Name: isolation of primary rat hepatocytes with multiparameter perfusion control
Uploaded: 2021-04-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control at JoVE.com

Dette arbejde støttes delvist af MOE ARC (MOE2017-T2-1-149); NUHS Innovation Seed Grant 2017 (NUHSRO/2017/051/InnovSeed/02); Mekanobiologi Institut i Singapore (R-714-106-004-135); og Institut for Bioengineering og Nanoteknologi, Biomedicinsk Forskningsråd, Agenturet for Videnskab, Teknologi og Forskning (A* STAR) (Projektnumre IAF-PP H18/01/a0/014, IAF-PP H18/01/a0/K14 og MedCaP-LOA-18-02) finansiering til Hanry Yu. Ng Chan Way er forsker ved National University of Singapore. Vi vil gerne takke Confocal Microscopy Unit & Flow Cytometry Unit ved National University of Singapore for hjælp og rådgivning i hepatocytrenhedsanalyse.

Alle procedurer og stalde blev udført under protokolnummer R15-0027 og R19-0669 i overensstemmelse med kravene fra Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved National University of Singapore.
1. Fremstilling af opløsninger og kirurgiske instrumenter
<ol><li>Forbered buffere og cellekulturmedier i tabel 1 ved hjælp af ultrarent vand.</li>
	<li>Forvarm den calciumfrie buffer og kollagenasebufferen til 37 °C i et vandbad inden brug.</li>
	<li>Autoklave følgend...

<ol>
	<li>Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. H., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+rat+hepatic+cells.">Isolation and primary culture of rat hepatic cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).</li><li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion.">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).</li><li>Green, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+primary+hepatocytes+from+human+tissue:+optimising+the+use+of+small+non-encapsulated+liver+resection+surplus.">The isolation of primary hepatocytes from human tissue: optimising the use of small non-encapsulated liver resection surplus.</a> Cell and Tissue Banking. 18 (4), 597-604 (2017).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).</li><li>Gopalakrishnan, S., Harris, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+liver+endocytosis+followed+by+purification+of+liver+cells+by+liver+perfusion.">In vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3138 (2011).</li><li>Wen, J. W., Olsen, A. L., Perepelyuk, M., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+rat+portal+fibroblasts+by+in+situ+liver+perfusion.">Isolation of rat portal fibroblasts by in situ liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3669 (2012).</li><li>Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+3D+collagen+sandwich+culture+of+primary+mouse+hepatocytes+to+study+the+role+of+cytoskeleton+in+bile+canalicular+formation+in+vitro.">Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60501 (2019).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+purification+of+immune+cells+from+the+liver.">Isolation and purification of immune cells from the liver.</a> International Immunopharmacology. 85 (95), 106632 (2020).</li><li>Salem, E. S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+mouse+hepatocytes+for+nascent+protein+synthesis+analysis+by+non-radioactive+L-azidohomoalanine+labeling+method.">Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive L-azidohomoalanine labeling method.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323 (2018).</li><li>Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethered+spheroids+as+an+in+vitro+hepatocyte+model+for+drug+safety+screening.">Tethered spheroids as an in vitro hepatocyte model for drug safety screening.</a> Biomaterials. 33 (7), 2165-2176 (2012).</li><li>Kegel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+isolation+of+primary+human+hepatocytes+and+corresponding+major+populations+of+non-parenchymal+liver+cells.">Protocol for isolation of primary human hepatocytes and corresponding major populations of non-parenchymal liver cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53069 (2016).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vertical-flow+bioreactor+array+compacts+hepatocytes+for+enhanced+polarity+and+functions.">A vertical-flow bioreactor array compacts hepatocytes for enhanced polarity and functions.</a> Lab on a Chip. 16 (20), 3898-3908 (2016).</li><li>Du, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+sandwich+culture+of+3D+hepatocyte+monolayer.">Synthetic sandwich culture of 3D hepatocyte monolayer.</a> Biomaterials. 29 (3), 290-301 (2008).</li><li>Tong, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constrained+spheroids+for+prolonged+hepatocyte+culture.">Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture.</a> Biomaterials. 80, 106-120 (2016).</li><li>Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar-flow+immediate-overlay+hepatocyte+sandwich+perfusion+system+for+drug+hepatotoxicity+testing.">Laminar-flow immediate-overlay hepatocyte sandwich perfusion system for drug hepatotoxicity testing.</a> Biomaterials. 30 (30), 5927-5936 (2009).</li><li>Gupta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+canaliculi+contract+autonomously+by+releasing+calcium+into+hepatocytes+via+mechanosensitive+calcium+channel.">Bile canaliculi contract autonomously by releasing calcium into hepatocytes via mechanosensitive calcium channel.</a> Biomaterials. 259, 120283 (2020).</li><li>Horner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Percoll+purification+on+isolation+of+primary+human+hepatocytes.">Impact of Percoll purification on isolation of primary human hepatocytes.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6542 (2019).</li><li>Osypiw, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpopulations+of+rat+hepatocytes+separated+by+Percoll+density-gradient+centrifugation+show+characteristics+consistent+with+different+acinar+locations.">Subpopulations of rat hepatocytes separated by Percoll density-gradient centrifugation show characteristics consistent with different acinar locations.</a> The Biochemical Journal. 304, 617-624 (1994).</li><li>Beal, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+animal+model+of+ex+vivo+normothermic+liver+perfusion.">A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541 (2018).</li><li>Hillebrandt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedure+for+decellularization+of+rat+livers+in+an+oscillating-pressure+perfusion+device.">Procedure for decellularization of rat livers in an oscillating-pressure perfusion device.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), e53029 (2015).</li></ol>

