Name: isolation of primary rat hepatocytes with multiparameter perfusion control
Uploaded: 2021-04-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control at JoVE.com

עבודה זו נתמכת בחלקה על ידי MOE ARC (MOE2017-T2-1-149); מענק זרעי חדשנות של NUHS 2017 (NUHSRO/2017/051/InnovSeed/02); המכון למכנוביולוגיה של סינגפור (R-714-106-004-135); והמכון לביו-הנדסה וננו-טכנולוגיה, המועצה למחקר ביו-רפואי, הסוכנות למדע, טכנולוגיה ומחקר (A*STAR) (מספרי פרויקטים IAF-PP H18/01/a0/014, IAF-PP H18/01/a0/K14 ו-MedCaP-LOA-18-02) מימון להנרי יו. נג צ'אן וויי הוא חוקר של האוניברסיטה הלאומית של סינגפור. ברצוננו להודות ליחידת המיקרוסקופיה הקונפוקלית וליחידת הציטומטריה של זרימה של האוניברסיטה הלאומית של סינגפור על עזרה וייעוץ בניתוח טוהר הפטוציטים.

כל ההליכים ושיכון בעלי החיים בוצעו תחת מספרי פרוטוקול R15-0027 ו- R19-0669 בהתאם לדרישות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של האוניברסיטה הלאומית של סינגפור.
1. הכנת פתרונות ומכשירי ניתוח
<ol><li>הכינו מאגרים ומדיה לתרביות תאים בטבלה 1 באמצעות מים אולטרה-פוריים.</li>...

<ol>
	<li>Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. H., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+rat+hepatic+cells.">Isolation and primary culture of rat hepatic cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).</li><li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion.">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).</li><li>Green, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+primary+hepatocytes+from+human+tissue:+optimising+the+use+of+small+non-encapsulated+liver+resection+surplus.">The isolation of primary hepatocytes from human tissue: optimising the use of small non-encapsulated liver resection surplus.</a> Cell and Tissue Banking. 18 (4), 597-604 (2017).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).</li><li>Gopalakrishnan, S., Harris, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+liver+endocytosis+followed+by+purification+of+liver+cells+by+liver+perfusion.">In vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3138 (2011).</li><li>Wen, J. W., Olsen, A. L., Perepelyuk, M., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+rat+portal+fibroblasts+by+in+situ+liver+perfusion.">Isolation of rat portal fibroblasts by in situ liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3669 (2012).</li><li>Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+3D+collagen+sandwich+culture+of+primary+mouse+hepatocytes+to+study+the+role+of+cytoskeleton+in+bile+canalicular+formation+in+vitro.">Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60501 (2019).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+purification+of+immune+cells+from+the+liver.">Isolation and purification of immune cells from the liver.</a> International Immunopharmacology. 85 (95), 106632 (2020).</li><li>Salem, E. S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+mouse+hepatocytes+for+nascent+protein+synthesis+analysis+by+non-radioactive+L-azidohomoalanine+labeling+method.">Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive L-azidohomoalanine labeling method.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323 (2018).</li><li>Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethered+spheroids+as+an+in+vitro+hepatocyte+model+for+drug+safety+screening.">Tethered spheroids as an in vitro hepatocyte model for drug safety screening.</a> Biomaterials. 33 (7), 2165-2176 (2012).</li><li>Kegel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+isolation+of+primary+human+hepatocytes+and+corresponding+major+populations+of+non-parenchymal+liver+cells.">Protocol for isolation of primary human hepatocytes and corresponding major populations of non-parenchymal liver cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53069 (2016).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vertical-flow+bioreactor+array+compacts+hepatocytes+for+enhanced+polarity+and+functions.">A vertical-flow bioreactor array compacts hepatocytes for enhanced polarity and functions.</a> Lab on a Chip. 16 (20), 3898-3908 (2016).</li><li>Du, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+sandwich+culture+of+3D+hepatocyte+monolayer.">Synthetic sandwich culture of 3D hepatocyte monolayer.</a> Biomaterials. 29 (3), 290-301 (2008).</li><li>Tong, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constrained+spheroids+for+prolonged+hepatocyte+culture.">Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture.</a> Biomaterials. 80, 106-120 (2016).</li><li>Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar-flow+immediate-overlay+hepatocyte+sandwich+perfusion+system+for+drug+hepatotoxicity+testing.">Laminar-flow immediate-overlay hepatocyte sandwich perfusion system for drug hepatotoxicity testing.</a> Biomaterials. 30 (30), 5927-5936 (2009).</li><li>Gupta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+canaliculi+contract+autonomously+by+releasing+calcium+into+hepatocytes+via+mechanosensitive+calcium+channel.">Bile canaliculi contract autonomously by releasing calcium into hepatocytes via mechanosensitive calcium channel.</a> Biomaterials. 259, 120283 (2020).</li><li>Horner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Percoll+purification+on+isolation+of+primary+human+hepatocytes.">Impact of Percoll purification on isolation of primary human hepatocytes.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6542 (2019).</li><li>Osypiw, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpopulations+of+rat+hepatocytes+separated+by+Percoll+density-gradient+centrifugation+show+characteristics+consistent+with+different+acinar+locations.">Subpopulations of rat hepatocytes separated by Percoll density-gradient centrifugation show characteristics consistent with different acinar locations.</a> The Biochemical Journal. 304, 617-624 (1994).</li><li>Beal, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+animal+model+of+ex+vivo+normothermic+liver+perfusion.">A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541 (2018).</li><li>Hillebrandt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedure+for+decellularization+of+rat+livers+in+an+oscillating-pressure+perfusion+device.">Procedure for decellularization of rat livers in an oscillating-pressure perfusion device.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), e53029 (2015).</li></ol>

