Name: isolation of primary rat hepatocytes with multiparameter perfusion control
Uploaded: 2021-04-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control at JoVE.com

Diese Arbeit wird zum Teil von MOE ARC (MOE2017-T2-1-149) unterstützt; NUHS Innovation Seed Grant 2017 (NUHSRO/2017/051/InnovSeed/02); Mechanobiology Institute of Singapore (R-714-106-004-135); und Institute of Bioengineering and Nanotechnology, Biomedical Research Council, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR) (Projektnummern IAF-PP H18/01/a0/014, IAF-PP H18/01/a0/K14 und MedCaP-LOA-18-02) an Hanry Yu. Ng Chan Way ist wissenschaftlicher Mitarbeiter der National University of Singapore. Wir danken der Confocal Microscopy Unit & Flow Cytometry Unit der National University of Singapore für die Hilfe und Beratung bei der Hepatozytenreinheitsanalyse.

Alle Verfahren und Tierhaltungen wurden unter den Protokollnummern R15-0027 und R19-0669 in Übereinstimmung mit den Anforderungen des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der National University of Singapore durchgeführt.
1. Vorbereitung von Lösungen und chirurgischen Instrumenten
<ol><li>Puffer und Zellkulturmedien in Tabelle 1 werden mit Reinstwasser hergestellt.</li>
	<li>Den kalziumfreien Puffer und Kollagenasepuffer vor Gebrauch in einem Wasserbad auf ...

<ol>
	<li>Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. H., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+rat+hepatic+cells.">Isolation and primary culture of rat hepatic cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).</li><li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion.">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).</li><li>Green, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+primary+hepatocytes+from+human+tissue:+optimising+the+use+of+small+non-encapsulated+liver+resection+surplus.">The isolation of primary hepatocytes from human tissue: optimising the use of small non-encapsulated liver resection surplus.</a> Cell and Tissue Banking. 18 (4), 597-604 (2017).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).</li><li>Gopalakrishnan, S., Harris, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+liver+endocytosis+followed+by+purification+of+liver+cells+by+liver+perfusion.">In vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3138 (2011).</li><li>Wen, J. W., Olsen, A. L., Perepelyuk, M., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+rat+portal+fibroblasts+by+in+situ+liver+perfusion.">Isolation of rat portal fibroblasts by in situ liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3669 (2012).</li><li>Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+3D+collagen+sandwich+culture+of+primary+mouse+hepatocytes+to+study+the+role+of+cytoskeleton+in+bile+canalicular+formation+in+vitro.">Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60501 (2019).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+purification+of+immune+cells+from+the+liver.">Isolation and purification of immune cells from the liver.</a> International Immunopharmacology. 85 (95), 106632 (2020).</li><li>Salem, E. S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+mouse+hepatocytes+for+nascent+protein+synthesis+analysis+by+non-radioactive+L-azidohomoalanine+labeling+method.">Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive L-azidohomoalanine labeling method.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323 (2018).</li><li>Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethered+spheroids+as+an+in+vitro+hepatocyte+model+for+drug+safety+screening.">Tethered spheroids as an in vitro hepatocyte model for drug safety screening.</a> Biomaterials. 33 (7), 2165-2176 (2012).</li><li>Kegel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+isolation+of+primary+human+hepatocytes+and+corresponding+major+populations+of+non-parenchymal+liver+cells.">Protocol for isolation of primary human hepatocytes and corresponding major populations of non-parenchymal liver cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53069 (2016).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vertical-flow+bioreactor+array+compacts+hepatocytes+for+enhanced+polarity+and+functions.">A vertical-flow bioreactor array compacts hepatocytes for enhanced polarity and functions.</a> Lab on a Chip. 16 (20), 3898-3908 (2016).</li><li>Du, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+sandwich+culture+of+3D+hepatocyte+monolayer.">Synthetic sandwich culture of 3D hepatocyte monolayer.</a> Biomaterials. 29 (3), 290-301 (2008).</li><li>Tong, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constrained+spheroids+for+prolonged+hepatocyte+culture.">Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture.</a> Biomaterials. 80, 106-120 (2016).</li><li>Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar-flow+immediate-overlay+hepatocyte+sandwich+perfusion+system+for+drug+hepatotoxicity+testing.">Laminar-flow immediate-overlay hepatocyte sandwich perfusion system for drug hepatotoxicity testing.</a> Biomaterials. 30 (30), 5927-5936 (2009).</li><li>Gupta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+canaliculi+contract+autonomously+by+releasing+calcium+into+hepatocytes+via+mechanosensitive+calcium+channel.">Bile canaliculi contract autonomously by releasing calcium into hepatocytes via mechanosensitive calcium channel.</a> Biomaterials. 259, 120283 (2020).</li><li>Horner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Percoll+purification+on+isolation+of+primary+human+hepatocytes.">Impact of Percoll purification on isolation of primary human hepatocytes.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6542 (2019).</li><li>Osypiw, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpopulations+of+rat+hepatocytes+separated+by+Percoll+density-gradient+centrifugation+show+characteristics+consistent+with+different+acinar+locations.">Subpopulations of rat hepatocytes separated by Percoll density-gradient centrifugation show characteristics consistent with different acinar locations.</a> The Biochemical Journal. 304, 617-624 (1994).</li><li>Beal, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+animal+model+of+ex+vivo+normothermic+liver+perfusion.">A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541 (2018).</li><li>Hillebrandt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedure+for+decellularization+of+rat+livers+in+an+oscillating-pressure+perfusion+device.">Procedure for decellularization of rat livers in an oscillating-pressure perfusion device.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), e53029 (2015).</li></ol>

