Name: isolation of primary rat hepatocytes with multiparameter perfusion control
Uploaded: 2021-04-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control at JoVE.com

Ce travail est soutenu en partie par le MINISTÈRE de l’Éducation et de l’Environnement (MOE2017-T2-1-149); Subvention d’amorçage à l’innovation NUHS 2017 (NUHSRO/2017/051/InnovSeed/02); Institut de mécanobiologie de Singapour (R-714-106-004-135); et le financement de Hanry Yu par l’Institut de bioingénierie et de nanotechnologie, Conseil de recherches biomédicales, Agence pour la science, la technologie et la recherche (A*STAR) (numéros de projet IAF-PP H18/01/a0/014, IAF-PP H18/01/A0/K14 et MedCaP-LOA-18-02). Ng Chan Way est chercheur à l’Université nationale de Singapour. Nous tenons à remercier l’unité de microscopie confocale et l’unité de cytométrie en flux de l’Université nationale de Singapour pour leur aide et leurs conseils dans l’analyse de la pureté des hépatocytes.

Toutes les procédures et le logement des animaux ont été effectués sous les numéros de protocole R15-0027 et R19-0669 conformément aux exigences du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université nationale de Singapour.
1. Préparation de solutions et d’instruments chirurgicaux
<ol><li>Préparer les tampons et les milieux de culture cellulaire dans le tableau 1 en utilisant de l’eau ultrapure.</li>
	<li>Préchauffer le tamp...

<ol>
	<li>Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. H., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+rat+hepatic+cells.">Isolation and primary culture of rat hepatic cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).</li><li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion.">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).</li><li>Green, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+primary+hepatocytes+from+human+tissue:+optimising+the+use+of+small+non-encapsulated+liver+resection+surplus.">The isolation of primary hepatocytes from human tissue: optimising the use of small non-encapsulated liver resection surplus.</a> Cell and Tissue Banking. 18 (4), 597-604 (2017).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).</li><li>Gopalakrishnan, S., Harris, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+liver+endocytosis+followed+by+purification+of+liver+cells+by+liver+perfusion.">In vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3138 (2011).</li><li>Wen, J. W., Olsen, A. L., Perepelyuk, M., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+rat+portal+fibroblasts+by+in+situ+liver+perfusion.">Isolation of rat portal fibroblasts by in situ liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3669 (2012).</li><li>Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+3D+collagen+sandwich+culture+of+primary+mouse+hepatocytes+to+study+the+role+of+cytoskeleton+in+bile+canalicular+formation+in+vitro.">Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60501 (2019).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+purification+of+immune+cells+from+the+liver.">Isolation and purification of immune cells from the liver.</a> International Immunopharmacology. 85 (95), 106632 (2020).</li><li>Salem, E. S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+mouse+hepatocytes+for+nascent+protein+synthesis+analysis+by+non-radioactive+L-azidohomoalanine+labeling+method.">Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive L-azidohomoalanine labeling method.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323 (2018).</li><li>Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethered+spheroids+as+an+in+vitro+hepatocyte+model+for+drug+safety+screening.">Tethered spheroids as an in vitro hepatocyte model for drug safety screening.</a> Biomaterials. 33 (7), 2165-2176 (2012).</li><li>Kegel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+isolation+of+primary+human+hepatocytes+and+corresponding+major+populations+of+non-parenchymal+liver+cells.">Protocol for isolation of primary human hepatocytes and corresponding major populations of non-parenchymal liver cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53069 (2016).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vertical-flow+bioreactor+array+compacts+hepatocytes+for+enhanced+polarity+and+functions.">A vertical-flow bioreactor array compacts hepatocytes for enhanced polarity and functions.</a> Lab on a Chip. 16 (20), 3898-3908 (2016).</li><li>Du, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+sandwich+culture+of+3D+hepatocyte+monolayer.">Synthetic sandwich culture of 3D hepatocyte monolayer.</a> Biomaterials. 29 (3), 290-301 (2008).</li><li>Tong, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constrained+spheroids+for+prolonged+hepatocyte+culture.">Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture.</a> Biomaterials. 80, 106-120 (2016).</li><li>Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar-flow+immediate-overlay+hepatocyte+sandwich+perfusion+system+for+drug+hepatotoxicity+testing.">Laminar-flow immediate-overlay hepatocyte sandwich perfusion system for drug hepatotoxicity testing.</a> Biomaterials. 30 (30), 5927-5936 (2009).</li><li>Gupta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+canaliculi+contract+autonomously+by+releasing+calcium+into+hepatocytes+via+mechanosensitive+calcium+channel.">Bile canaliculi contract autonomously by releasing calcium into hepatocytes via mechanosensitive calcium channel.</a> Biomaterials. 259, 120283 (2020).</li><li>Horner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Percoll+purification+on+isolation+of+primary+human+hepatocytes.">Impact of Percoll purification on isolation of primary human hepatocytes.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6542 (2019).</li><li>Osypiw, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpopulations+of+rat+hepatocytes+separated+by+Percoll+density-gradient+centrifugation+show+characteristics+consistent+with+different+acinar+locations.">Subpopulations of rat hepatocytes separated by Percoll density-gradient centrifugation show characteristics consistent with different acinar locations.</a> The Biochemical Journal. 304, 617-624 (1994).</li><li>Beal, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+animal+model+of+ex+vivo+normothermic+liver+perfusion.">A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541 (2018).</li><li>Hillebrandt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedure+for+decellularization+of+rat+livers+in+an+oscillating-pressure+perfusion+device.">Procedure for decellularization of rat livers in an oscillating-pressure perfusion device.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), e53029 (2015).</li></ol>

