Name: isolation of primary rat hepatocytes with multiparameter perfusion control
Uploaded: 2021-04-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control at JoVE.com

이 작업은 MOE ARC (MOE2017-T2-1-149)에서 부분적으로 지원합니다. NUHS 혁신 종자 보조금 2017 (NUHSRO/2017/051/InnovSeed/02); 싱가포르 Mechanobiology Institute (R-714-106-004-135); 생명 공학 및 나노 기술 연구소, 생물 의학 연구위원회, 과학, 기술 및 연구기구 (A * STAR) (프로젝트 번호 IAF-PP H18 / 01 / a0 / 014, IAF-PP H18 / 01 / a0 / K14 및 MedCaP-LOA-18-02) Hanry Yu에 자금을 지원합니다. Ng Chan Way는 싱가포르 국립 대학의 연구 학자입니다. 싱가포르 국립대학교의 Confocal Microscopy Unit & Flow Cytometry Unit에 간세포 순도 분석에 대한 도움과 조언을 구해 주셔서 감사합니다.

모든 절차와 동물 주택은 싱가포르 국립 대학의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)의 요구 사항에 따라 프로토콜 번호 R15-0027 및 R19-0669로 수행되었습니다.
1. 용액 및 수술기구의 제조
<ol><li>초순수를 사용하여 표 1 의 완충액 및 세포 배양 배지를 준비한다.</li>
	<li>칼슘이 없는 완충액 및 콜라게나제 완충액을 사용 전에 수조에서 37°C로 미리 예온한다.</li>
	<l...

<ol>
	<li>Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. H., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+rat+hepatic+cells.">Isolation and primary culture of rat hepatic cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).</li><li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion.">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).</li><li>Green, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+primary+hepatocytes+from+human+tissue:+optimising+the+use+of+small+non-encapsulated+liver+resection+surplus.">The isolation of primary hepatocytes from human tissue: optimising the use of small non-encapsulated liver resection surplus.</a> Cell and Tissue Banking. 18 (4), 597-604 (2017).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).</li><li>Gopalakrishnan, S., Harris, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+liver+endocytosis+followed+by+purification+of+liver+cells+by+liver+perfusion.">In vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3138 (2011).</li><li>Wen, J. W., Olsen, A. L., Perepelyuk, M., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+rat+portal+fibroblasts+by+in+situ+liver+perfusion.">Isolation of rat portal fibroblasts by in situ liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3669 (2012).</li><li>Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+3D+collagen+sandwich+culture+of+primary+mouse+hepatocytes+to+study+the+role+of+cytoskeleton+in+bile+canalicular+formation+in+vitro.">Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60501 (2019).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+purification+of+immune+cells+from+the+liver.">Isolation and purification of immune cells from the liver.</a> International Immunopharmacology. 85 (95), 106632 (2020).</li><li>Salem, E. S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+mouse+hepatocytes+for+nascent+protein+synthesis+analysis+by+non-radioactive+L-azidohomoalanine+labeling+method.">Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive L-azidohomoalanine labeling method.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323 (2018).</li><li>Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethered+spheroids+as+an+in+vitro+hepatocyte+model+for+drug+safety+screening.">Tethered spheroids as an in vitro hepatocyte model for drug safety screening.</a> Biomaterials. 33 (7), 2165-2176 (2012).</li><li>Kegel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+isolation+of+primary+human+hepatocytes+and+corresponding+major+populations+of+non-parenchymal+liver+cells.">Protocol for isolation of primary human hepatocytes and corresponding major populations of non-parenchymal liver cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53069 (2016).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vertical-flow+bioreactor+array+compacts+hepatocytes+for+enhanced+polarity+and+functions.">A vertical-flow bioreactor array compacts hepatocytes for enhanced polarity and functions.</a> Lab on a Chip. 16 (20), 3898-3908 (2016).</li><li>Du, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+sandwich+culture+of+3D+hepatocyte+monolayer.">Synthetic sandwich culture of 3D hepatocyte monolayer.</a> Biomaterials. 29 (3), 290-301 (2008).</li><li>Tong, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constrained+spheroids+for+prolonged+hepatocyte+culture.">Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture.</a> Biomaterials. 80, 106-120 (2016).</li><li>Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar-flow+immediate-overlay+hepatocyte+sandwich+perfusion+system+for+drug+hepatotoxicity+testing.">Laminar-flow immediate-overlay hepatocyte sandwich perfusion system for drug hepatotoxicity testing.</a> Biomaterials. 30 (30), 5927-5936 (2009).</li><li>Gupta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+canaliculi+contract+autonomously+by+releasing+calcium+into+hepatocytes+via+mechanosensitive+calcium+channel.">Bile canaliculi contract autonomously by releasing calcium into hepatocytes via mechanosensitive calcium channel.</a> Biomaterials. 259, 120283 (2020).</li><li>Horner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Percoll+purification+on+isolation+of+primary+human+hepatocytes.">Impact of Percoll purification on isolation of primary human hepatocytes.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6542 (2019).</li><li>Osypiw, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpopulations+of+rat+hepatocytes+separated+by+Percoll+density-gradient+centrifugation+show+characteristics+consistent+with+different+acinar+locations.">Subpopulations of rat hepatocytes separated by Percoll density-gradient centrifugation show characteristics consistent with different acinar locations.</a> The Biochemical Journal. 304, 617-624 (1994).</li><li>Beal, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+animal+model+of+ex+vivo+normothermic+liver+perfusion.">A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541 (2018).</li><li>Hillebrandt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedure+for+decellularization+of+rat+livers+in+an+oscillating-pressure+perfusion+device.">Procedure for decellularization of rat livers in an oscillating-pressure perfusion device.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), e53029 (2015).</li></ol>

