوة على ذلك ، من الصعب تأمين الوريد البابي على القسطرة الناعمة دون تشويهها.
هنا ، نعالج هذه المشكلات باستخدام أنابيب معقمة موحدة يمكن التخلص منها ، وسترة سخان سيليكون للتحكم الدقيق والمستقر في درجة الحرارة ، ونظام المراقبة والإنذار في الوقت الفعلي مع تخزين البيانات وإدارتها واستخدام قسطرة IV خاصة ، والتي تسمح بالتروية المستمرة أثناء ثقب الوريد البابي أثناء التعليب. على حد علمنا ، نحن أول مجموعة تجمع بين كل هذه الميزات في نظام تروية متكامل (IPS) صغير الحجم ، مما يجعله محمولا للغاية وقادرا على وضعه في غطاء تدفق صفحي لضمان التشغيل المعقم.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Nipro</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>Nipro</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black braided silk non-absorbable, non-sterile surgical suture</td>
			<td>Look</td>
			<td>SP117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bochem 18/10 stainless steel forceps, sharp tip contain bent round tip</td>
			<td>Bochem</td>
			<td>10333511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Perfusion Set</td>
			<td>Vasinfuse</td>
			<td>BPF-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floating circular 1.5 mL microcentrifuge tube rack</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>German Standard Tissue Forceps, Serrated / 1&#215;2 teeth , 14.5cm</td>
			<td>Walentech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Cellstar aspirating pipette</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GN710183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrated Perfusion System</td>
			<td>Vasinfuse</td>
			<td>IPS-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors curved, stainless, 11cm</td>
			<td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td>
			<td>CVD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope with 10X lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh Sheet 100&#181;M Nylon</td>
			<td>Spectra-Teknic(s) Pte Ltd</td>
			<td>06630-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors, BL/BL, 13cm</td>
			<td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td>
			<td>STR &#8211; BL/BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors, SH/BL, 13cm</td>
			<td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td>
			<td>STR &#8211; SH/BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse force hemostatic clip</td>
			<td>Shanghai Jin Zhong Pte Ltd</td>
			<td>XEC230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents/Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>137101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17104019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>TCI</td>
			<td>D1961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31600-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11344-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1-9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC26764.298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type I bovine collagen</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>William&#8217;s E Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W1878</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary rat hepatocytes with multiparameter perfusion control

تستخدم خلايا الكبد الأولية على نطاق واسع في البحوث الأساسية حول أمراض الكبد واختبار السمية في المختبر. يعد إجراء تروية الكولاجيناز المكون من خطوتين لعزل خلايا الكبد الأولية تحديا تقنيا ، خاصة في تعليب الوريد البابي. الإجراء عرضة أيضا للتلوث العرضي والاختلافات في ظروف التروية بسبب الصعوبات في تجميع أو تحسين أو صيانة إعداد التروية. هنا ، يتم تقديم بروتوكول مفصل لإجراء محسنة من خطوتين لتروية الكولاجيناز مع التحكم في التروية متعدد المعلمات. تم عزل خلايا كبد الفئران الأولية بنجاح وموثوقية من خلال اتخاذ الاحتياطات التقنية اللازمة في الخطوات الحرجة للإجراء ، وعن طريق الحد من الصعوبة التشغيلية والتخفيف من تباين معلمات التروية من خلال اعتماد قسطرة وريدية خاصة ، وأنابيب معقمة موحدة يمكن التخلص منها ، والتحكم في درجة الحرارة ، ونظام المراقبة والإنذار في الوقت الفعلي. تظهر خلايا كبد الفئران الأولية المعزولة باستمرار قابلية عالية للخلايا (85٪ -95٪) ، والعائد (2-5 × 108 خلايا لكل 200-300 غرام من الفئران) والوظائف (الألبومين واليوريا ونشاط CYP). وقد استكمل هذا الإجراء بنظام متكامل لتروية الدم، وهو مدمج بما يكفي ليتم إعداده في غطاء التدفق الرقائقي لضمان التشغيل المعقم.