Der er et par punkter, der er særligt vigtige at observere for to-trins collagenase perfusionsprocedure generelt. For det første skal der udvises særlig omhu ved resektering af leveren. Sørg for, at mave-tarmkanalen ikke beskadiges, da lækage af indholdet vil resultere i bakteriel forurening. Derudover skal du undgå at beskadige Glissons kapsel, som dækker leverens overflade under dyreproceduren. Hvis tåren er stor nok, kan det tillade for tidlig frigivelse af disassocierede hepatocytter i kollagenasebufferen. Fo...

Primære hepatocytter er vigtige værktøjer til leverrelateret grundforskning, sygdomsbehandling og anvendelse såsom lægemiddeltestning. Den nuværende guldstandard for primær hepatocytisolering er to-trins collagenase perfusionsprocedure 1,2,3 introduceret af Seglen i 1970'erne4. Denne procedure er imidlertid teknisk udfordrende og har en høj fejlrate, når den udføres af nybegyndere. Selv når en perfusion betragtes som vellykket, kan der observeres drastiske forskelle i hepatocyts levedygtighed (typisk 60%-95%) og udbytte (0,5-5 x 108 pr. 200-300 g rotte) mellem isolationer. Dette påvirker kvaliteten og omfanget af downstream-eksperimenter. Bortset fra den tekniske procedure er perfusionsopsætningen, der anvendes til isoleringen, enten kommercielt tilgængelig eller specialbygget, en medvirkende faktor. Der skal lægges vægt på montering, optimering og vedligeholdelse af perfusionsopsætningen. Formålet med denne protokol er at forbedre succesraten og stabiliteten mellem isolationer af primære rotte hepatocytter gennem multiparameter perfusionskontrol af den tekniske procedure og perfusionsopsætning af to-trins kollagenaseperfusionsproceduren.
Fra det tekniske aspekt er det sværeste trin i proceduren portalvene kanyleringen. Hvad angår de andre trin, kan isolationens stabilitet forbedres, hvis god praksis overholdes, og der træffes generelle forholdsregler. Derfor er forståelsen af begrundelsen for hvert trin vigtig, så kirurgen kan reagere på forskellige variabler, der kan opstå under proceduren.
Forskellige protokoller for isolering af hepatocytter og lever ikke-parenkymale celler fra rotte og mus er blevet offentliggjort 1,2,5,6,7,8,9. Perfusionsopsætningerne, der blev anvendt i disse protokoller, havde flere ulemper, som omfatter genbrug af perfusionsrør, problemer med temperaturregulering, behov for rutinemæssig optimering af perfusionsparametre og / eller brug af uegnet type intravenøst (IV) kateter til portalvene kanylet. Genbrug af perfusionsrør vil øge chancerne for forurening, især hvis slangen ikke blev rengjort og desinficeret korrekt. Genbrug af slanger uden rutinemæssig udskiftning vil også udsætte perfusionsopsætningen for problemer som utætte slanger eller stik, tilstoppet boblefælde og indsnævret slange, som alle vil reducere perfusattrykket og strømningshastigheden betydeligt og dermed påvirke leverfordøjelseseffektiviteten. Uden en konstant varmekilde i nogle opsætninger til temperaturregulering vil forvarmede buffere køle ned over tid, hvilket fører til lav kollagenaseaktivitet og fordøjelse. Selvom andre opsætninger bruger en kappeglaskondensator, der er forbundet til en vandcirkulationspumpe for at opvarme bufferen, er de omfangsrige og kræver omhyggelig rengøring. Temperatur, tryk og strømningshastighed for buffer, der forlader kateteret, skal måles og optimeres inden isolationens start for at sikre stabil perfusionstilstand. Selv efter optimering kan parametrene stadig ændre sig halvvejs under isolering på grund af operatørens handlinger, hvilket fører til suboptimal perfusion og fordøjelse. De fleste typer IV-kateter er ikke egnede til portalvenekanskulering, fordi de ikke tillader kontinuerlig perfusion under kanylering. De er ikke i stand til straks at informere kirurgen, når kanyleringen er vellykket. Desuden er det udfordrende at fastgøre portalvenen på det bløde kateter uden at deformere det.
Her løser vi disse problemer ved hjælp af standardiserede engangssterile slanger, en silikonevarmerkappe til præcis og stabil temperaturkontrol, realtidsovervågnings- og alarmsystem med datalagring og styring og brug af et specielt IV-kateter, som muliggør kontinuerlig perfusion, mens du punkterer portalvenen under kanylering. Efter vores bedste overbevisning er vi den første gruppe, der kombinerer alle disse funktioner i et integreret perfusionssystem (IPS), der er kompakt, hvilket gør det meget bærbart og i stand til at passe ind i en laminær flowhætte for at sikre aseptisk drift.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Nipro</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>Nipro</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black braided silk non-absorbable, non-sterile surgical suture</td>
			<td>Look</td>
			<td>SP117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bochem 18/10 stainless steel forceps, sharp tip contain bent round tip</td>
			<td>Bochem</td>
			<td>10333511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Perfusion Set</td>
			<td>Vasinfuse</td>
			<td>BPF-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floating circular 1.5 mL microcentrifuge tube rack</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>German Standard Tissue Forceps, Serrated / 1&#215;2 teeth , 14.5cm</td>
			<td>Walentech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Cellstar aspirating pipette</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GN710183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrated Perfusion System</td>
			<td>Vasinfuse</td>
			<td>IPS-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors curved, stainless, 11cm</td>
			<td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td>
			<td>CVD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope with 10X lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh Sheet 100&#181;M Nylon</td>
			<td>Spectra-Teknic(s) Pte Ltd</td>
			<td>06630-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors, BL/BL, 13cm</td>
			<td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td>
			<td>STR &#8211; BL/BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors, SH/BL, 13cm</td>
			<td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td>
			<td>STR &#8211; SH/BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse force hemostatic clip</td>
			<td>Shanghai Jin Zhong Pte Ltd</td>
			<td>XEC230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents/Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>137101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17104019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>TCI</td>
			<td>D1961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31600-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11344-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1-9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC26764.298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type I bovine collagen</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>William&#8217;s E Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W1878</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary rat hepatocytes with multiparameter perfusion control