일반적으로 두 단계 콜라게나제 관류 절차에 대해 관찰하는 것이 특히 중요한 몇 가지 점이 있다. 첫째, 간을 절제할 때 특별한주의를 기울여야합니다. 내용물이 누출되면 박테리아 오염이 발생할 수 있으므로 위장관이 손상되지 않도록하십시오. 또한 동물 절차 중에 간 표면을 덮는 Glisson의 캡슐을 손상시키지 마십시오. 눈물이 충분히 크면 콜라게나제 완충액으로 분리된 간세포의 조기 방출을 ?...

원발성 간세포는 간 관련 기초 연구, 질병 치료 및 약물 검사와 같은 적용을위한 중요한 도구입니다. 일차 간세포 분리를 위한 현재의 황금 표준은 1970년대 Seglen이 도입한 2단계 콜라게나제 관류 절차 1,2,3입니다 4. 그러나이 절차는 기술적으로 도전적이며 초보 외과 의사가 수행 할 때 높은 실패율을 보입니다. 관류가 성공적인 것으로 간주되는 경우에도, 간세포 생존력 (전형적으로 60%-95%)과 수율 (200-300 g 래트 당 0.5-5 x 108)의 급격한 차이가 단리들 사이에서 관찰될 수 있다. 이는 다운스트림 실험의 품질과 규모에 영향을 미칩니다. 기술적 절차 외에도 상업적으로 이용 가능하거나 맞춤 제작 된 격리에 사용되는 관류 설정이 기여하는 요소입니다. 관류 설정의 조립, 최적화 및 유지 보수에주의를 기울여야합니다. 이 프로토콜의 목적은 두 단계 콜라게나제 관류 절차의 기술 절차 및 관류 설정의 다중 파라미터 관류 조절을 통해 일차 쥐 간세포의 단리의 성공률 및 안정성을 향상시키는 것이다.
기술적 측면에서 절차에서 가장 어려운 단계는 포털 정맥 통조림입니다. 다른 단계에 관해서는, 좋은 관행이 관찰되고 일반적인 예방 조치가 취해지면 격리의 안정성이 향상 될 수 있습니다. 따라서 외과 의사가 절차 중에 발생할 수있는 다양한 변수에 반응 할 수 있도록 각 단계에 대한 추론을 이해하는 것이 중요합니다.
래트 및 마우스로부터 간세포 및 간 비실질 세포를 단리하기 위한 다양한 프로토콜이 1,2,5,6,7,8,9 발표되었다. 이러한 프로토콜에 사용된 관류 설정은 관류 튜브의 재사용, 온도 제어 문제, 관류 파라미터의 일상적인 최적화 필요성 및/또는 포털 정맥 캐뉼레이션을 위한 부적합한 유형의 정맥내(IV) 카테터 사용 등 몇 가지 단점을 가지고 있었다. 관류 튜브를 재사용하면 특히 튜브를 제대로 청소하고 소독하지 않은 경우 오염 가능성이 높아집니다. 일상적인 교체없이 튜브를 재사용하면 관류 설정이 누출 된 튜브 또는 커넥터, 막힌 버블 트랩 및 수축 된 튜브와 같은 문제에 노출되며,이 모든 것이 퍼퓨 레이트 압력과 유량을 크게 감소시켜 간 소화 효율에 영향을 미칩니다. 온도 조절을 위한 일부 설정에서 일정한 열원이 없으면 미리 예열된 버퍼는 시간이 지남에 따라 냉각되어 콜라게나제 활성과 소화가 낮아집니다. 다른 설정은 버퍼를 따뜻하게하기 위해 물 순환기에 연결된 재킷 유리 콘덴서를 사용하지만 부피가 커서 조심스럽게 청소해야합니다. 카테터를 빠져나가는 버퍼의 온도, 압력 및 유량은 안정적인 관류 상태를 보장하기 위해 격리 시작 전에 측정되고 최적화되어야 합니다. 최적화 후에도 매개 변수는 작업자의 작업으로 인해 격리 중에 중간에 변경 될 수 있으므로 차선책의 관류 및 소화로 이어질 수 있습니다. IV 카테터의 대부분의 유형은 통조림 동안 지속적인 관류를 허용하지 않기 때문에 문맥 정맥 캐뉼레이션에 적합하지 않습니다. 그들은 통조림이 성공적 일 때 외과 의사에게 즉시 알릴 수 없습니다. 또한, 포털 정맥을 변형시키지 않고 부드러운 카테터에 고정시키는 것은 어렵습니다.
여기에서는 표준화 된 일회용 멸균 튜브, 정확하고 안정적인 온도 제어를위한 실리콘 히터 재킷, 데이터 저장 및 관리가있는 실시간 모니터링 및 경보 시스템 및 특수 IV 카테터 사용을 사용하여 이러한 문제를 해결합니다.이 카테터는 캐뉼레이션 중에 포털 정맥을 뚫는 동안 지속적인 관류를 허용합니다. 우리가 아는 한, 우리는 이러한 모든 기능을 컴팩트 한 통합 관류 시스템 (IPS)에 결합 한 최초의 그룹으로, 휴대성이 뛰어나고 무균 작동을 보장하기 위해 층류 후드에 장착 할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Nipro</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>Nipro</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black braided silk non-absorbable, non-sterile surgical suture</td>
			<td>Look</td>
			<td>SP117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bochem 18/10 stainless steel forceps, sharp tip contain bent round tip</td>
			<td>Bochem</td>
			<td>10333511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Perfusion Set</td>
			<td>Vasinfuse</td>
