Name: isolation of primary rat hepatocytes with multiparameter perfusion control
Uploaded: 2021-04-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control at JoVE.com

Dit werk wordt gedeeltelijk ondersteund door MOE ARC (MOE2017-T2-1-149); NUHS Innovation Seed Grant 2017 (NUHSRO/2017/051/InnovSeed/02); Mechanobiology Institute of Singapore (R-714-106-004-135); en Institute of Bioengineering and Nanotechnology, Biomedical Research Council, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR) (Project Numbers IAF-PP H18/01/a0/014, IAF-PP H18/01/a0/K14 en MedCaP-LOA-18-02) financiering aan Hanry Yu. Ng Chan Way is een onderzoeker van de National University of Singapore. We willen graag confocale microscopie-eenheid en flowcytometrie-eenheid van de National University of Singapore bedanken voor hulp en advies bij de zuiverheidsanalyse van hepatocyten.

Alle procedures en huisvesting van dieren werden uitgevoerd onder protocolnummers R15-0027 en R19-0669 in overeenstemming met de vereisten van de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de National University of Singapore.
1. Bereiding van oplossingen en chirurgische instrumenten
<ol><li>Bereid buffers en celkweekmedia in tabel 1 voor met ultrapuur water.</li>
	<li>Verwarm de calciumvrije buffer en collagenasebuffer voor gebruik tot 37 °C in een waterbad.</l...

<ol>
	<li>Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. H., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+rat+hepatic+cells.">Isolation and primary culture of rat hepatic cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).</li><li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion.">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).</li><li>Green, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+primary+hepatocytes+from+human+tissue:+optimising+the+use+of+small+non-encapsulated+liver+resection+surplus.">The isolation of primary hepatocytes from human tissue: optimising the use of small non-encapsulated liver resection surplus.</a> Cell and Tissue Banking. 18 (4), 597-604 (2017).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).</li><li>Gopalakrishnan, S., Harris, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+liver+endocytosis+followed+by+purification+of+liver+cells+by+liver+perfusion.">In vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3138 (2011).</li><li>Wen, J. W., Olsen, A. L., Perepelyuk, M., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+rat+portal+fibroblasts+by+in+situ+liver+perfusion.">Isolation of rat portal fibroblasts by in situ liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3669 (2012).</li><li>Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+3D+collagen+sandwich+culture+of+primary+mouse+hepatocytes+to+study+the+role+of+cytoskeleton+in+bile+canalicular+formation+in+vitro.">Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60501 (2019).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+purification+of+immune+cells+from+the+liver.">Isolation and purification of immune cells from the liver.</a> International Immunopharmacology. 85 (95), 106632 (2020).</li><li>Salem, E. S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+mouse+hepatocytes+for+nascent+protein+synthesis+analysis+by+non-radioactive+L-azidohomoalanine+labeling+method.">Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive L-azidohomoalanine labeling method.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323 (2018).</li><li>Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethered+spheroids+as+an+in+vitro+hepatocyte+model+for+drug+safety+screening.">Tethered spheroids as an in vitro hepatocyte model for drug safety screening.</a> Biomaterials. 33 (7), 2165-2176 (2012).</li><li>Kegel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+isolation+of+primary+human+hepatocytes+and+corresponding+major+populations+of+non-parenchymal+liver+cells.">Protocol for isolation of primary human hepatocytes and corresponding major populations of non-parenchymal liver cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53069 (2016).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vertical-flow+bioreactor+array+compacts+hepatocytes+for+enhanced+polarity+and+functions.">A vertical-flow bioreactor array compacts hepatocytes for enhanced polarity and functions.</a> Lab on a Chip. 16 (20), 3898-3908 (2016).</li><li>Du, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+sandwich+culture+of+3D+hepatocyte+monolayer.">Synthetic sandwich culture of 3D hepatocyte monolayer.</a> Biomaterials. 29 (3), 290-301 (2008).</li><li>Tong, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constrained+spheroids+for+prolonged+hepatocyte+culture.">Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture.</a> Biomaterials. 80, 106-120 (2016).</li><li>Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar-flow+immediate-overlay+hepatocyte+sandwich+perfusion+system+for+drug+hepatotoxicity+testing.">Laminar-flow immediate-overlay hepatocyte sandwich perfusion system for drug hepatotoxicity testing.</a> Biomaterials. 30 (30), 5927-5936 (2009).</li><li>Gupta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+canaliculi+contract+autonomously+by+releasing+calcium+into+hepatocytes+via+mechanosensitive+calcium+channel.">Bile canaliculi contract autonomously by releasing calcium into hepatocytes via mechanosensitive calcium channel.</a> Biomaterials. 259, 120283 (2020).</li><li>Horner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Percoll+purification+on+isolation+of+primary+human+hepatocytes.">Impact of Percoll purification on isolation of primary human hepatocytes.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6542 (2019).</li><li>Osypiw, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpopulations+of+rat+hepatocytes+separated+by+Percoll+density-gradient+centrifugation+show+characteristics+consistent+with+different+acinar+locations.">Subpopulations of rat hepatocytes separated by Percoll density-gradient centrifugation show characteristics consistent with different acinar locations.</a> The Biochemical Journal. 304, 617-624 (1994).</li><li>Beal, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+animal+model+of+ex+vivo+normothermic+liver+perfusion.">A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541 (2018).</li><li>Hillebrandt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedure+for+decellularization+of+rat+livers+in+an+oscillating-pressure+perfusion+device.">Procedure for decellularization of rat livers in an oscillating-pressure perfusion device.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), e53029 (2015).</li></ol>

