Name: isolation of primary rat hepatocytes with multiparameter perfusion control
Uploaded: 2021-04-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control at JoVE.com

Questo lavoro è supportato in parte da MOE ARC (MOE2017-T2-1-149); NUHS Innovation Seed Grant 2017 (NUHSRO/2017/051/InnovSeed/02); Istituto di meccanobiologia di Singapore (R-714-106-004-135); e Institute of Bioengineering and Nanotechnology, Biomedical Research Council, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR) (Project Numbers IAF-PP H18/01/a0/014, IAF-PP H18/01/a0/K14 e MedCaP-LOA-18-02) finanziamenti a Hanry Yu. Ng Chan Way è uno studioso di ricerca della National University of Singapore. Vorremmo ringraziare l'unità di microscopia confocale e l'unità di citometria a flusso dell'Università Nazionale di Singapore per l'aiuto e la consulenza nell'analisi della purezza degli epatociti.

Tutte le procedure e la stabulazione degli animali sono state eseguite con i numeri di protocollo R15-0027 e R19-0669 in conformità con i requisiti del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università Nazionale di Singapore.
1. Preparazione di soluzioni e strumenti chirurgici
<ol><li>Preparare tamponi e terreni di coltura cellulare nella Tabella 1 utilizzando acqua ultrapura.</li>
	<li>Preriscaldare il tampone privo di calcio e il tampone di...

<ol>
	<li>Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. H., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+rat+hepatic+cells.">Isolation and primary culture of rat hepatic cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).</li><li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion.">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).</li><li>Green, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+primary+hepatocytes+from+human+tissue:+optimising+the+use+of+small+non-encapsulated+liver+resection+surplus.">The isolation of primary hepatocytes from human tissue: optimising the use of small non-encapsulated liver resection surplus.</a> Cell and Tissue Banking. 18 (4), 597-604 (2017).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).</li><li>Gopalakrishnan, S., Harris, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+liver+endocytosis+followed+by+purification+of+liver+cells+by+liver+perfusion.">In vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3138 (2011).</li><li>Wen, J. W., Olsen, A. L., Perepelyuk, M., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+rat+portal+fibroblasts+by+in+situ+liver+perfusion.">Isolation of rat portal fibroblasts by in situ liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3669 (2012).</li><li>Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+3D+collagen+sandwich+culture+of+primary+mouse+hepatocytes+to+study+the+role+of+cytoskeleton+in+bile+canalicular+formation+in+vitro.">Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60501 (2019).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+purification+of+immune+cells+from+the+liver.">Isolation and purification of immune cells from the liver.</a> International Immunopharmacology. 85 (95), 106632 (2020).</li><li>Salem, E. S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+mouse+hepatocytes+for+nascent+protein+synthesis+analysis+by+non-radioactive+L-azidohomoalanine+labeling+method.">Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive L-azidohomoalanine labeling method.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323 (2018).</li><li>Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethered+spheroids+as+an+in+vitro+hepatocyte+model+for+drug+safety+screening.">Tethered spheroids as an in vitro hepatocyte model for drug safety screening.</a> Biomaterials. 33 (7), 2165-2176 (2012).</li><li>Kegel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+isolation+of+primary+human+hepatocytes+and+corresponding+major+populations+of+non-parenchymal+liver+cells.">Protocol for isolation of primary human hepatocytes and corresponding major populations of non-parenchymal liver cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53069 (2016).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vertical-flow+bioreactor+array+compacts+hepatocytes+for+enhanced+polarity+and+functions.">A vertical-flow bioreactor array compacts hepatocytes for enhanced polarity and functions.</a> Lab on a Chip. 16 (20), 3898-3908 (2016).</li><li>Du, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+sandwich+culture+of+3D+hepatocyte+monolayer.">Synthetic sandwich culture of 3D hepatocyte monolayer.</a> Biomaterials. 29 (3), 290-301 (2008).</li><li>Tong, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constrained+spheroids+for+prolonged+hepatocyte+culture.">Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture.</a> Biomaterials. 80, 106-120 (2016).</li><li>Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar-flow+immediate-overlay+hepatocyte+sandwich+perfusion+system+for+drug+hepatotoxicity+testing.">Laminar-flow immediate-overlay hepatocyte sandwich perfusion system for drug hepatotoxicity testing.</a> Biomaterials. 30 (30), 5927-5936 (2009).</li><li>Gupta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+canaliculi+contract+autonomously+by+releasing+calcium+into+hepatocytes+via+mechanosensitive+calcium+channel.">Bile canaliculi contract autonomously by releasing calcium into hepatocytes via mechanosensitive calcium channel.</a> Biomaterials. 259, 120283 (2020).</li><li>Horner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Percoll+purification+on+isolation+of+primary+human+hepatocytes.">Impact of Percoll purification on isolation of primary human hepatocytes.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6542 (2019).</li><li>Osypiw, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpopulations+of+rat+hepatocytes+separated+by+Percoll+density-gradient+centrifugation+show+characteristics+consistent+with+different+acinar+locations.">Subpopulations of rat hepatocytes separated by Percoll density-gradient centrifugation show characteristics consistent with different acinar locations.</a> The Biochemical Journal. 304, 617-624 (1994).</li><li>Beal, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+animal+model+of+ex+vivo+normothermic+liver+perfusion.">A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541 (2018).</li><li>Hillebrandt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedure+for+decellularization+of+rat+livers+in+an+oscillating-pressure+perfusion+device.">Procedure for decellularization of rat livers in an oscillating-pressure perfusion device.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), e53029 (2015).</li></ol>