			<td>BPF-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floating circular 1.5 mL microcentrifuge tube rack</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>German Standard Tissue Forceps, Serrated / 1&#215;2 teeth , 14.5cm</td>
			<td>Walentech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Cellstar aspirating pipette</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GN710183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrated Perfusion System</td>
			<td>Vasinfuse</td>
			<td>IPS-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors curved, stainless, 11cm</td>
			<td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td>
			<td>CVD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope with 10X lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh Sheet 100&#181;M Nylon</td>
			<td>Spectra-Teknic(s) Pte Ltd</td>
			<td>06630-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors, BL/BL, 13cm</td>
			<td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td>
			<td>STR &#8211; BL/BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors, SH/BL, 13cm</td>
			<td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td>
			<td>STR &#8211; SH/BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse force hemostatic clip</td>
			<td>Shanghai Jin Zhong Pte Ltd</td>
			<td>XEC230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents/Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>137101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17104019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>TCI</td>
			<td>D1961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31600-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11344-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1-9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC26764.298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type I bovine collagen</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>William&#8217;s E Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W1878</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary rat hepatocytes with multiparameter perfusion control

원발성 간세포는 간 질환에 대한 기본 연구 및 시험관 내 독성 테스트에 널리 사용됩니다. 원발성 간세포 분리를 위한 두 단계 콜라게나제 관류 절차는 특히 문맥 정맥 절제술에서 기술적으로 도전적이다. 이 절차는 또한 관류 설정의 조립, 최적화 또는 유지 보수의 어려움으로 인해 때때로 오염되고 관류 조건의 변동이 발생하기 쉽습니다. 여기에서, 다중 파라미터 관류 조절을 통한 개선된 두 단계 콜라게나제 관류 절차를 위한 상세한 프로토콜이 제시된다. 일차 쥐 간세포는 절차의 중요한 단계에서 필요한 기술적 예방 조치를 취하고, 특수 정맥 카테터, 표준화 된 멸균 일회용 튜브, 온도 제어 및 실시간 모니터링 및 경보 시스템의 채택을 통해 운영 어려움을 줄이고 관류 매개 변수의 변동성을 완화함으로써 성공적이고 안정적으로 분리되었습니다. 단리된 일차 래트 간세포는 지속적으로 높은 세포 생존율 (85%-95%), 수율 (래트 200-300 g 당 2-5 x 108 세포) 및 기능성 (알부민, 우레아 및 CYP 활성)을 나타낸다. 이 절차는 무균 작동을 보장하기 위해 층류 후드에 설치하기에 충분히 컴팩트 한 통합 관류 시스템으로 보완되었습니다.