Er zijn een paar punten die bijzonder belangrijk zijn om in acht te nemen voor de tweestaps collagenaseperfusieprocedure in het algemeen. Ten eerste moet speciale zorg worden besteed bij het reseceren van de lever. Zorg ervoor dat het maagdarmkanaal niet wordt beschadigd, omdat lekkage van de inhoud zal leiden tot bacteriële besmetting. Vermijd bovendien beschadiging van de Glisson-capsule, die het oppervlak van de lever bedekt tijdens de dierprocedure. Als de scheur groot genoeg is, kan dit voortijdige afgifte van gedi...

Primaire hepatocyten zijn belangrijke hulpmiddelen voor levergerelateerd fundamenteel onderzoek, ziektebehandeling en toepassing zoals het testen van geneesmiddelen. De huidige gouden standaard voor primaire hepatocytenisolatie is de tweestaps collagenaseperfusieprocedure 1,2,3 geïntroduceerd door Seglen in de jaren 19704. Deze procedure is echter technisch uitdagend en heeft een hoog faalpercentage wanneer uitgevoerd door beginnende chirurgen. Zelfs wanneer een perfusie als succesvol wordt beschouwd, kunnen drastische verschillen in levensvatbaarheid van hepatocyten (typisch 60% -95%) en opbrengst (0,5-5 x 108 per 200-300 g rat) worden waargenomen tussen isolaties. Dit beïnvloedt de kwaliteit en schaal van downstream experimenten. Afgezien van de technische procedure, is de perfusie-opstelling die wordt gebruikt voor de isolatie, commercieel verkrijgbaar of op maat gemaakt, een bijdragende factor. Er moet aandacht worden besteed aan de montage, optimalisatie en het onderhoud van de perfusie-opstelling. Het doel van dit protocol is om het succespercentage en de stabiliteit tussen isolaties van primaire rathepatocyten te verbeteren door middel van multiparameter perfusiecontrole van de technische procedure en perfusie-instelling van de tweestaps collagenaseperfusieprocedure.
Vanuit het technische aspect is de moeilijkste stap in de procedure de portaaladercannulatie. Wat de andere stappen betreft, als goede praktijken in acht worden genomen en algemene voorzorgsmaatregelen worden genomen, kan de stabiliteit van de isolatie worden verbeterd. Daarom is het belangrijk om de redenering voor elke stap te begrijpen, zodat de chirurg kan reageren op verschillende variabelen die tijdens de procedure kunnen optreden.
Verschillende protocollen voor de isolatie van hepatocyten en lever niet-parenchymale cellen van rat en muis zijn gepubliceerd 1,2,5,6,7,8,9. De perfusie-opstellingen die in deze protocollen worden gebruikt, hadden verschillende nadelen, waaronder het hergebruik van perfusiebuizen, problemen met temperatuurregeling, behoefte aan routinematige optimalisatie van perfusieparameters en / of gebruik van ongeschikt type intraveneuze (IV) katheter voor portale aderconnulatie. Het hergebruik van perfusiebuizen vergroot de kans op besmetting, zeker als de slang niet goed gereinigd en gedesinfecteerd is. Hergebruik van buizen zonder routinematige vervanging zal de perfusie-opstelling ook blootstellen aan problemen zoals lekkende buizen of connectoren, verstopte bellenvanger en vernauwde slangen, die allemaal de perfusaatdruk en stroomsnelheid aanzienlijk zullen verminderen, waardoor de efficiëntie van de leververtering wordt beïnvloed. Zonder een constante warmtebron in sommige opstellingen voor temperatuurregeling, zullen voorverwarmde buffers na verloop van tijd afkoelen, wat leidt tot een lage collagenase-activiteit en spijsvertering. Hoewel andere opstellingen een glazen condensor met mantel gebruiken die is aangesloten op een watercirculatiepomp om de buffer te verwarmen, zijn ze omvangrijk en moeten ze zorgvuldig worden gereinigd. Temperatuur, druk en debiet van de buffer die de katheter verlaat, moeten vóór het begin van de isolatie worden gemeten en geoptimaliseerd om een stabiele perfusieconditie te verzekeren. Zelfs na optimalisatie kunnen de parameters nog steeds halverwege de isolatie veranderen als gevolg van de acties van de operator, wat leidt tot suboptimale perfusie en spijsvertering. De meeste soorten IV-katheters zijn niet geschikt voor poortader cannulatie omdat ze geen continue perfusie tijdens cannulatie toestaan. Ze zijn niet in staat om de chirurg onmiddellijk te informeren wanneer de cannulatie succesvol is. Bovendien is het een uitdaging om de poortader op de zachte katheter vast te zetten zonder deze te vervormen.