يمكن للجراح معرفة ما إذا كان تروية الكبد تسير بسلاسة من خلال مراقبة النتيجة بعد خطوات معينة. يمكن ملاحظة النتيجة الأولى عند القنية ، وقطع IVC تحت الرهابية ، واستعادة معدل تدفق التروية. يجب أن يكون الكبد قد تغير لونه تماما من الأحمر الداكن إلى البني ، مع الحفاظ على حجمه. إذا كان الكبد يبدو منك?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control at JoVE.com

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

يفصل هذا البروتوكول استخدام قسطرة وريدية خاصة ، وأنابيب معقمة موحدة يمكن التخلص منها ، والتحكم في درجة الحرارة تكملها مراقبة في الوقت الفعلي ، ونظام إنذار لإجراء تروية الكولاجيناز المكون من خطوتين لتحسين الاتساق في صلاحية خلايا كبد الفئران الأولية المعزولة وإنتاجيتها ووظائفها.

عزل خلايا كبد الفئران الأولية مع التحكم في التروية متعدد المعلمات

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...

يعتمد بروتوكول عزل خلايا كبد الفئران هذا على استئصال الكبد قبل نهج الهضم. يقدم البروتوكول نظام تروية متكامل مدمج ومحمول لعزل الخلايا. تتضمن هذه التقنية إعادة تدوير الكولاجيناز مما يقلل من حجم استخدام الكولاجيناز ، ويوفر المزيد من المرونة في تمديد وقت الهضم مع ضمان إنتاجية عالية من الجاذبية ووظيفة محددة لخلايا الكبد.ضع الفئران في غطاء محرك السيارة. بعد قطع عضلات البطن ، ادفع الأمعاء إلى اليمين مع الجزء الخلفي من الملقط المنحني. كسر الغشاء تحت القناة الصفراوية مع طرف الملقط المنحني لحلقة خياطة حول الوريد البابي والقناة الصفراوية.استخدم خياطة جراحية حريرية لصنع رباط فضفاض للغاية حول الوريد البابي بالقرب من الكبد ، قبل فروع الوريد مباشرة إلى اليسار واليمين في فصوص الكبد المختلفة. حوالي سنتيمترين إلى ثلاثة سنتيمترات في المنبع من الرباط الأول ، قبل أن يتفرع الوريد المعدي مباشرة من الوريد البابي ، يخلق ثقبا عبر الأنسجة الموجودة أسفل الوريد البابي بأطراف زوجين من الملقط المنحني. ثم قم بتمديد الثقب لدعم الوريد البابي أثناء التعليب.منع تراكم الضغط في الكبد عن طريق تقليل سرعة المضخة إلى أربعة دورات في الدقيقة لمعدل تدفق يبلغ حوالي ثلاثة ملليلتر في الدقيقة. وتأكد من تقليل تدفق المخزن المؤقت الخالي من الكالسيوم من القسطرة الوريدية إلى تنقيط بطيء. أثناء دعم الوريد البابي بلطف باستخدام ملقط ، أمسك القسطرة الوريدية مع توجيه شطبة الإبرة لأعلى.وأدخل الإبرة في الوريد البابي بزاوية 10 إلى 20 درجة. ثم تقدم ببطء حتى يكون الشطب كله داخل الوريد. يجب أن يؤدي الإدخال الصحيح إلى تبييض لون الكبد.قم بتحريك القنية فوق الإبرة ، وسحب الإبرة خلف القنية عن طريق سحب الجناح إلى الخلف بإصبع السبابة أثناء إمساك القسطرة بالإبهام والإصبع الأوسط. قم بتثبيت الوريد البابي على القسطرة باستخدام مشبك الوريد والمشبك أسفل الوريد البابي لتجنب انقطاع التدفق المندمج. بعد ذلك ، قم بقطع الوريد الأجوف السفلي السفلي لمنع تراكم الضغط في الكبد ، وراقب نبضات الدم الدافعة لضمان القطع الصحيح.قم بزيادة سرعة المضخة إلى 38 دورة في الدقيقة بمعدل تدفق يبلغ حوالي 33 ملليلتر في الدقيقة. وغسل الكبد ثلاث مرات عن طريق إغلاق الوريد الأجوف السفلي السفلي بالملقط لمدة ثانيتين إلى ثلاث ثوان ، ثم إعادة فتحه. من أجل اختراق جميع فصوص الكبد ، اضبط موضع طرف القنية وتأكد من وضعه قبل فروع الوريد البابي في فصوص الكبد المختلفة.بعد ذلك ، قم بتشديد الرباط الفضفاض حول الوريد البابي ، قليلا في المنبع من نقطة التفرع ، وتأمين موضع القنية في الوريد البابي لمنع التدفق العكسي للمخزن المؤقت عن طريق عمل ثلاث عقد عند النقطة التي تدعم فيها الإبرة الصلبة القنية ، بين الشطبة والثقب الجانبي. بعد استئصال الكبد ، اسمح للكبد بالتغلغل مع المخزن المؤقت الخالي من الكالسيوم لمدة 12 دقيقة. ثم ، قم بتشديد المشبك الأسطواني للمخزن المؤقت الخالي من الكالسيوم وقم بفك المشبك الأسطواني للمخزن المؤقت للكولاجيناز لتغيير المخزن المؤقت للتروية.