Primære hepatocytter anvendes i vid udstrækning i grundforskning i leversygdomme og til toksicitetstest in vitro. To-trins collagenase perfusionsproceduren for primær hepatocytisolering er teknisk udfordrende, især i portalvene kanylering. Proceduren er også tilbøjelig til lejlighedsvis forurening og variationer i perfusionsbetingelser på grund af vanskeligheder med montering, optimering eller vedligeholdelse af perfusionsopsætningen. Her præsenteres en detaljeret protokol for en forbedret to-trins kollagenaseperfusionsprocedure med multiparameterperfusionskontrol. Primære rotte hepatocytter blev med succes og pålideligt isoleret ved at tage de nødvendige tekniske forholdsregler ved kritiske trin i proceduren og ved at reducere driftsvanskelighederne og afbøde variabiliteten af perfusionsparametre gennem vedtagelse af et specielt intravenøst kateter, standardiseret steril engangsslange, temperaturkontrol og realtidsovervågnings- og alarmsystem. De isolerede primære rotte hepatocytter udviser konsekvent høj cellelevedygtighed (85%-95%), udbytte (2-5 x 108 celler pr. 200-300 g rotte) og funktionalitet (albumin, urinstof og CYP-aktivitet). Proceduren blev suppleret med et integreret perfusionssystem, som er kompakt nok til at blive sat op i den laminære flowhætte for at sikre aseptisk drift.

En kirurg kunne fortælle, om leverperfusion foregår glat ved at observere resultatet efter visse trin. Det første resultat kan observeres ved kanylering, skæring af den infrahepatiske IVC og gendannelse af perfusionsstrømningshastigheden. Leveren skulle have ændret farve fuldstændigt fra mørkerød til brun, samtidig med at dens volumen opretholdes. Hvis leveren ser lidt deflateret ud og har en rødlig farvetone eller pletter af rødt, betyder det, at perfusionsstrømningshastigheden blev indstillet forkert (for l...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control at JoVE.com

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Denne protokol beskriver brugen af et specielt intravenøst kateter, standardiseret steril engangsslange, temperaturregulering suppleret med realtidsovervågning og et alarmsystem til to-trins kollagenaseperfusionsprocedure for at forbedre konsistensen i levedygtigheden, udbyttet og funktionaliteten af isolerede primære rotte hepatocytter.

Isolering af primære rotte hepatocytter med multiparameter perfusionskontrol

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...