ישנן מספר נקודות שחשוב במיוחד לבחון עבור הליך זלוף קולגן דו-שלבי באופן כללי. ראשית, יש לתת טיפול מיוחד בעת כריתת הכבד. יש לוודא כי מערכת העיכול אינה ניזוקה שכן דליפה של התוכן תגרום לזיהום חיידקי. בנוסף, הימנעו מפגיעה בקפסולת גליסון, המכסה את פני השטח של הכבד במהלך ההליך החייתי. אם הקרע גדול מ...

הפטוציטים ראשוניים הם כלים חשובים למחקר בסיסי הקשור לכבד, לטיפול במחלות וליישום כגון בדיקות תרופות. תקן הזהב הנוכחי לבידוד הפטוציטים ראשוני הוא הליך פיזור הקולג'נאז הדו-שלבי 1,2,3 שהוצג על ידי Seglen בשנות ה-704. עם זאת, הליך זה הוא מאתגר מבחינה טכנית ויש לו שיעור כישלון גבוה כאשר הוא מבוצע על ידי מנתחים מתחילים. גם כאשר פרפוזיה נחשבת מוצלחת, ניתן להבחין בהבדלים דרסטיים בכדאיות הפטוציטים (בדרך כלל 60%-95%) ובתפוקה (0.5-5 x 108 לכל 200-300 גרם חולדה) בין בידודים. זה משפיע על האיכות וההיקף של ניסויים במורד הזרם. מלבד ההליך הטכני, מערך הזלוף המשמש לבידוד, זמין מסחרית או בנוי בהתאמה אישית, הוא גורם תורם. יש לתת תשומת לב להרכבה, אופטימיזציה ותחזוקה של הגדרת הזלוף. מטרת פרוטוקול זה היא לשפר את שיעור ההצלחה והיציבות בין בידודים של הפטוציטים ראשוניים של חולדה באמצעות בקרת פרפוזיה מרובת-פרמטרים של ההליך הטכני והתקנת זלוף של הליך פיזור קולגןאז דו-שלבי.
מההיבט הטכני, השלב הקשה ביותר בהליך הוא תותח ורידי הפורטל. באשר לצעדים האחרים, אם נצפה תרגול טוב וננקטים אמצעי זהירות כלליים, ניתן לשפר את יציבות הבידוד. לכן, הבנת ההנמקה לכל שלב חשובה כדי שהמנתח יוכל להגיב למשתנים שונים שעלולים להתרחש במהלך ההליך.
פרוטוקולים שונים לבידוד של הפטוציטים ותאים שאינם פרנכימליים בכבד מחולדה ועכבר פורסמו 1,2,5,6,7,8,9. להגדרות הזלוף ששימשו בפרוטוקולים אלה היו מספר חסרונות, הכוללים שימוש חוזר בצינורות פרפוזיה, בעיות בבקרת טמפרטורה, צורך באופטימיזציה שגרתית של פרמטרי פרפוזיה ו/או שימוש בסוג לא מתאים של צנתר תוך ורידי (IV) עבור תותח ורידי פורטלי. שימוש חוזר בצינורות זלעפות יגדיל את הסיכוי לזיהום, במיוחד אם הצינורות לא נוקו וחוטאו כראוי. שימוש חוזר בצינורות ללא החלפה שגרתית יחשוף גם את מערך הזלוף לבעיות כגון צינורות או מחברים דולפים, מלכודת בועות סתומה וצינורות מכווצים, כל אלה יפחיתו באופן משמעותי את הלחץ וקצב הזרימה של התפשטות, ובכך ישפיעו על יעילות העיכול בכבד. ללא מקור חום קבוע בתצורות מסוימות לבקרת טמפרטורה, מאגרים שחוממו מראש יתקררו עם הזמן, מה שיוביל לפעילות ועיכול נמוכים של קולגן. אף על פי שתצורות אחרות משתמשות במעבה זכוכית מעיל המחובר למפיץ מים כדי לחמם את החיץ, הן מגושמות ודורשות ניקוי קפדני. יש למדוד ולייעל את הטמפרטורה, הלחץ וקצב הזרימה של החיץ היוצא מהקטטר לפני תחילת הבידוד כדי להבטיח מצב זלוף יציב. גם לאחר האופטימיזציה, הפרמטרים עדיין יכולים להשתנות באמצע הדרך במהלך הבידוד עקב פעולות המפעיל, ובכך להוביל לזלוף ועיכול לא אופטימליים. רוב הסוגים של קטטר IV אינם מתאימים לקנלולציה של ורידים בפורטל מכיוון שהם אינם מאפשרים זלוף רציף במהלך תותח. הם אינם מסוגלים להודיע מיד למנתח כאשר התותח מצליח. יתר על כן, זה מאתגר לאבטח את וריד הפורטל על הצנתר הרך מבלי לעוות אותו.