Es gibt einige Punkte, die für das zweistufige Kollagenase-Perfusionsverfahren im Allgemeinen besonders wichtig sind. Erstens muss bei der Resezierung der Leber besondere Vorsicht geboten werden. Stellen Sie sicher, dass der Magen-Darm-Trakt nicht beschädigt wird, da das Austreten des Inhalts zu einer bakteriellen Kontamination führt. Vermeiden Sie außerdem eine Beschädigung der Glisson-Kapsel, die während des Tiereingriffs die Oberfläche der Leber bedeckt. Wenn der Riss groß genug ist, kann dies eine vorzeitige ...

Primäre Hepatozyten sind wichtige Werkzeuge für die leberbezogene Grundlagenforschung, Krankheitsbehandlung und -anwendung wie Drogentests. Der aktuelle Goldstandard für die primäre Hepatozytenisolierung ist das zweistufige Kollagenase-Perfusionsverfahren1,2,3, das von Seglen in den 1970er Jahreneingeführt wurde 4. Dieses Verfahren ist jedoch technisch anspruchsvoll und hat eine hohe Ausfallrate, wenn es von unerfahrenen Chirurgen durchgeführt wird. Selbst wenn eine Perfusion als erfolgreich angesehen wird, können drastische Unterschiede in der Lebensfähigkeit der Hepatozyten (typischerweise 60%-95%) und Ausbeute (0,5-5 x 108 pro 200-300 g Ratte) zwischen den Isolationen beobachtet werden. Dies beeinflusst die Qualität und den Umfang nachgelagerter Experimente. Abgesehen von der technischen Vorgehensweise ist der für die Isolierung verwendete Perfusionsaufbau, entweder kommerziell erhältlich oder kundenspezifisch, ein beitragender Faktor. Der Montage, Optimierung und Wartung des Perfusionsaufbaus muss Aufmerksamkeit geschenkt werden. Der Zweck dieses Protokolls ist es, die Erfolgsrate und Stabilität zwischen den Isolierungen primärer Rattenhepatozyten durch Multiparameter-Perfusionskontrolle des technischen Verfahrens und Perfusionsaufbau des zweistufigen Kollagenase-Perfusionsverfahrens zu verbessern.
Aus technischer Sicht ist der schwierigste Schritt im Verfahren die Pfortadervernarbung. Was die anderen Schritte betrifft, so kann die Stabilität der Isolierung verbessert werden, wenn bewährte Verfahren beachtet und allgemeine Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden. Daher ist es wichtig, die Argumentation für jeden Schritt zu verstehen, damit der Chirurg auf verschiedene Variablen reagieren kann, die während des Eingriffs auftreten können.
Verschiedene Protokolle zur Isolierung von Hepatozyten und nicht-parenchymalen Leberzellen aus Ratte und Maus wurden veröffentlicht 1,2,5,6,7,8,9. Die in diesen Protokollen verwendeten Perfusionsaufbauten hatten mehrere Nachteile, darunter die Wiederverwendung von Perfusionsschläuchen, Probleme bei der Temperaturregelung, die Notwendigkeit einer routinemäßigen Optimierung der Perfusionsparameter und / oder die Verwendung eines ungeeigneten Typs von intravenösem (IV) Katheter für die Pfortaderkanülierung. Die Wiederverwendung von Perfusionsschläuchen erhöht die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination, insbesondere wenn der Schlauch nicht ordnungsgemäß gereinigt und desinfiziert wurde. Die Wiederverwendung von Schläuchen ohne routinemäßigen Austausch setzt das Perfusionssetup auch Problemen wie undichten Schläuchen oder Anschlüssen, verstopften Blasenfallen und verengten Schläuchen aus, die den Perfusatdruck und die Durchflussrate erheblich reduzieren und somit die Effizienz der Leberverdauung beeinträchtigen. Ohne eine konstante Wärmequelle in einigen Setups zur Temperaturregelung kühlen vorgewärmte Puffer im Laufe der Zeit ab, was zu einer geringen Kollagenaseaktivität und Verdauung führt. Obwohl andere Setups einen ummantelten Glaskondensator verwenden, der an einen Wasserthermostat angeschlossen ist, um den Puffer zu erwärmen, sind sie sperrig und erfordern eine sorgfältige Reinigung. Temperatur, Druck und Durchflussrate des Puffers, der den Katheter verlässt, müssen vor Beginn der Isolierung gemessen und optimiert werden, um einen stabilen Perfusionszustand zu gewährleisten. Selbst nach der Optimierung könnten sich die Parameter während der Isolierung aufgrund der Aktionen des Bedieners noch halbwegs ändern, was zu einer suboptimalen Perfusion und Verdauung führt. Die meisten Arten von IV-Kathetern sind nicht für die Pfortaderverhornung geeignet, da sie während der Kanülierung keine kontinuierliche Perfusion ermöglichen. Sie sind nicht in der Lage, den Chirurgen sofort zu informieren, wenn die Kanülierung erfolgreich ist. Darüber hinaus ist es eine Herausforderung, die Pfortader am weichen Katheter zu befestigen, ohne ihn zu verformen.