Denne rotte hepatocytter isolationsprotokol er baseret på leverresektion før fordøjelsen tilgang. Protokollen introducerer et kompakt og bærbart integreret perfusionssystem til celleisolering. Denne teknik involverer kollagenaserecirkulation, som reducerer mængden af kollagenasebrug og giver mere fleksibilitet i forlængelse af fordøjelsestiden, samtidig med at der sikres højt tyngdekraftsudbytte og hepatocytterspecifik funktion.Sæt rotten i emhætten. Efter at have skåret mavemusklerne, skal du skubbe tarmene til højre med bagsiden af den buede tang. Bryd membranen under galdekanalen med spidsen af den buede tang til sløjfe suturen omkring portalvenen og galdegangen.Brug en silke kirurgisk sutur til at lave en meget løs ligatur omkring portalvenen tæt på leveren, lige før venen forgrener sig til venstre og højre i forskellige leverlapper. Omkring to til tre centimeter opstrøms for den første ligatur, lige før mavevenen forgrener sig fra portalvenen, skaber et hul gennem vævet under portalvenen med spidserne af to par buede tang. Stræk derefter hullet for at understøtte portalvenen under kanylering.Undgå trykopbygning i leveren ved at reducere pumpehastigheden til fire omdrejningstal for en strømningshastighed på ca. tre milliliter pr. Minut. Og sørg for, at udstrømningen af den calciumfrie buffer fra det intravenøse kateter reduceres til et langsomt dryp. Mens du forsigtigt støtter portalvenen med tang, skal du holde det intravenøse kateter med nålens skråning vendt op.Og indsæt nålen i portalvenen i en vinkel på 10 til 20 grader. Gå derefter langsomt frem, indtil hele skråningen er inde i venen. Korrekt indsættelse skal resultere i blanchering af leverfarven.Fremryk kanylen over nålen, og træk nålen tilbage bag kanylen ved at trække vingen tilbage med pegefingeren, mens du holder kateteret med tommelfingeren og langfingeren. Fastgør portalvenen på kateteret med en veneklemme og klip under portalvenen for at undgå perfuserende strømningsforstyrrelser. Skær derefter den infrahepatiske ringere vena cava for at forhindre trykopbygning i leveren, og observer for blodspurttende impulser for at sikre det korrekte snit.Forøg pumpehastigheden til 38 omdr./min. for en strømningshastighed på ca. 33 ml pr. Minut. Og skyl leveren tre gange ved at lukke den infrahepatiske ringere vena cava med tang i to til tre sekunder og derefter åbne den igen. For at perfuse alle leverlapper skal du justere kanylespidsens position og sørge for, at den placeres, før portalvenen forgrener sig i forskellige leverlapper.Stram derefter den løse ligatur omkring portalvenen, lidt opstrøms for forgreningspunktet, og fastgør kanylens position i portalvenen for at forhindre tilbagestrømning af bufferen ved at lave tre knuder på det punkt, hvor den hårde nål understøtter kanylen, mellem skråningen og sidehullet. Efter leverresektion tillader leveren at perfuse med den calciumfrie buffer i 12 minutter. Stram derefter rulleklemmen af calciumfri buffer og løsn rulleklemmen af kollagenasebufferen for at ændre perfusionsbufferen.Når kollagenasebufferen når leveren, skylles leveren tre gange ved at lukke den suprahepatiske ringere vena