Il y a quelques points qui sont particulièrement importants à observer pour la procédure de perfusion de collagénase en deux étapes en général. Tout d’abord, des précautions particulières doivent être apportées lors de la résection du foie. Assurez-vous que le tractus gastro-intestinal n’est pas endommagé car une fuite du contenu entraînera une contamination bactérienne. De plus, évitez d’endommager la capsule de Glisson, qui recouvre la surface du foie pendant la procédure animale. Si la déchirur...

Les hépatocytes primaires sont des outils importants pour la recherche fondamentale liée au foie, le traitement des maladies et l’application telles que les tests de dépistage de médicaments. L’étalon-or actuel pour l’isolement primaire des hépatocytes est la procédure de perfusion de collagénase en deux étapes 1,2,3 introduite par Seglen dans les années 1970 4. Cependant, cette procédure est techniquement difficile et a un taux d’échec élevé lorsqu’elle est effectuée par des chirurgiens novices. Même lorsqu’une perfusion est considérée comme réussie, des différences drastiques dans la viabilité des hépatocytes (généralement 60% à 95%) et le rendement (0,5 à 5 x 108 pour un rat de 200 à 300 g) peuvent être observées entre les isolements. Cela influence la qualité et l’échelle des expériences en aval. Outre la procédure technique, la configuration de perfusion utilisée pour l’isolement, disponible dans le commerce ou sur mesure, est un facteur contributif. Une attention particulière doit être accordée à l’assemblage, à l’optimisation et à la maintenance de la configuration de perfusion. Le but de ce protocole est d’améliorer le taux de réussite et la stabilité entre les isolements d’hépatocytes primaires de rat grâce au contrôle de perfusion multiparamétrique de la procédure technique et à la configuration de perfusion de la procédure de perfusion de collagénase en deux étapes.
Du point de vue technique, l’étape la plus difficile de la procédure est la canulation de la veine porte. En ce qui concerne les autres étapes, si les bonnes pratiques sont observées et que des précautions générales sont prises, la stabilité de l’isolement peut être améliorée. Par conséquent, la compréhension du raisonnement pour chaque étape est importante afin que le chirurgien puisse répondre à diverses variables qui peuvent survenir pendant la procédure.
Divers protocoles pour l’isolement des hépatocytes et des cellules non parenchymateuses du foie du rat et de la souris ont été publiés 1,2,5,6,7,8,9. Les configurations de perfusion utilisées dans ces protocoles présentaient plusieurs inconvénients, notamment la réutilisation des tubes de perfusion, des problèmes de contrôle de la température, la nécessité d’une optimisation de routine des paramètres de perfusion et / ou l’utilisation d’un type inapproprié de cathéter intraveineux (IV) pour la canulation veineuse portale. La réutilisation des tubes de perfusion augmentera les risques de contamination, surtout si les tubes n’ont pas été nettoyés et désinfectés correctement. La réutilisation des tubes sans remplacement de routine exposera également la configuration de perfusion à des problèmes tels que des tubes ou des connecteurs qui fuient, un piège à bulles bouché et un tube rétréci, ce qui réduira considérablement la pression et le débit du perfusat, affectant ainsi l’efficacité de la digestion du foie. Sans source de chaleur constante dans certaines configurations pour le contrôle de la température, les tampons préchauffés se refroidiront au fil du temps, ce qui entraînera une faible activité et digestion de la collagénase. Bien que d’autres configurations utilisent un condenseur en verre gainé connecté à un circulateur d’eau pour réchauffer le tampon, elles sont encombrantes et nécessitent un nettoyage minutieux. La température, la pression et le débit du tampon sortant du cathéter doivent être mesurés et optimisés avant le début de l’isolement pour assurer une condition de perfusion stable. Même après optimisation, les paramètres pourraient encore changer à mi-chemin pendant l’isolement en raison des actions de l’opérateur, conduisant ainsi à une perfusion et à une digestion sous-optimales. La plupart des types de cathéter IV ne conviennent pas à la canulation veineuse porte car ils ne permettent pas une perfusion continue pendant la canulation. Ils sont incapables d’informer immédiatement le chirurgien lorsque la canulation est réussie. De plus, il est difficile de fixer la veine porte sur le cathéter souple sans le déformer.