Hier adressieren wir diese Probleme mit standardisierten sterilen Einwegschläuchen, einem Silikonheizmantel für eine präzise und stabile Temperaturregelung, Echtzeit-Überwachungs- und Alarmsystem mit Datenspeicherung und -verwaltung sowie der Verwendung eines speziellen IV-Katheters, der eine kontinuierliche Durchblutung während der Punktion der Pfortader während der Kanülierung ermöglicht. Nach unserem besten Wissen sind wir die erste Gruppe, die all diese Eigenschaften in einem integrierten Perfusionssystem (IPS) kombiniert, das kompakt ist, es sehr portabel macht und in eine laminare Durchflusshaube passt, um einen aseptischen Betrieb zu gewährleisten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Nipro</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>Nipro</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black braided silk non-absorbable, non-sterile surgical suture</td>
			<td>Look</td>
			<td>SP117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bochem 18/10 stainless steel forceps, sharp tip contain bent round tip</td>
			<td>Bochem</td>
			<td>10333511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Perfusion Set</td>
			<td>Vasinfuse</td>
			<td>BPF-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floating circular 1.5 mL microcentrifuge tube rack</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>German Standard Tissue Forceps, Serrated / 1&#215;2 teeth , 14.5cm</td>
			<td>Walentech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Cellstar aspirating pipette</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GN710183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrated Perfusion System</td>
			<td>Vasinfuse</td>
			<td>IPS-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors curved, stainless, 11cm</td>
			<td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td>
			<td>CVD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope with 10X lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh Sheet 100&#181;M Nylon</td>
			<td>Spectra-Teknic(s) Pte Ltd</td>
			<td>06630-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors, BL/BL, 13cm</td>
			<td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td>
			<td>STR &#8211; BL/BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors, SH/BL, 13cm</td>
			<td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td>
			<td>STR &#8211; SH/BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse force hemostatic clip</td>
			<td>Shanghai Jin Zhong Pte Ltd</td>
			<td>XEC230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents/Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>137101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17104019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>TCI</td>
			<td>D1961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31600-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11344-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1-9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC26764.298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type I bovine collagen</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>William&#8217;s E Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W1878</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary rat hepatocytes with multiparameter perfusion control