외과 의사는 특정 단계 후 결과를 관찰하여 간 관류가 원활하게 진행되고 있는지 여부를 알 수 있습니다. 첫 번째 결과는 캐너레이션, infrahepatic IVC의 절단 및 관류 유량 복원시 관찰 될 수 있습니다. 간은 볼륨을 유지하면서 진한 빨간색에서 갈색으로 완전히 변했어야합니다. 간이 약간 수축되어 보이고 붉은 색조 또는 붉은 색의 얼룩이있는 경우, 관류 유량이 잘못 설정되었거나 (너무 낮음) 포털 ...

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Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

이 프로토콜은 특수 정맥 내 카테터, 표준화 된 멸균 일회용 튜브, 실시간 모니터링으로 보완 된 온도 제어 및 분리 된 일차 쥐 간세포의 생존력, 수율 및 기능의 일관성을 향상시키기 위해 두 단계 콜라게나제 관류 절차를위한 경보 시스템의 사용을 자세히 설명합니다.

다중 파라미터 관류 조절을 통한 원발성 쥐 간세포의 분리

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...

이러한 래트 간세포 분리 프로토콜은 소화 접근법 이전의 간 절제술에 기초한다. 이 프로토콜은 세포 분리를 위한 콤팩트하고 휴대용 통합 관류 시스템을 도입합니다. 이 기술은 콜라게나제 재순환을 수반하여 콜라게나제 사용의 부피를 줄이고 높은 중력 수율과 간세포 특이적 기능을 보장하면서 소화 시간을 연장하는 데 더 많은 유연성을 제공합니다.쥐를 후드에 넣으십시오. 복부 근육을 절단 한 후 구부러진 집게의 뒤쪽으로 창자를 오른쪽으로 밀어 넣으십시오. 담관 아래의 막을 구부러진 포셉의 끝으로 부수어 포털 정맥과 담관 주위의 봉합사를 반복하십시오.실크 외과 봉합사를 사용하여 정맥이 좌우로 다른 간 엽으로 들어가기 직전에 간에서 가까운 포털 정맥 주위에 매우 느슨한 합자를 만드십시오. 위 정맥이 포털 정맥에서 분기하기 직전에 첫 번째 합자의 상류에서 약 두 세 센티미터 떨어진 곳에 두 쌍의 곡선 포셉 팁이있는 포털 정맥 아래의 조직을 통해 구멍을 만듭니다. 그런 다음 구멍을 뻗어 캐뉼레이션 중에 포털 정맥을지지하십시오.분당 약 세 밀리리터의 유속으로 펌프 속도를 네 RPM으로 줄임으로써 간에서 압력 축적을 방지합니다. 정맥내 카테터로부터의 칼슘 프리 버퍼의 유출이 느린 드립으로 감소되도록 보장한다. 포셉으로 문맥 정맥을지지하면서 바늘의 경사가 위를 향하게하여 정맥 내 카테터를 잡으십시오.바늘을 10 내지 20도 각도로 포털 정맥에 삽입한다. 그런 다음 전체 경사가 정맥 안에있을 때까지 천천히 진행하십시오. 올바른 삽입은 간 색의 블랜칭을 초래해야합니다.캐뉼라를 바늘 위로 전진시키고 엄지와 가운데 손가락으로 카테터를 잡고있는 동안 검지 손가락으로 날개를 뒤로 당겨 캐뉼라 뒤의 바늘을 수축시킵니다. 정맥 클립으로 포털 정맥을 카테터에 고정시키고 포털 정맥 아래에 클립하여 흐름 중단을 방지하십시오. 다음으로, 간에서 압력이 축적되는 것을 막기 위해 infrahepatic 열등한 정맥 카바를 자르고 올바른 절단을 보장하기 위해 혈액 박차를 가하는 충동을 관찰하십시오.분당 약 33밀리리터의 유량에 대해 펌프 속도를 38RPM으로 높입니다. 그리고 두세 초 동안 포셉으로 infrahepatic 열등한 정맥 카바를 닫은 다음 다시 열어 간을 세 번 씻어냅니다. 모든 간 엽을 관류하려면 캐뉼라 팁의 위치를 조정하고 포털 정맥이 다른 간 엽으로 분기하기 전에 배치되었는지 확인하십시오.그런 다음 분기점의 약간 상류에있는 포털 정맥 주위의 느슨한 합자를 조이고 경질 바늘이 캐뉼라를지지하는 지점, 베벨과 측면 구멍 사이의 세 매듭을 만들어 버퍼의 역류를 방지하기 위해 포털 정맥에서 캐뉼라의 위치를 고정하십시오. 간 절제술 후 간이 12 분 동안 칼슘이없는 완충액으로 관류하도록하십시오. 그런 다음 칼슘이없는 버퍼의 롤러 클램프를 조이고 콜라게나제 버퍼의 롤러 클램프를 풀어 관류 버퍼를 변경하십시오.콜라게나제 완충액이 간에 도달한 후, 초라게파틱 열등한 베나 카바를 두세 초 동안 닫고 다시 열어 간을 세 번 플러시합니다. 