כאן אנו מטפלים בבעיות אלה באמצעות צינורות סטריליים חד פעמיים סטנדרטיים, ז'קט מחמם סיליקון לבקרת טמפרטורה מדויקת ויציבה, מערכת ניטור ואזעקה בזמן אמת עם אחסון וניהול נתונים ושימוש בצנתר IV מיוחד, המאפשר זלוף רציף תוך ניקוב וריד הפורטל במהלך התותח. למיטב ידיעתנו, אנו הקבוצה הראשונה המשלבת את כל התכונות הללו למערכת פרפוזיה משולבת (IPS) קומפקטית, מה שהופך אותה לניידת מאוד ומסוגלת להתאים למכסה מנוע זרימה למינרי כדי להבטיח פעולה אספטית.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Nipro</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>Nipro</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black braided silk non-absorbable, non-sterile surgical suture</td>
			<td>Look</td>
			<td>SP117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bochem 18/10 stainless steel forceps, sharp tip contain bent round tip</td>
			<td>Bochem</td>
			<td>10333511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Perfusion Set</td>
			<td>Vasinfuse</td>
			<td>BPF-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floating circular 1.5 mL microcentrifuge tube rack</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>German Standard Tissue Forceps, Serrated / 1&#215;2 teeth , 14.5cm</td>
			<td>Walentech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Cellstar aspirating pipette</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GN710183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrated Perfusion System</td>
			<td>Vasinfuse</td>
			<td>IPS-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors curved, stainless, 11cm</td>
			<td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td>
			<td>CVD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope with 10X lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh Sheet 100&#181;M Nylon</td>
			<td>Spectra-Teknic(s) Pte Ltd</td>
			<td>06630-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors, BL/BL, 13cm</td>
			<td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td>
			<td>STR &#8211; BL/BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors, SH/BL, 13cm</td>
			<td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td>
			<td>STR &#8211; SH/BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse force hemostatic clip</td>
			<td>Shanghai Jin Zhong Pte Ltd</td>
			<td>XEC230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents/Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>137101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17104019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>TCI</td>
			<td>D1961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31600-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11344-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1-9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC26764.298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type I bovine collagen</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>William&#8217;s E Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W1878</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary rat hepatocytes with multiparameter perfusion control