Primäre Hepatozyten werden häufig in der Grundlagenforschung zu Lebererkrankungen und für Toxizitätstests in vitro eingesetzt. Das zweistufige Kollagenase-Perfusionsverfahren zur primären Hepatozytenisolierung ist technisch anspruchsvoll, insbesondere bei der Pfortaderkanülierung. Das Verfahren ist auch anfällig für gelegentliche Kontaminationen und Variationen der Perfusionsbedingungen aufgrund von Schwierigkeiten bei der Montage, Optimierung oder Wartung des Perfusionsaufbaus. Hier wird ein detailliertes Protokoll für ein verbessertes zweistufiges Kollagenase-Perfusionsverfahren mit Multiparameter-Perfusionskontrolle vorgestellt. Primäre Rattenhepatozyten wurden erfolgreich und zuverlässig isoliert, indem die notwendigen technischen Vorsichtsmaßnahmen in kritischen Schritten des Verfahrens getroffen und die Betriebsschwierigkeiten verringert und die Variabilität der Perfusionsparameter durch die Einführung eines speziellen intravenösen Katheters, standardisierter steriler Einwegschläuche, Temperaturregelung sowie Echtzeit-Überwachungs- und Alarmsystem gemildert wurden. Die isolierten primären Rattenhepatozyten weisen durchweg eine hohe Zelllebensfähigkeit (85%-95%), Ausbeute (2-5 x 108 Zellen pro 200-300 g Ratte) und Funktionalität (Albumin-, Harnstoff- und CYP-Aktivität) auf. Ergänzt wurde das Verfahren durch ein integriertes Perfusionssystem, das kompakt genug ist, um in der Laminar-Flow-Haube aufgestellt zu werden, um einen aseptischen Betrieb zu gewährleisten.

Ein Chirurg könnte feststellen, ob die Leberperfusion reibungslos verläuft, indem er das Ergebnis nach bestimmten Schritten beobachtet. Das erste Ergebnis kann bei der Kanülierung, dem Schneiden der infrahepatischen IVC und der Wiederherstellung der Perfusionsflussrate beobachtet werden. Die Leber sollte ihre Farbe vollständig von dunkelrot zu braun geändert haben, während sie ihr Volumen beibehielt. Wenn die Leber leicht entleert aussieht und eine rötliche Tönung oder rote Flecken aufweist, bedeutet dies, dass d...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control at JoVE.com

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines speziellen intravenösen Katalysators, eines standardisierten sterilen Einwegschlauchs, einer Temperaturregelung, die durch Echtzeitüberwachung ergänzt wird, und eines Alarmsystems für ein zweistufiges Kollagenase-Perfusionsverfahren, um die Konsistenz der Lebensfähigkeit, Ausbeute und Funktionalität isolierter primärer Rattenhepatozyten zu verbessern.

Isolierung primärer Rattenhepatozyten mit Multiparameter-Perfusionskontrolle

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...