Hier pakken we deze problemen aan met behulp van gestandaardiseerde steriele wegwerpbuizen, een siliconen verwarmingsmantel voor nauwkeurige en stabiele temperatuurregeling, real-time bewaking en alarmsysteem met gegevensopslag en -beheer en gebruik van een speciale IV-katheter, die continue perfusie mogelijk maakt tijdens het doorboren van de poortader tijdens cannulatie. Voor zover we weten, zijn we de eerste groep die al deze functies combineert in een geïntegreerd perfusiesysteem (IPS) dat compact is, waardoor het zeer draagbaar is en in een laminaire stroomkap kan worden geplaatst om een aseptische werking te garanderen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Nipro</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>Nipro</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black braided silk non-absorbable, non-sterile surgical suture</td>
			<td>Look</td>
			<td>SP117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bochem 18/10 stainless steel forceps, sharp tip contain bent round tip</td>
			<td>Bochem</td>
			<td>10333511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Perfusion Set</td>
			<td>Vasinfuse</td>
			<td>BPF-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floating circular 1.5 mL microcentrifuge tube rack</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>German Standard Tissue Forceps, Serrated / 1&#215;2 teeth , 14.5cm</td>
			<td>Walentech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Cellstar aspirating pipette</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GN710183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrated Perfusion System</td>
			<td>Vasinfuse</td>
			<td>IPS-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors curved, stainless, 11cm</td>
			<td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td>
			<td>CVD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope with 10X lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh Sheet 100&#181;M Nylon</td>
			<td>Spectra-Teknic(s) Pte Ltd</td>
			<td>06630-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors, BL/BL, 13cm</td>
			<td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td>
			<td>STR &#8211; BL/BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors, SH/BL, 13cm</td>
			<td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td>
			<td>STR &#8211; SH/BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse force hemostatic clip</td>
			<td>Shanghai Jin Zhong Pte Ltd</td>
			<td>XEC230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents/Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>137101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17104019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>TCI</td>
			<td>D1961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31600-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11344-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1-9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC26764.298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type I bovine collagen</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>William&#8217;s E Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W1878</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary rat hepatocytes with multiparameter perfusion control

Primaire hepatocyten worden veel gebruikt in fundamenteel onderzoek naar leverziekten en voor toxiciteitstests in vitro. De tweestaps collagenaseperfusieprocedure voor primaire hepatocytenisolatie is technisch uitdagend, vooral bij portale adercannulatie. De procedure is ook gevoelig voor incidentele verontreiniging en variaties in perfusieomstandigheden als gevolg van problemen bij de assemblage, optimalisatie of onderhoud van de perfusie-opstelling. Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor een verbeterde tweestaps collagenaseperfusieprocedure met multiparameterperfusiecontrole. Primaire rattenhepatocyten werden met succes en betrouwbaar geïsoleerd door de nodige technische voorzorgsmaatregelen te nemen bij kritieke stappen van de procedure, en door de operationele moeilijkheid te verminderen en de variabiliteit van perfusieparameters te verminderen door de toepassing van een speciale intraveneuze katheter, gestandaardiseerde steriele wegwerpslang, temperatuurregeling en real-time monitoring- en alarmsysteem. De geïsoleerde primaire rattenhepatocyten vertonen consequent een hoge cel levensvatbaarheid (85%-95%), opbrengst (2-5 x 108 cellen per 200-300 g rat) en functionaliteit (albumine, ureum en CYP-activiteit). De procedure werd aangevuld met een geïntegreerd perfusiesysteem, dat compact genoeg is om in de laminaire stromingskap te worden geïnstalleerd om een aseptische werking te garanderen.