Ici, nous abordons ces problèmes en utilisant des tubes stériles jetables standardisés, une gaine chauffante en silicone pour un contrôle précis et stable de la température, un système de surveillance et d’alarme en temps réel avec stockage et gestion des données et l’utilisation d’un cathéter IV spécial, qui permet une perfusion continue tout en perforant la veine porte pendant la canulation. À notre connaissance, nous sommes le premier groupe à combiner toutes ces caractéristiques dans un système de perfusion intégré (IPS) compact, ce qui le rend très portable et capable d’être intégré dans une hotte à flux laminaire pour assurer un fonctionnement aseptique.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Nipro</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>Nipro</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black braided silk non-absorbable, non-sterile surgical suture</td>
			<td>Look</td>
			<td>SP117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bochem 18/10 stainless steel forceps, sharp tip contain bent round tip</td>
			<td>Bochem</td>
			<td>10333511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Perfusion Set</td>
			<td>Vasinfuse</td>
			<td>BPF-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floating circular 1.5 mL microcentrifuge tube rack</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>German Standard Tissue Forceps, Serrated / 1&#215;2 teeth , 14.5cm</td>
			<td>Walentech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Cellstar aspirating pipette</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GN710183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrated Perfusion System</td>
			<td>Vasinfuse</td>
			<td>IPS-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors curved, stainless, 11cm</td>
			<td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td>
			<td>CVD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope with 10X lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh Sheet 100&#181;M Nylon</td>
			<td>Spectra-Teknic(s) Pte Ltd</td>
			<td>06630-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors, BL/BL, 13cm</td>
			<td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td>
			<td>STR &#8211; BL/BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors, SH/BL, 13cm</td>
			<td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td>
			<td>STR &#8211; SH/BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse force hemostatic clip</td>
			<td>Shanghai Jin Zhong Pte Ltd</td>
			<td>XEC230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents/Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>137101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17104019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>TCI</td>
			<td>D1961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31600-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11344-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1-9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC26764.298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type I bovine collagen</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>William&#8217;s E Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W1878</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary rat hepatocytes with multiparameter perfusion control

Les hépatocytes primaires sont largement utilisés dans la recherche fondamentale sur les maladies du foie et pour les tests de toxicité in vitro. La procédure de perfusion de collagénase en deux étapes pour l’isolement primaire des hépatocytes est techniquement difficile, en particulier dans la canulation veineuse porte. La procédure est également sujette à une contamination occasionnelle et à des variations des conditions de perfusion en raison de difficultés d’assemblage, d’optimisation ou de maintenance de la configuration de perfusion. Ici, un protocole détaillé pour une procédure améliorée de perfusion de collagénase en deux étapes avec contrôle de perfusion multiparamétrique est présenté. Les hépatocytes primaires de rat ont été isolés avec succès et de manière fiable en prenant les précautions techniques nécessaires aux étapes critiques de la procédure, en réduisant la difficulté opérationnelle et en atténuant la variabilité des paramètres de perfusion grâce à l’adoption d’un cathéter intraveineux spécial, d’un tube jetable stérile normalisé, d’un contrôle de la température et d’un système de surveillance et d’alarme en temps réel. Les hépatocytes primaires isolés chez le rat présentent systématiquement une viabilité cellulaire élevée (85%-95%), un rendement (2-5 x 108 cellules pour 200-300 g de rat) et une fonctionnalité (activité albumine, urée et CYP). La procédure a été complétée par un système de perfusion intégré, suffisamment compact pour être installé dans la hotte à flux laminaire afin d’assurer un fonctionnement aseptique.