카테터를지지하면서 포셉으로 횡격막을 잡고 콜라게나제 버퍼의 재순환을 위해 비커의 상단에있는 무대로 간을 조심스럽게 옮기고 카테터를 당기지 않도록주의하여 우발적 인 박리를 방지하십시오. 간을 12 분 동안 소화하고 간이 부드러운 갈색 질감을 잃고 근육질이 될 때 관류를 중단하십시오.필요한 경우 소화 시간을 연장하십시오. 간장의 소화 후 포털 정맥을 조심스럽게 잘라 캐뉼라를 제거하십시오. 그런 다음 간을 차가운 DMEM으로 옮겨 간세포를 분리합니다.구부러진 포셉의 뒷면을 사용하여 간을 부드럽게 두드려 반짝이는 캡슐을 부수고 벗겨냅니다. 세포가 배지에서 완전히 해리될 때까지 DMEM에서 간을 부드럽게 흔들어 간 세포를 방출한다. 간세포의 생존율은 트립과 블루 카운팅에 의해 결정된 바와 같이 88 내지 94.8% 사이였다.체중이 200 내지 300 그램인 래트로부터의 간세포의 수율은 단리당 10 내지 여덟 번째 세포의 다섯 배에 달하였다. 대표적인 이미지는 정제되지 않은 간세포 현탁액과 정제된 간세포 현탁액을 보여준다. 분리된 간세포의 순도는 약 96.8%였으며, 이는 세포핵의 총 수와 관련하여 알부민 양성 형광 염색된 세포를 계수하여 정량하였다.오색으로 표시된 대표적인 이미지에서, 녹색은 알부민을 나타내고, 파란색은 알부민이 있는 세포핵을 나타낸다. 알부민이없는 세포 핵은 빨간색으로 강조 표시됩니다. 샌드위치 배양물에서 간세포는 뚜렷한 담즙 canaliculi를 형성하고, 좋은 세포 세포 접촉을 가졌다.알부민, 우레아 및 시토크롬 P450 분석법에 의해 나타난 바와 같이, 간세포는 높은 우레아 및 알부민 분비를 나타내었다. 셋째 날에, 간세포는 CYP1A2, CYP2B1/2 및 CYP3B2에 대해 높은 효소 활성을 나타내었다. 포털 정맥에 바늘을 삽입하기 전에 정신적으로 준비하십시오.삽입시 외과 의사는 IVC를 절단 한 후 펌프 속도가 증가 할 때까지 펄스없이 계속해야합니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

성인 쥐 심장 Myocytes의 차 문화

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

연구

생물학

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

쥐 포탈 섬유아 세포의 분리에 의한<em&gt; 현장에서</em&gt; 간 재관류

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

쥐 간장 세포의 분리 및 차 문화

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

일차 종양에서 면역 세포의 분리

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells

덕트 세포를 수집 배양 차 쥐 내부 수질

Arginine-vasopressin (AVP) facilitates water reabsorption by renal collecting duct principal cells and thereby fine-tunes body water homeostasis. AVP ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

마우스 기본 췌장 포상 세포의 분리 및 문화

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

2 단계 콜라게나 제 관류 절차에 의한 인간의 간세포의 분리

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

분리 및 마우스 대동맥 내피 세포의 차 문화

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

마우스 차 간세포에서 지방산 산화 및 지방 생성의 결정

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

차 인간 간세포의 분리 및 비 실질 간 세포의 주요 집단 대응을위한 프로토콜

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...