Een chirurg kan zien of de leverperfusie soepel verloopt door de uitkomst na bepaalde stappen te observeren. De eerste uitkomst kan worden waargenomen bij cannulatie, het snijden van de infrahepatische IVC en het herstellen van de perfusiestroomsnelheid. De lever moet volledig van kleur zijn veranderd van donkerrood naar bruin, met behoud van het volume. Als de lever er enigszins leeggelopen uitziet en een roodachtige tint of vlekken rood heeft, betekent dit dat de perfusiestroomsnelheid verkeerd is ingesteld (te laag) o...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control at JoVE.com

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Dit protocol beschrijft het gebruik van een speciale intraveneuze katheter, gestandaardiseerde steriele wegwerpslangen, temperatuurregeling aangevuld met real-time monitoring en een alarmsysteem voor tweestaps collagenaseperfusieprocedure om de consistentie in de levensvatbaarheid, opbrengst en functionaliteit van geïsoleerde primaire rathepatocyten te verbeteren.

Isolatie van primaire rattenhepatocyten met multiparameterperfusiecontrole

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...

Dit isolatieprotocol voor rattenhepatocyten is gebaseerd op de leverresectie voorafgaand aan de verteringsbenadering. Het protocol introduceert een compact en draagbaar geïntegreerd perfusiesysteem voor celisolatie. Deze techniek omvat collagenase-recirculatie die het volume van collagenasegebruik vermindert en meer flexibiliteit biedt bij het verlengen van de verteringstijd, terwijl een hoge zwaartekrachtopbrengst en hepatocytenspecifieke functie worden gegarandeerd.Zet de rat in de motorkap. Na het doorsnijden van de buikspieren, duwt u de darmen naar rechts met de achterkant van de gebogen tang. Breek het membraan onder het galkanaal met de punt van de gebogen tang voor het lusen van de hechtdraad rond de poortader en het galkanaal.Gebruik een zijden chirurgische hechting om een zeer losse ligatuur te maken rond de poortader dicht bij de lever, net voordat de ader zich links en rechts in verschillende leverkwabben vertakt. Ongeveer twee tot drie centimeter stroomopwaarts van de eerste ligatuur, net voordat de maagader zich van de poortader vertakt, creëert u een gat door het weefsel onder de poortader met de uiteinden van twee paar gebogen tangen. Rek vervolgens het gat uit om de poortader te ondersteunen tijdens de cannulatie.Voorkom drukopbouw in de lever door de pompsnelheid te verlagen tot vier rpm voor een debiet van ongeveer drie milliliter per minuut. En zorg ervoor dat de uitstroom van de calciumvrije buffer uit de intraveneuze katheter wordt gereduceerd tot een langzaam infuus. Terwijl u de poortader voorzichtig ondersteunt met een tang, houdt u de intraveneuze katheter vast met de schuine kant van de naald naar boven gericht.En steek de naald in de poortader in een hoek van 10 tot 20 graden. Ga dan langzaam verder totdat de hele schuine kant zich in de ader bevindt. Correct inbrengen moet resulteren in blancheren van de leverkleur.Beweeg de canule over de naald en trek de naald achter de canule terug door de vleugel met de wijsvinger terug te trekken terwijl je de katheter met de duim en middelvinger vasthoudt. Bevestig de poortader op de katheter met een aderclip en clip onder de poortader om verstoring van de doordruppeling van de doordrenking te voorkomen. Snijd vervolgens de infrahepatische inferieure vena cava om de drukopbouw in de lever te voorkomen en let op bloedspurtende impulsen om de juiste snede te garanderen.Verhoog de pompsnelheid tot 38 RPM voor een debiet van ongeveer 33 milliliter per minuut. En spoel de lever drie keer door de infrahepatische inferieure vena cava twee tot drie seconden met een tang te sluiten en vervolgens opnieuw te openen. Om alle leverlobben te perfuseren, past u de positie van de canuletip aan en zorgt u ervoor dat deze wordt geplaatst voordat de poortader zich in verschillende leverlobben vertakt.Span vervolgens de losse ligatuur rond de poortader aan, iets stroomopwaarts van het vertakkingspunt, en zet de positie van de canule in de poortader vast om