Un chirurgien pourrait dire si la perfusion hépatique se déroule sans heurts en observant le résultat après certaines étapes. Le premier résultat peut être observé lors de la canulation, de la coupe de la CIV infrahépatique et du rétablissement du débit de perfusion. Le foie devrait avoir complètement changé de couleur du rouge foncé au brun, tout en maintenant son volume. Si le foie semble légèrement dégonflé et a une teinte rougeâtre ou des taches de rouge, cela signifie que le débit de perfusion a ...

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Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Ce protocole détaille l’utilisation d’un cathéter intraveineux spécial, d’un tube jetable stérile standardisé, d’un contrôle de la température complété par une surveillance en temps réel et d’un système d’alarme pour la procédure de perfusion de collagénase en deux étapes afin d’améliorer la cohérence de la viabilité, du rendement et de la fonctionnalité des hépatocytes primaires isolés chez le rat.

Isolement des hépatocytes primaires de rat avec contrôle de perfusion multiparamétrique

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...

Ce protocole d’isolement des hépatocytes de rat est basé sur la résection hépatique avant l’approche de digestion. Le protocole introduit un système de perfusion intégré compact et portable pour l’isolation cellulaire. Cette technique implique la recirculation de la collagénase qui réduit le volume d’utilisation de la collagénase et offre plus de flexibilité dans l’extension du temps de digestion tout en assurant un rendement gravitationnel élevé et une fonction spécifique aux hépatocytes.Mettez le rat dans le capot. Après avoir coupé les muscles abdominaux, poussez les intestins vers la droite avec l’arrière de la pince incurvée. Cassez la membrane sous le canal biliaire avec la pointe de la pince incurvée pour boucler la suture autour de la veine porte et du canal biliaire.Utilisez une suture chirurgicale en soie pour faire une ligature très lâche autour de la veine porte près du foie, juste avant que la veine ne se ramifie à gauche et à droite dans différents lobes du foie. Environ deux à trois centimètres en amont de la première ligature, juste avant que la veine gastrique ne se ramifie de la veine porte, créez un trou à travers le tissu sous la veine porte avec les extrémités de deux paires de pinces incurvées. Ensuite, étirez le trou pour soutenir la veine porte pendant la canulation.Prévenir l’accumulation de pression dans le foie en réduisant la vitesse de la pompe à quatre tr / min pour un débit d’environ trois millilitres par minute. Et assurez-vous que l’écoulement du tampon sans calcium du cathéter intraveineux est réduit à un écoulement lent. Tout en soutenant doucement la veine porte avec une pince, tenez le cathéter intraveineux avec le biseau de l’aiguille vers le haut.Et insérez l’aiguille dans la veine porte à un angle de 10 à 20 degrés. Avancez ensuite lentement jusqu’à ce que tout le biseau soit à l’intérieur de la veine. Une insertion correcte devrait entraîner un blanchiment de la couleur du foie.Avancez la canule sur l’aiguille et rétractez l’aiguille derrière la canule en tirant l’aile vers l’arrière avec l’index tout en tenant le cathéter avec le pouce et le majeur. Fixez la veine porte sur le cathéter à l’aide d’un clip veineux et d’un clip sous la veine porte pour éviter toute perturbation du flux. Ensuite, coupez la veine cave inférieure infrahépatique pour empêcher l’accumulation de pression dans le foie et observez les impulsions de jaillissement de sang pour assurer la coupe correcte.Augmentez la vitesse de la pompe à 38 tr/min pour un débit d’environ 33 millilitres par minute. Et rincez le foie trois fois en fermant la veine cave inférieure infrahépatique avec une pince pendant deux à trois secondes, puis en la rouvrant. Afin de perfuser tous les lobes du foie, ajustez la position de la pointe de la canule et assurez-vous qu’elle est placée avant que la veine porte ne se ramifie en différents lobes du foie.Ensuite, resserrez la ligature lâche autour de la veine porte, légèrement en amont du point de ramification, et fixez la position de la canule dans la veine porte pour éviter le reflux du tampon en faisant trois nœuds au point où l’aiguille dure soutient la canule, entre le biseau et le trou latéral. Après