Ci sono alcuni punti che sono particolarmente importanti da osservare per la procedura di perfusione della collagenasi in due fasi in generale. In primo luogo, è necessario prestare particolare attenzione quando si reseca il fegato. Assicurarsi che il tratto gastrointestinale non sia danneggiato in quanto la perdita del contenuto comporterà la contaminazione batterica. Inoltre, evitare di danneggiare la capsula di Glisson, che copre la superficie del fegato durante la procedura animale. Se la lacrima è abbastanza gran...

Gli epatociti primari sono strumenti importanti per la ricerca di base correlata al fegato, il trattamento delle malattie e l'applicazione come i test antidroga. L'attuale gold standard per l'isolamento primario degli epatociti è la procedura di perfusione della collagenasi in due fasi 1,2,3 introdotta da Seglen nel 1970 4. Tuttavia, questa procedura è tecnicamente impegnativa e ha un alto tasso di fallimento se eseguita da chirurghi alle prime armi. Anche quando una perfusione è considerata di successo, si possono osservare drastiche differenze nella vitalità degli epatociti (in genere 60%-95%) e nella resa (0,5-5 x 108 per 200-300 g di ratto) tra gli isolamenti. Ciò influenza la qualità e la scala degli esperimenti a valle. Oltre alla procedura tecnica, la configurazione di perfusione utilizzata per l'isolamento, disponibile in commercio o costruita su misura, è un fattore che contribuisce. Bisogna prestare attenzione all'assemblaggio, all'ottimizzazione e alla manutenzione della configurazione della perfusione. Lo scopo di questo protocollo è quello di migliorare il tasso di successo e la stabilità tra gli isolamenti degli epatociti primari di ratto attraverso il controllo della perfusione multiparametrica della procedura tecnica e la configurazione della perfusione della collagenasi in due fasi.
Dall'aspetto tecnico, il passo più difficile nella procedura è la cannulazione della vena porta. Per quanto riguarda gli altri passaggi, se si osservano buone pratiche e si prendono precauzioni generali, la stabilità dell'isolamento può essere migliorata. Pertanto, la comprensione del ragionamento per ogni passaggio è importante in modo che il chirurgo possa rispondere a varie variabili che possono verificarsi durante la procedura.
Vari protocolli per l'isolamento di epatociti e cellule epatiche non parenchimali da ratti e topi sono stati pubblicati 1,2,5,6,7,8,9. Le configurazioni di perfusione utilizzate in questi protocolli presentavano diversi svantaggi, tra cui il riutilizzo di tubi di perfusione, problemi con il controllo della temperatura, necessità di ottimizzazione di routine dei parametri di perfusione e / o l'uso di un tipo inadatto di catetere endovenoso (IV) per la cannulazione della vena porta. Il riutilizzo dei tubi di perfusione aumenterà le possibilità di contaminazione, soprattutto se il tubo non è stato pulito e disinfettato correttamente. Il riutilizzo dei tubi senza sostituzione di routine esporrà anche la configurazione della perfusione a problemi come tubi o connettori che perdono, trappola a bolle intasata e tubi ristretti, che ridurranno sostanzialmente la pressione e la portata del perfusato, influenzando così l'efficienza della digestione del fegato. Senza una fonte di calore costante in alcune configurazioni per il controllo della temperatura, i tamponi preriscaldati si raffredderanno nel tempo, portando a una bassa attività e digestione della collagenasi. Sebbene altre configurazioni utilizzino un condensatore di vetro rivestito collegato a un circolatore d'acqua per riscaldare il buffer, sono ingombranti e richiedono un'attenta pulizia. La temperatura, la pressione e la portata del tampone in uscita dal catetere devono essere misurate e ottimizzate prima dell'inizio dell'isolamento per garantire condizioni di perfusione stabili. Anche dopo l'ottimizzazione, i parametri potrebbero ancora cambiare a metà strada durante l'isolamento a causa delle azioni dell'operatore, portando così a una perfusione e una digestione non ottimali. La maggior parte dei tipi di catetere IV non sono adatti per la cannulazione della vena porta perché non consentono la perfusione continua durante la cannulazione. Non sono in grado di informare immediatamente il chirurgo quando la cannulazione ha successo. Inoltre, è difficile fissare la vena porta sul catetere morbido senza deformarlo.