הפטוציטים ראשוניים נמצאים בשימוש נרחב במחקר בסיסי על מחלות כבד ועל בדיקות רעילות במבחנה. הליך זלוף הקולגאז הדו-שלבי לבידוד הפטוציטים ראשוני הוא מאתגר מבחינה טכנית, במיוחד בתותח ורידים פורטליים. ההליך גם נוטה לזיהום מזדמן ולשינויים בתנאי הזלוף עקב קשיים בהרכבה, אופטימיזציה או תחזוקה של מערך הזלוף. כאן מוצג פרוטוקול מפורט להליך משופר של פיזור קולגן בשני שלבים עם בקרת זלוף מולטיפארמטר. הפטוציטים ראשוניים של חולדות בודדו בהצלחה ובאמינות על ידי נקיטת אמצעי הזהירות הטכניים הדרושים בשלבים קריטיים של ההליך, ועל ידי הפחתת הקושי התפעולי והפחתת השונות של פרמטרי הזלוף באמצעות אימוץ צנתר תוך ורידי מיוחד, צינורות חד פעמיים סטריליים סטנדרטיים, בקרת טמפרטורה ומערכת ניטור ואזעקה בזמן אמת. הפטוציטים של החולדה הראשונית המבודדת מפגינים באופן עקבי כדאיות גבוהה של התאים (85%-95%), תפוקה (2-5 x 108 תאים לכל חולדה של 200-300 גרם) ופונקציונליות (פעילות אלבומין, אוריאה ו-CYP). ההליך הושלם על ידי מערכת פרפוזיה משולבת, שהיא קומפקטית מספיק כדי להיות מוגדרת במכסה הזרימה הלמינרי כדי להבטיח פעולה אספטית.

מנתח יכול לדעת אם זלוף הכבד מתבצע בצורה חלקה על ידי התבוננות בתוצאה לאחר שלבים מסוימים. ניתן לראות את התוצאה הראשונה עם תותח, חיתוך של ה- IVC האינפרא-היפטי, והשבת קצב זרימת הזלוף. הכבד היה צריך לשנות לחלוטין את צבעו מאדום כהה לחום, תוך שמירה על נפחו. אם הכבד נראה מעט מנופח ויש לו גוון אדמדם או כ?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control at JoVE.com

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

פרוטוקול זה מפרט את השימוש בצנתר תוך ורידי מיוחד, צינורות חד פעמיים סטריליים סטנדרטיים, בקרת טמפרטורה בתוספת ניטור בזמן אמת, ומערכת אזעקה להליך זלוף קולגןאז דו-שלבי כדי לשפר את העקביות בכדאיות, בתפוקה ובפונקציונליות של הפטוציטים של חולדה ראשונית מבודדת.

בידוד של הפטוציטים ראשוניים של חולדות עם בקרת זלוף רב-פרמטרית

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...