بعد أن يصل الكولاجيناز العازل إلى الكبد ، اغسل الكبد ثلاث مرات عن طريق إغلاق الوريد الأجوف السفلي فوق الكبدي لمدة ثانيتين إلى ثلاث ثوان وإعادة فتحه. حرك الكبد بعناية إلى المرحلة الموجودة أعلى الكأس لإعادة تدوير مخزن الكولاجيناز العازل عن طريق تثبيت الحجاب الحاجز بالملقط مع دعم القسطرة ، مع الحرص على عدم سحب القسطرة لمنع الانفصال العرضي. هضم الكبد لمدة 12 دقيقة ، ووقف التروية عندما يفقد الكبد قوامه البني الناعم ويصبح طريا.تمديد وقت الهضم إذا لزم الأمر. بعد هضم الكبد قطع الوريد البوابة بعناية إزالة الكانيولا. ثم نقل الكبد إلى DMEM البارد لعزل خلايا الكبد.اضغط بلطف على الكبد باستخدام الجانب الخلفي من الملقط المنحني لكسر وتقشير كبسولة الغلاتس. وإطلاق خلايا الكبد عن طريق تمايل الكبد بلطف في DMEM حتى يتم فصل الخلايا تماما في الوسائط. كانت صلاحية خلايا الكبد بين 88 إلى 94.8٪ كما هو محدد من خلال الرحلة والعد الأزرق.كان محصول خلايا الكبد من الفئران التي تزن 200 إلى 300 جرام يصل إلى خمس مرات 10 إلى الخلايا الثامنة لكل عزلة. تظهر الصور التمثيلية تعليق خلايا الكبد غير النقي وتعليق خلايا الكبد المنقي. كانت نقاء خلايا الكبد المعزولة حوالي 96.8٪ والتي تم تحديدها كميا عن طريق حساب الخلايا الملطخة بالفلورسنت الإيجابية للألبومين بالنسبة إلى العدد الإجمالي لنوى الخلية.في الصور التمثيلية الموضحة بلون زائف ، يمثل اللون الأخضر الألبومين ، ويشير اللون الأزرق إلى نوى الخلية مع الألبومين. يتم تمييز نوى الخلايا بدون ألبومين باللون الأحمر. شكلت خلايا الكبد في مزرعة الساندويتش كاناليكولي الصفراوي المتميز ، وكان لها اتصال جيد بالخلايا الخلوية.كما هو موضح في اختبارات الألبومين واليوريا والسيتوكروم P450 ، أظهرت خلايا الكبد إفرازا عاليا لليوريا والألبومين. في اليوم الثالث ، أظهرت خلايا الكبد أنشطة إنزيمية عالية ل CYP1A2 و CYP2B1/2 و CYP3B2. كن مستعدا عقليا قبل إدخال الإبرة في الوريد البابي.عند الإدخال ، سيحتاج الجراح إلى الاستمرار بدون نبض حتى يتم زيادة سرعة المضخة بعد قطع IVC.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

الابتدائية ثقافة الكبار Myocytes قلب فأر

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

عزل الخلايا الليفية بوابة الجرذ من قبل<em&gt; في الموقع</em&gt; الكبد الإرواء

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

العزلة والثقافة الأساسي في الخلايا الكبدية الجرذ

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

عزل الخلايا المناعية من الأورام الأولية

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells

زراعة النخاع الابتدائية الجرذ الداخلية جمع خلايا القناة

Arginine-vasopressin (AVP) facilitates water reabsorption by renal collecting duct principal cells and thereby fine-tunes body water homeostasis. AVP ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

العزلة والثقافة من الماوس الأساسي خلايا البنكرياس عنيبية

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

عزل خلايا الكبد البشرية من قبل خطوتين كولاجيناز الإرواء الداخلي

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

العزلة والثقافة الابتدائية من خلايا الفأر الأورطي غشائي

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

تقرير من أكسدة الأحماض الدهنية وتكون الدهون في خلايا الكبد الفأر الابتدائية

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

بروتوكول لعزل خلايا الكبد الإنسان الابتدائية والموافق السكان الرئيسية للخلايا الكبد غير متني

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...