Qui, affrontiamo questi problemi utilizzando tubi sterili monouso standardizzati, una camicia riscaldante in silicone per un controllo preciso e stabile della temperatura, monitoraggio e sistema di allarme in tempo reale con memorizzazione e gestione dei dati e l'uso di uno speciale catetere IV, che consente una perfusione continua durante la perforazione della vena porta durante la cannulazione. Per quanto ne sappiamo, siamo il primo gruppo a combinare tutte queste caratteristiche in un sistema di perfusione integrato (IPS) compatto, che lo rende altamente portatile e in grado di essere inserito in una cappa a flusso laminare per garantire il funzionamento asettico.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Nipro</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>Nipro</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black braided silk non-absorbable, non-sterile surgical suture</td>
			<td>Look</td>
			<td>SP117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bochem 18/10 stainless steel forceps, sharp tip contain bent round tip</td>
			<td>Bochem</td>
			<td>10333511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Perfusion Set</td>
			<td>Vasinfuse</td>
			<td>BPF-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floating circular 1.5 mL microcentrifuge tube rack</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>German Standard Tissue Forceps, Serrated / 1&#215;2 teeth , 14.5cm</td>
			<td>Walentech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Cellstar aspirating pipette</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GN710183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrated Perfusion System</td>
			<td>Vasinfuse</td>
			<td>IPS-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors curved, stainless, 11cm</td>
			<td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td>
			<td>CVD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope with 10X lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh Sheet 100&#181;M Nylon</td>
			<td>Spectra-Teknic(s) Pte Ltd</td>
			<td>06630-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors, BL/BL, 13cm</td>
			<td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td>
			<td>STR &#8211; BL/BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors, SH/BL, 13cm</td>
			<td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td>
			<td>STR &#8211; SH/BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse force hemostatic clip</td>
			<td>Shanghai Jin Zhong Pte Ltd</td>
			<td>XEC230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents/Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>137101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17104019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>TCI</td>
			<td>D1961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31600-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11344-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1-9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC26764.298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type I bovine collagen</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>William&#8217;s E Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W1878</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary rat hepatocytes with multiparameter perfusion control

Gli epatociti primari sono ampiamente utilizzati nella ricerca di base sulle malattie del fegato e per i test di tossicità in vitro. La procedura di perfusione della collagenasi in due fasi per l'isolamento primario degli epatociti è tecnicamente impegnativa, specialmente nella cannulazione della vena porta. La procedura è anche soggetta a contaminazione occasionale e variazioni nelle condizioni di perfusione a causa di difficoltà nell'assemblaggio, nell'ottimizzazione o nella manutenzione della configurazione della perfusione. Qui, viene presentato un protocollo dettagliato per una migliore procedura di perfusione di collagenasi in due fasi con controllo della perfusione multiparametrica. Gli epatociti primari di ratto sono stati isolati con successo e in modo affidabile adottando le necessarie precauzioni tecniche nelle fasi critiche della procedura e riducendo la difficoltà operativa e mitigando la variabilità dei parametri di perfusione attraverso l'adozione di uno speciale catetere endovenoso, tubi monouso sterili standardizzati, controllo della temperatura e sistema di monitoraggio e allarme in tempo reale. Gli epatociti primari isolati di ratto mostrano costantemente un'elevata vitalità cellulare (85%-95%), resa (2-5 x 108 cellule per 200-300 g di ratto) e funzionalità (albumina, urea e attività del CYP). La procedura è stata completata da un sistema di perfusione integrato, che è abbastanza compatto da essere installato nella cappa a flusso laminare per garantire il funzionamento asettico.