פרוטוקול בידוד זה של הפטוציטים של חולדה מבוסס על כריתת הכבד לפני התקרבות העיכול. הפרוטוקול מציג מערכת פרפוזיה משולבת קומפקטית וניידת לבידוד תאים. טכניקה זו כוללת מחזור קולגןאז אשר מפחית את נפח השימוש בקולגאז, ומספק גמישות רבה יותר בהארכת זמן העיכול תוך הבטחת תפוקת כבידה גבוהה ותפקוד ספציפי של הפטוציטים.שים את החולדה במכסה המנוע. לאחר חיתוך שרירי הבטן, לדחוף את המעיים ימינה עם הגב של המלקחיים המעוקלים. שברו את הממברנה שמתחת לצינור המרה עם קצה המלקחיים המעוקלים ללולאה של התפר סביב וריד הפורטל וצינור המרה.השתמשו בתפר כירורגי משי כדי ליצור ליגטורה רופפת מאוד סביב וריד הפורטל קרוב לכבד, רגע לפני שהווריד מסתעף שמאלה וימינה לאונות כבד שונות. כשני עד שלושה סנטימטרים במעלה הזרם של הליגטורה הראשונה, רגע לפני שווריד הקיבה מסתעף מווריד הפורטל, יוצרים חור דרך הרקמה שמתחת לווריד הפורטל עם קצות שני זוגות מלקחיים מעוקלים. לאחר מכן מתחו את החור כדי לתמוך בווריד הפורטל במהלך התותח.מניעת הצטברות לחץ בכבד על ידי הפחתת מהירות המשאבה לארבעה סל"ד לקצב זרימה של כשלושה מיליליטר לדקה. וודאו שהזרימה החוצה של המאגר נטול הסידן מהקטטר התוך ורידי מצטמצמת לטפטוף איטי. תוך כדי תמיכה עדינה בווריד הפורטל עם מלקחיים, החזיקו את הצנתר התוך ורידי כששיפוע המחט פונה כלפי מעלה.ולהכניס את המחט לווריד הפורטל בזווית של 10 עד 20 מעלות. ואז לאט לאט להתקדם עד שכל השיפוע נמצא בתוך הווריד. הכנסה נכונה אמורה לגרום לצביעת צבע הכבד.מקדמים את הצינורית מעל המחט, ומחזירים את המחט שמאחורי הצינורית על ידי משיכת הכנף לאחור עם האצבע המורה תוך החזקת הצנתר עם האגודל והאצבע האמצעית. מאבטחים את וריד הפורטל על הצנתר באמצעות קליפס וריד וגוזר מתחת לווריד הפורטל כדי למנוע הפרעה בזרימה. לאחר מכן, חותכים את הווריד הנבוב התחתון התת-היפטי כדי למנוע את הצטברות הלחץ בכבד, ומתבוננים בדחפים המדרבנים את הדם כדי להבטיח את החתך הנכון.הגדל את מהירות המשאבה ל-38 סל"ד לקבלת קצב זרימה של כ-33 מיליליטר לדקה. ולשטוף את הכבד שלוש פעמים על ידי סגירת הווריד הנבוב התחתון האינפרא-היפטי עם מלקחיים למשך שתיים-שלוש שניות, ואז לפתוח אותו מחדש. על מנת לחדור את כל אונות הכבד, להתאים את המיקום של קצה הצינורית ולוודא כי הוא ממוקם לפני וריד הפורטל מסתעף לאונות כבד שונות.לאחר מכן, הדקו את הליגטורה הרופפת סביב וריד הפורטל, מעט במעלה הזרם של נקודת ההסתעפות, והבטיחו את מיקום הצינורית בווריד הפורטל כדי למנוע זרימה אחורית של החיץ על ידי יצירת שלושה קשרים בנקודה שבה המחט הקשה תומכת בצינורית, בין הצינורית לחור הצדדי. לאחר כריתת הכבד לאפשר לכבד להחדיר עם חיץ ללא סידן במשך 12 דקות. לאחר מכן, הדקו את מהדק הרולר של חיץ ללא סידן ושחררו את מהדק הרולר של מאגר הקולגאזאז כדי לשנות את מאגר הזלוף.לאחר שחיץ הקולגאז מגיע לכבד, שטפו את הכבד שלוש פעמים על ידי סגירת הווריד הנבוב התחתון הסופרהפטי למשך שתיים עד שלוש שניות ופתיחתו מחדש. הזיזו בזהירות את הכבד לשלב שמעל הכוס לצורך סירקולציה של חיץ הקולגאז על ידי החזקת הסרעפת עם מלקחיים תוך תמיכה בצנתר, תוך הקפדה שלא למשוך את הצנתר כדי למנוע ניתוק מקרי. מעכלים את הכבד במשך 12 דקות, ומפסיקים את הזלוף כאשר הכבד מאבד את המרקם החום החלק שלו והופך לעיסה.