Dieses Ratten-Hepatozyten-Isolationsprotokoll basiert auf der Leberresektion vor dem Verdauungsansatz. Das Protokoll führt ein kompaktes und tragbares integriertes Perfusionssystem zur Zellisolierung ein. Diese Technik beinhaltet eine Kollagenase-Rezirkulation, die das Volumen der Kollagenase-Nutzung reduziert und mehr Flexibilität bei der Verlängerung der Verdauungszeit bietet, während gleichzeitig eine hohe Schwerkraftausbeute und eine hepatozytenspezifische Funktion gewährleistet werden.Legen Sie die Ratte in die Kapuze. Nachdem Sie die Bauchmuskulatur geschnitten haben, drücken Sie den Darm mit der Rückseite der gekrümmten Pinzette nach rechts. Brechen Sie die Membran unter dem Gallengang mit der Spitze der gekrümmten Pinzette auf, um die Naht um die Pfortader und den Gallengang zu schleifen.Verwenden Sie eine chirurgische Seidennaht, um eine sehr lockere Ligatur um die Pfortader in der Nähe der Leber zu machen, kurz bevor sich die Vene links und rechts in verschiedene Leberlappen verzweigt. Etwa zwei bis drei Zentimeter vor der ersten Ligatur, kurz bevor sich die Magenvene von der Pfortader abzweigt, erzeugen ein Loch durch das Gewebe unter der Pfortader mit den Spitzen von zwei Paaren gekrümmter Pinzetten. Dehnen Sie dann das Loch, um die Pfortader während der Kanülierung zu stützen.Verhindern Sie Druckaufbau in der Leber, indem Sie die Pumpendrehzahl auf vier U / min für eine Durchflussrate von etwa drei Millilitern pro Minute reduzieren. Und stellen Sie sicher, dass der Abfluss des kalziumfreien Puffers aus dem intravenösen Katheter auf einen langsamen Tropf reduziert wird. Während Sie die Pfortader vorsichtig mit einer Pinzette stützen, halten Sie den intravenösen Katheter mit der Fase der Nadel nach oben.Und führen Sie die Nadel in einem Winkel von 10 bis 20 Grad in die Pfortader ein. Fahren Sie dann langsam voran, bis sich die gesamte Fase in der Vene befindet. Das korrekte Einsetzen sollte zum Blanchieren der Leberfarbe führen.Bewegen Sie die Kanüle über die Nadel und ziehen Sie die Nadel hinter der Kanüle zurück, indem Sie den Flügel mit dem Zeigefinger zurückziehen, während Sie den Katheter mit Daumen und Mittelfinger halten. Befestigen Sie die Pfortader mit einem Venenclip am Katheter und Clip unterhalb der Pfortadere, um eine Durchdringungsunterbrechung des Flusses zu vermeiden. Als nächstes schneiden Sie die infrahepatische untere Hohlvene ab, um den Druckaufbau in der Leber zu verhindern, und achten Sie auf Blutspritzimpulse, um den richtigen Schnitt sicherzustellen.Erhöhen Sie die Pumpendrehzahl auf 38 U / min für eine Durchflussrate von ca. 33 Millilitern pro Minute. Und spülen Sie die Leber dreimal, indem Sie die infrahepatische untere Hohlvene für zwei bis drei Sekunden mit einer Pinzette schließen und sie dann wieder öffnen. Um alle Leberlappen zu durchbluten, passen Sie die Position der Kanülenspitze an und stellen Sie sicher, dass sie platziert wird, bevor sich die Pfortader in verschiedene Leberlappen verzweigt.Ziehen Sie dann die lose Ligatur um die Pfortader, leicht stromaufwärts des Verzweigungspunkts, fest und sichern Sie die Position der Kanüle in der Pfortader, um einen Rückfluss des Puffers zu verhindern, indem Sie drei Knoten an der Stelle machen, an der die harte Nadel die Kanüle stützt, zwischen der Fase und dem Seitenloch. Nach der Leberresektion lassen Sie die Leber für 12 Minuten mit dem kalziumfreien Puffer durchbluten. Ziehen Sie dann die Rollenklemme des kalziumfreien Puffers fest und lösen Sie die Rollenklemme des Kollagenasepuffers, um den Perfusionspuffer zu wechseln.Nachdem der Kollagenasepuffer die Leber erreicht hat, spülen Sie die Leber dreimal aus, indem Sie die suprahepatische untere Hohlvene für zwei bis drei Sekunden