Un chirurgo potrebbe dire se la perfusione epatica sta procedendo senza intoppi osservando il risultato dopo determinati passaggi. Il primo risultato può essere osservato al momento della cannulazione, del taglio dell'IVC infraepatico e del ripristino della portata di perfusione. Il fegato dovrebbe aver cambiato completamente colore dal rosso scuro al marrone, pur mantenendo il suo volume. Se il fegato sembra leggermente sgonfio e ha una tinta rossastra o macchie di rosso, significa che la portata di perfusione è stata...

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Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Questo protocollo descrive l'uso di uno speciale catetere endovenoso, tubi monouso sterili standardizzati, controllo della temperatura integrato da monitoraggio in tempo reale e un sistema di allarme per la procedura di perfusione della collagenasi in due fasi per migliorare la coerenza nella vitalità, nella resa e nella funzionalità degli epatociti primari isolati di ratto.

Isolamento degli epatociti primari di ratto con controllo della perfusione multiparametrica

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...

Questo protocollo di isolamento degli epatociti di ratto si basa sulla resezione epatica prima dell'approccio digestivo. Il protocollo introduce un sistema di perfusione integrato compatto e portatile per l'isolamento cellulare. Questa tecnica prevede il ricircolo della collagenasi che riduce il volume di utilizzo della collagenasi e fornisce una maggiore flessibilità nell'estensione del tempo di digestione, garantendo al contempo un'elevata resa per gravità e una funzione specifica degli epatociti.Metti il topo nel cappuccio. Dopo aver tagliato i muscoli addominali, spingere l'intestino a destra con la parte posteriore della pinza curva. Rompere la membrana sotto il dotto biliare con la punta della pinza curva per avvolgere la sutura attorno alla vena porta e al dotto biliare.Utilizzare una sutura chirurgica di seta per creare una legatura molto sciolta attorno alla vena porta vicino al fegato, poco prima che la vena si ramifichi a sinistra ea destra in diversi lobi del fegato. Circa due o tre centimetri a monte della prima legatura, poco prima che la vena gastrica si dirama dalla vena porta, crei un foro attraverso il tessuto sotto la vena porta con le punte di due paia di pinze curve. Quindi allungare il foro per sostenere la vena porta durante la cannulazione.Prevenire l'accumulo di pressione nel fegato riducendo la velocità della pompa a quattro RPM per una portata di circa tre millilitri al minuto. E assicurarsi che il deflusso del tampone privo di calcio dal catetere endovenoso sia ridotto a una lenta flebo. Mentre si sostiene delicatamente la vena porta con una pinza, tenere il catetere endovenoso con la smussatura dell'ago rivolta verso l'alto.E inserire l'ago nella vena porta con un angolo da 10 a 20 gradi. Quindi avanzare lentamente fino a quando l'intera smussatura è all'interno della vena. L'inserimento corretto dovrebbe comportare lo sbiancamento del colore del fegato.Avanzare la cannula sopra l'ago e ritrarre l'ago dietro la cannula tirando indietro l'ala con l'indice mentre si tiene il catetere con il pollice e il dito medio. Fissare la vena porta sul catetere con una clip venosa e clip sotto la vena porta per evitare l'interruzione del flusso di perfusing. Quindi, tagliare la vena cava inferiore infraepatica per prevenire l'accumulo di pressione nel fegato e osservare gli impulsi di spurgo del sangue per garantire il taglio corretto.Aumentare la velocità della pompa a 38 RPM per una portata di circa 33 millilitri al minuto. E lavare il fegato tre volte chiudendo la vena cava inferiore infraepatica con una pinza per due o tre secondi, e poi riaprendola. Per perfondere tutti i lobi del fegato, regolare la posizione della punta della cannula e assicurarsi che sia posizionata prima che la vena porta si ramifichi in diversi lobi del fegato.Quindi, stringere la legatura sciolta attorno alla vena porta, leggermente a monte del punto di ramificazione, e fissare la posizione della cannula nella vena porta per impedire il riflusso del tampone facendo tre nodi nel punto in