cava i to til tre sekunder og genåbne den. Flyt forsigtigt leveren til scenen oven på bægerglasset for recirkulation af kollagenasebufferen ved at holde membranen med tang, mens du støtter kateteret, og pas på ikke at trække kateteret for at forhindre utilsigtet løsrivelse. Fordøje leveren i 12 minutter, og stop perfusionen, når leveren mister sin glatte brune tekstur og bliver grødet.Forlæng fordøjelsestiden, hvis det er nødvendigt. Efter fordøjelsen af leveren skæres portalvenen forsigtigt fjerne kanylen. Og overfør derefter leveren til kold DMEM for at isolere hepatocytterne.Tryk forsigtigt på leveren ved hjælp af bagsiden af den buede tang for at bryde og skrælle glinskapslen af. Og frigiv levercellerne ved forsigtigt at svinge leveren i DMEM, indtil cellerne er fuldt dissocieret i medierne. Levedygtigheden af hepatocytter var mellem 88 og 94,8% som bestemt af trip og blå tælling.Udbyttet af hepatocytter fra rotter, der vejer 200 til 300 gram, var op til fem gange 10 til de ottende celler pr. Isolation. De repræsentative billeder viser urenset levercellesuspension og renset hepatocytsuspension. Renheden af de isolerede hepatocytter var ca. 96,8%, hvilket blev kvantificeret ved at tælle albuminpositive fluorescerende farvede celler i forhold til det samlede antal cellekerner.På de repræsentative billeder, der vises i falsk farve, repræsenterer grøn albuminet, og blå angiver cellekernerne med albumin. Cellekerner uden albumin fremhæves rødt. Hepatocytterne i sandwichkulturen dannede tydelige galdekanaler og havde god cellecellekontakt.Som det fremgår af albumin-, urinstof- og cytokrom P450-assays, udviste hepatocytterne høj urinstof- og albuminsekretion. På dag tre udviste hepatocytterne høje enzymaktiviteter for CYP1A2, CYP2B1/2 og CYP3B2. Vær mentalt forberedt, før du indsætter nålen i portalvenen.Ved indsættelse skal en kirurg fortsætte uden puls, indtil pumpehastigheden blev øget efter skæring af IVC.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Isolering af rotte portal fibroblaster ved<em&gt; In situ</em&gt; Lever Perfusion

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolering og Primær kultur Rotte levercellerne

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells

Dyrkning Primær Rat Inner Medullær samlekanal Cells

Arginine-vasopressin (AVP) facilitates water reabsorption by renal collecting duct principal cells and thereby fine-tunes body water homeostasis. AVP ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolering og dyrkning af Mouse Primære Pancreas acinarceller

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

Isolering af humane hepatocytter ved en to-trins collagenaseperfusion Procedure

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolering og primær kultur af muse aortaendotelceller

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Bestemmelse af fedtsyreoxidation og lipogenese i Mus primære hepatocytter

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Protokol til Isolering af primære humane hepatocytter og Tilsvarende Major populationer af ikke-parenchymale leverceller

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...