schließen und wieder öffnen. Bewegen Sie die Leber vorsichtig auf die Stufe oben auf dem Becherglas, um den Kollagenasepuffer zu rezirkulieren, indem Sie das Zwerchfell mit einer Pinzette halten, während Sie den Katheter stützen, und achten Sie darauf, den Katheter nicht zu ziehen, um ein versehentliches Ablösen zu verhindern. Verdauen Sie die Leber für 12 Minuten und stoppen Sie die Perfusion, wenn die Leber ihre glatte braune Textur verliert und matschig wird.Verlängern Sie bei Bedarf die Verdauungszeit. Nach der Verdauung der Leber schneiden Sie die Pfortader vorsichtig die Kanüle ab. Und dann übertragen Sie die Leber in kaltes DMEM, um die Hepatozyten zu isolieren.Klopfen Sie vorsichtig mit der Rückseite der gekrümmten Pinzette auf die Leber, um die Glitzerkapsel zu brechen und abzuziehen. Und geben Sie die Leberzellen frei, indem Sie die Leber in DMEM sanft schwanken, bis die Zellen in den Medien vollständig dissoziiert sind. Die Lebensfähigkeit von Hepatozyten lag zwischen 88 und 94,8%, wie durch Trip- und Blauzählung bestimmt.Die Ausbeute an Hepatozyten von Ratten mit einem Gewicht von 200 bis 300 Gramm betrug bis zu fünfmal 10 bis achte Zellen pro Isolierung. Die repräsentativen Bilder zeigen eine ungereinigte Leberzellsuspension und eine gereinigte Hepatozytensuspension. Die Reinheit der isolierten Hepatozyten betrug etwa 96,8%, was durch Zählen von Albumin-positiven fluoreszierenden gefärbten Zellen im Verhältnis zur Gesamtzahl der Zellkerne quantifiziert wurde.In den repräsentativen Bildern, die in falscher Farbe gezeigt werden, steht Grün für das Albumin und Blau für die Zellkerne mit Albumin. Zellkerne ohne Albumin sind rot hervorgehoben. Die Hepatozyten in der Sandwichkultur bildeten ausgeprägte Gallenkanäle und hatten einen guten Zellzellkontakt.Wie aus Albumin-, Harnstoff- und Cytochrom-P450-Assays hervorgeht, wiesen die Hepatozyten eine hohe Harnstoff- und Albuminsekretion auf. Am dritten Tag zeigten die Hepatozyten hohe Enzymaktivitäten für CYP1A2, CYP2B1/2 und CYP3B2. Seien Sie mental vorbereitet, bevor Sie die Nadel in die Pfortader einführen.Nach dem Einsetzen muss ein Chirurg ohne Puls fortfahren, bis die Pumpendrehzahl nach dem Schneiden des IVC erhöht wurde.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Primäre Kultur der erwachsenen Ratte Herz Myozyten

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Forschung

Biologie

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Isolierung von Ratten-Portal Fibroblasten durch<em&gt; In-situ</em&gt; Leberperfusion

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolierung und Primärkultur von Ratten Leberzellen

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Isolierung von Immunzellen aus Primärtumoren

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells

Kultivierung primären Ratten Inner Medulläre Sammelkanal Cells

Arginine-vasopressin (AVP) facilitates water reabsorption by renal collecting duct principal cells and thereby fine-tunes body water homeostasis. AVP ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolierung und Kultivierung von primären Maus Azinuszellen des Pankreas

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

Isolierung von humanen Hepatozyten durch eine Zwei-Schritt-Verfahren Collagenase Perfusion

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolation und Primärkultur von Maus Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Bestimmung der Fettsäureoxidation und Lipogenese in Maus primären Hepatozyten

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Protokoll für die Isolierung von primären humanen Hepatozyten und entsprechende Hauptpopulationen von Nicht-parenchymale Leberzellen

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...