la résection du foie, laissez le foie perfuser avec le tampon sans calcium pendant 12 minutes. Ensuite, serrez la pince à rouleaux du tampon sans calcium et desserrez la pince à rouleaux du tampon à collagénase pour changer le tampon de perfusion.Une fois que le tampon de collagénase a atteint le foie, rincez le foie trois fois en fermant la veine cave inférieure suprahépatique pendant deux à trois secondes et en la rouvrant. Déplacez soigneusement le foie vers la scène située sur le dessus du bécher pour la recirculation du tampon de collagénase en tenant le diaphragme avec une pince tout en soutenant le cathéter, en prenant soin de ne pas tirer le cathéter pour éviter tout détachement accidentel. Digérez le foie pendant 12 minutes et arrêtez la perfusion lorsque le foie perd sa texture brune lisse et devient pâteux.Prolongez le temps de digestion si nécessaire. Après la digestion du foie, coupez la veine porte, retirez soigneusement la canule. Et puis transférer le foie dans le DMEM froid pour isoler les hépatocytes.Tapotez doucement le foie à l’aide de l’arrière de la pince incurvée pour casser et décoller la capsule scintillante. Et libérez les cellules du foie en balançant doucement le foie dans le DMEM jusqu’à ce que les cellules soient complètement dissociées dans le milieu. La viabilité des hépatocytes se situait entre 88 et 94,8 %, déterminée par le comptage des tripes et des bleus.Le rendement en hépatocytes de rats pesant de 200 à 300 grammes était jusqu’à cinq fois 10 à la huitième cellule par isolement. Les images représentatives montrent une suspension de cellules hépatiques non purifiée et une suspension d’hépatocytes purifiée. La pureté des hépatocytes isolés était d’environ 96,8%, ce qui a été quantifié en comptant les cellules colorées fluorescentes positives à l’albumine par rapport au nombre total de noyaux cellulaires.Dans les images représentatives montrées en fausse couleur, le vert représente l’albumine et le bleu indique les noyaux cellulaires avec l’albumine. Les noyaux cellulaires sans albumine sont surlignés en rouge. Les hépatocytes en culture sandwich formaient des canalicules biliaires distincts et avaient un bon contact cellulaire.Comme le montrent les essais d’albumine, d’urée et de cytochrome P450, les hépatocytes présentaient une sécrétion élevée d’urée et d’albumine. Le troisième jour, les hépatocytes présentaient des activités enzymatiques élevées pour le CYP1A2, le CYP2B1/2 et le CYP3B2. Soyez mentalement préparé avant d’insérer l’aiguille dans la veine porte.Lors de l’insertion, un chirurgien devra continuer sans impulsion jusqu’à ce que la vitesse de la pompe soit augmentée après avoir coupé la CIV.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Culture primaire des adultes myocytes cœur de rat

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Recherche

Biologie

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Isolement des fibroblastes de rat par portail<em&gt; In situ</emPerfusion du foie&gt;

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

L&#39;isolement et la culture primaire de cellules de foie de rat

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Isolement des cellules immunitaires des tumeurs primitives

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells

Culture primaire Rat collecteur médullaire interne les cellules des canaux

Arginine-vasopressin (AVP) facilitates water reabsorption by renal collecting duct principal cells and thereby fine-tunes body water homeostasis. AVP ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolement et culture de cellules primaires de souris acineuses du pancréas

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

Isolement des hépatocytes humains par un deux-étape collagénase procédure de perfusion

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

L&#39;isolement et la culture primaire de cellules endothéliales aortiques de souris

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Détermination de oxydation des acides gras et de la lipogenèse dans les hépatocytes primaires de souris

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Protocole pour l&#39;isolement des hépatocytes humains primaires et correspondant Principales populations de cellules hépatiques non parenchymateuses

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...