terugstroming van de buffer te voorkomen door drie knopen te maken op het punt waar de harde naald de canule ondersteunt, tussen de schuine kant en het zijgat. Laat de lever na leverresectie gedurende 12 minuten doordringen met de calciumvrije buffer. Draai vervolgens de rolklem van de calciumvrije buffer aan en maak de rolklem van collagenasebuffer los om de perfusiebuffer te veranderen.Nadat de collagenasebuffer de lever heeft bereikt, spoelt u de lever drie keer door de suprahepatische inferieure vena cava gedurende twee tot drie seconden te sluiten en opnieuw te openen. Verplaats de lever voorzichtig naar het stadium bovenop het bekerglas voor recirculatie van de collagenasebuffer door het diafragma met een tang vast te houden terwijl u de katheter ondersteunt, en zorg ervoor dat u niet aan de katheter trekt om onbedoelde loslating te voorkomen. Verteer de lever gedurende 12 minuten en stop de perfusie wanneer de lever zijn gladde bruine textuur verliest en papperig wordt.Verleng indien nodig de verteringstijd. Na de vertering van de lever snijdt u de poortader voorzichtig de canule. En breng vervolgens de lever over in koude DMEM om de hepatocyten te isoleren.Tik zachtjes op de lever met behulp van de achterkant van de gebogen tang om de glinsterende capsule te breken en af te pellen. En laat de levercellen vrij door de lever zachtjes in DMEM te zwaaien totdat de cellen volledig zijn gedissocieerd in de media. De levensvatbaarheid van hepatocyten lag tussen 88 en 94,8% zoals bepaald door trip en blauwe telling.De opbrengst van hepatocyten van ratten met een gewicht van 200 tot 300 gram was tot vijf keer 10 tot de achtste cellen per isolatie. De representatieve beelden tonen ongezuiverde levercelsuspensie en gezuiverde hepatocytensuspensie. De zuiverheid van de geïsoleerde hepatocyten was ongeveer 96,8%, wat werd gekwantificeerd door albuminepositieve fluorescerende gekleurde cellen te tellen in relatie tot het totale aantal celkernen.In de representatieve afbeeldingen die in valse kleuren worden weergegeven, vertegenwoordigt groen het albumine en blauw de celkernen met albumine. Celkernen zonder albumine zijn rood gemarkeerd. De hepatocyten in sandwichcultuur vormden verschillende galkanaaliculi en hadden goed celcelcontact.Zoals aangetoond door albumine-, ureum- en cytochroom P450-testen, vertoonden de hepatocyten een hoge ureum- en albuminesecretie. Op dag drie vertoonden de hepatocyten hoge enzymactiviteiten voor CYP1A2, CYP2B1/2 en CYP3B2. Wees mentaal voorbereid voordat u de naald in de poortader steekt.Bij het inbrengen moet een chirurg doorgaan zonder polsslag totdat de pompsnelheid is verhoogd na het snijden van de IVC.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Primaire Cultuur van volwassen ratten Heart myocyten

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Isolatie van Rat Portal Fibroblasten door<em&gt; In situ</em&gt; Leverperfusie

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolatie en Primaire Cultuur van Rat levercellen

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Isolatie van immuuncellen van primaire tumoren

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells

Kweken Primaire Rat Inner Medullary Verzamelen Duct Cells

Arginine-vasopressin (AVP) facilitates water reabsorption by renal collecting duct principal cells and thereby fine-tunes body water homeostasis. AVP ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolatie en Cultuur van de Muis Primaire Pancreatic Acinaire Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

Isolatie van humane hepatocyten door een twee-stap Collagenase Perfusie Procedure

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolatie en Primaire Cultuur van de muis endotheelcellen

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Bepaling van vetzuuroxidatie en Lipogenese in Mouse primaire hepatocyten

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Protocol voor isolatie van primaire menselijke hepatocyten en Overeenkomstige Major Populaties van niet-parenchymale Liver Cells

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...