להאריך את זמן העיכול במידת הצורך. לאחר העיכול של הכבד לחתוך את וריד הפורטל בזהירות להסיר את צינורית. ואז להעביר את הכבד לתוך DMEM קר כדי לבודד את hepatocytes.יש להקיש בעדינות על הכבד באמצעות הישבן של המלקחיים המעוקלים כדי לשבור ולקלף את כמוסת הבוהק. ושחררו את תאי הכבד על ידי הסטה עדינה של הכבד ב-DMEM עד שהתאים יתנתקו לחלוטין בתקשורת. הכדאיות של הפטוציטים הייתה בין 88 ל -94.8% כפי שנקבע על ידי טריפ וספירה כחולה.התשואה של הפטוציטים מחולדות במשקל 200 עד 300 גרם הייתה עד פי חמישה 10 עד התאים השמיני לכל בידוד. התמונות הייצוגיות מציגות תרחיף תאי כבד לא מנוצלים ותרחיף הפטוציטים מטוהר. טוהר ההפטוציטים המבודדים היה כ-96.8%, אשר כומת על ידי ספירת תאים מוכתמים פלואורסצנטיים חיוביים לאלבומין ביחס למספר הכולל של גרעיני התאים.בתמונות המייצגות המוצגות בצבע כוזב, ירוק מייצג את האלבומין, וכחול מציין את גרעיני התא עם אלבומין. גרעיני תאים ללא אלבומין מודגשים באדום. ההפטוציטים בתרבית הכריך יצרו קנאליקולי מרה מובחן, והיה להם מגע טוב עם תאי התא.כפי שמוצג על ידי מבחני אלבומין, אוריאה וציטוכרום P450, הפטוציטים הפגינו הפרשת אוריאה ואלבומין גבוהה. ביום השלישי, הפטוציטים הפגינו פעילות אנזימים גבוהה עבור CYP1A2, CYP2B1/2 ו-CYP3B2. היו מוכנים נפשית לפני הכנסת המחט לווריד הפורטל.עם ההחדרה, המנתח יצטרך להמשיך ללא דופק עד שמהירות המשאבה הוגברה לאחר חיתוך ה- IVC.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

תרבות ראשונית של הלב Myocytes למבוגרים עכברוש

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

הבידוד של Fibroblasts פורטל עכברוש ידי<em&gt; באתרו</em&gt; כבד זלוף

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

בידוד תרבות ראשונית של תאים בכבד עכברוש

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

בידוד של תאים חיסוניים של גידולים ראשוניים

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells

Medullary העכברוש הראשוני culturing הפנימי איסוף תאי Duct

Arginine-vasopressin (AVP) facilitates water reabsorption by renal collecting duct principal cells and thereby fine-tunes body water homeostasis. AVP ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

בידוד והתרבות של תאי לבלב הראשיים acinar עכבר

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

בידוד של hepatocytes האנושי על ידי שני שלבים Collagenase זלוף נוהל

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

קביעת חומצות שומן החמצון וLipogenesis בעכבר העיקרי hepatocytes

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

פרוטוקול הבידוד של hepatocytes האדם הראשי הקביל סרן אוכלוסיות של תאים בכבד ללא parenchymal

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...