cui l'ago duro sostiene la cannula, tra la smussatura e il foro laterale. Dopo la resezione epatica lasciare che il fegato si perfonda con il tampone privo di calcio per 12 minuti. Quindi, stringere il morsetto a rulli del tampone privo di calcio e allentare il morsetto del rullo del tampone di collagenasi per cambiare il tampone di perfusione.Dopo che il tampone della collagenasi raggiunge il fegato, lavare il fegato tre volte chiudendo la vena cava inferiore sopraepatica per due o tre secondi e riaprendola. Spostare con attenzione il fegato sullo stadio sopra il becher per il ricircolo del tampone della collagenasi tenendo il diaframma con una pinza mentre si sostiene il catetere, facendo attenzione a non tirare il catetere per evitare il distacco accidentale. Digerire il fegato per 12 minuti e interrompere la perfusione quando il fegato perde la sua consistenza marrone liscia e diventa molle.Prolungare il tempo di digestione, se necessario. Dopo la digestione del fegato tagliare la vena porta rimuovere con cura la cannula. E poi trasferire il fegato in DMEM freddo per isolare gli epatociti.Picchiettare delicatamente il fegato usando il retro della pinza curva per rompere e staccare la capsula di luccichio. E rilasciare le cellule del fegato ondeggiando delicatamente il fegato in DMEM fino a quando le cellule sono completamente dissociate nel mezzo. La vitalità degli epatociti era compresa tra l'88 e il 94,8%, come determinato dal trip e dal conteggio blu.La resa di epatociti da ratti di peso compreso tra 200 e 300 grammi era fino a cinque volte 10 all'ottava cellula per isolamento. Le immagini rappresentative mostrano sospensione di cellule epatiche non purificate e sospensione epatocitaria purificata. La purezza degli epatociti isolati era di circa il 96,8%, che è stata quantificata contando le cellule colorate fluorescenti positive all'albumina in relazione al numero totale dei nuclei cellulari.Nelle immagini rappresentative mostrate in falso colore, il verde rappresenta l'albumina e il blu indica i nuclei cellulari con albumina. I nuclei cellulari senza albumina sono evidenziati in rosso. Gli epatociti in coltura sandwich formavano canalicoli biliari distinti e avevano un buon contatto cellulare cellulare.Come dimostrato dai saggi di albumina, urea e citocromo P450, gli epatociti hanno mostrato un'elevata secrezione di urea e albumina. Il terzo giorno, gli epatociti hanno mostrato un'elevata attività enzimatica per CYP1A2, CYP2B1/2 e CYP3B2. Essere mentalmente preparati prima di inserire l'ago nella vena porta.Al momento dell'inserimento, un chirurgo dovrà continuare senza impulso fino a quando la velocità della pompa non è stata aumentata dopo aver tagliato l'IVC.

Research

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Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Isolamento dei fibroblasti Portal ratto<em&gt; In situ</em&gt; Fegato perfusione

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolamento e la coltura primaria di cellule epatiche di ratto

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Isolamento di cellule immunitarie di tumori primari

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells

Coltura primaria Rat midollare interna Raccolta cellule del dotto

Arginine-vasopressin (AVP) facilitates water reabsorption by renal collecting duct principal cells and thereby fine-tunes body water homeostasis. AVP ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolamento e Cultura del mouse principale acinose pancreatiche Cellule

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

L&#39;isolamento di epatociti umani da un Two-step Collagenase perfusione procedura

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolamento e colture primarie di cellule di topo aortica endoteliali

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Determinazione della ossidazione degli acidi grassi e la lipogenesi nel topo primaria Epatociti

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Protocollo per l&#39;isolamento di epatociti umani primari e corrispondenti principali popolazioni di cellule del fegato non-parenchimali

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...