Name: isolation of primary rat hepatocytes with multiparameter perfusion control
Uploaded: 2021-04-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control at JoVE.com

Dette arbeidet støttes delvis av MOE ARC (MOE2017-T2-1-149); NUHS Innovation Seed Grant 2017 (NUHSRO/2017/051/InnovSeed/02); Mekanobiology Institute of Singapore (R-714-106-004-135); og Institutt for bioingeniør og nanoteknologi, Biomedisinsk forskningsråd, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR) (Prosjektnummer IAF-PP H18/01/a0/014, IAF-PP H18/01/a0/K14 og MedCaP-LOA-18-02) finansiering til Hanry Yu. Ng Chan Way er forsker ved National University of Singapore. Vi vil takke Confocal Microscopy Unit &Flow Cytometry Unit ved National University of Singapore for hjelp og råd i hepatocyte renhetsanalyse.

Alle prosedyrer og dyrehus ble utført under protokollnummer R15-0027 og R19-0669 i samsvar med kravene i Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved National University of Singapore.
1. Utarbeidelse av løsninger og kirurgiske instrumenter
<ol><li>Klargjør buffere og cellekulturmedier i tabell 1 ved hjelp av ultrarent vann.</li>
	<li>Forvarm den kalsiumfrie bufferen og kollagenalensbufferen til 37 °C i et vannbad før bruk.</li>
	<li>Autoklaver følgende kirur...

<ol>
	<li>Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. H., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+rat+hepatic+cells.">Isolation and primary culture of rat hepatic cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).</li><li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion.">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).</li><li>Green, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+primary+hepatocytes+from+human+tissue:+optimising+the+use+of+small+non-encapsulated+liver+resection+surplus.">The isolation of primary hepatocytes from human tissue: optimising the use of small non-encapsulated liver resection surplus.</a> Cell and Tissue Banking. 18 (4), 597-604 (2017).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).</li><li>Gopalakrishnan, S., Harris, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+liver+endocytosis+followed+by+purification+of+liver+cells+by+liver+perfusion.">In vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3138 (2011).</li><li>Wen, J. W., Olsen, A. L., Perepelyuk, M., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+rat+portal+fibroblasts+by+in+situ+liver+perfusion.">Isolation of rat portal fibroblasts by in situ liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3669 (2012).</li><li>Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+3D+collagen+sandwich+culture+of+primary+mouse+hepatocytes+to+study+the+role+of+cytoskeleton+in+bile+canalicular+formation+in+vitro.">Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60501 (2019).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+purification+of+immune+cells+from+the+liver.">Isolation and purification of immune cells from the liver.</a> International Immunopharmacology. 85 (95), 106632 (2020).</li><li>Salem, E. S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+mouse+hepatocytes+for+nascent+protein+synthesis+analysis+by+non-radioactive+L-azidohomoalanine+labeling+method.">Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive L-azidohomoalanine labeling method.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323 (2018).</li><li>Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethered+spheroids+as+an+in+vitro+hepatocyte+model+for+drug+safety+screening.">Tethered spheroids as an in vitro hepatocyte model for drug safety screening.</a> Biomaterials. 33 (7), 2165-2176 (2012).</li><li>Kegel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+isolation+of+primary+human+hepatocytes+and+corresponding+major+populations+of+non-parenchymal+liver+cells.">Protocol for isolation of primary human hepatocytes and corresponding major populations of non-parenchymal liver cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53069 (2016).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vertical-flow+bioreactor+array+compacts+hepatocytes+for+enhanced+polarity+and+functions.">A vertical-flow bioreactor array compacts hepatocytes for enhanced polarity and functions.</a> Lab on a Chip. 16 (20), 3898-3908 (2016).</li><li>Du, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+sandwich+culture+of+3D+hepatocyte+monolayer.">Synthetic sandwich culture of 3D hepatocyte monolayer.</a> Biomaterials. 29 (3), 290-301 (2008).</li><li>Tong, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constrained+spheroids+for+prolonged+hepatocyte+culture.">Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture.</a> Biomaterials. 80, 106-120 (2016).</li><li>Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar-flow+immediate-overlay+hepatocyte+sandwich+perfusion+system+for+drug+hepatotoxicity+testing.">Laminar-flow immediate-overlay hepatocyte sandwich perfusion system for drug hepatotoxicity testing.</a> Biomaterials. 30 (30), 5927-5936 (2009).</li><li>Gupta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+canaliculi+contract+autonomously+by+releasing+calcium+into+hepatocytes+via+mechanosensitive+calcium+channel.">Bile canaliculi contract autonomously by releasing calcium into hepatocytes via mechanosensitive calcium channel.</a> Biomaterials. 259, 120283 (2020).</li><li>Horner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Percoll+purification+on+isolation+of+primary+human+hepatocytes.">Impact of Percoll purification on isolation of primary human hepatocytes.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6542 (2019).</li><li>Osypiw, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpopulations+of+rat+hepatocytes+separated+by+Percoll+density-gradient+centrifugation+show+characteristics+consistent+with+different+acinar+locations.">Subpopulations of rat hepatocytes separated by Percoll density-gradient centrifugation show characteristics consistent with different acinar locations.</a> The Biochemical Journal. 304, 617-624 (1994).</li><li>Beal, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+animal+model+of+ex+vivo+normothermic+liver+perfusion.">A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541 (2018).</li><li>Hillebrandt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedure+for+decellularization+of+rat+livers+in+an+oscillating-pressure+perfusion+device.">Procedure for decellularization of rat livers in an oscillating-pressure perfusion device.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), e53029 (2015).</li></ol>

Det er noen få punkter som er spesielt viktige å observere for to-trinns kollagenalusperfusjonsprosedyre generelt. For det første må spesiell forsiktighet gis når du resecting leveren. Forsikre deg om at mage-tarmkanalen ikke er skadet, da lekkasje av innholdet vil føre til bakteriell forurensning. I tillegg, unngå å skade Glissons kapsel, som dekker overflaten av leveren under dyreprosedyren. Hvis tåren er stor nok, kan det tillate for tidlig frigjøring av disassosierte hepatocytter i kollagenalissebufferen. F...

Primære hepatocytter er viktige verktøy for leverrelatert grunnforskning, sykdomsbehandling og anvendelse som legemiddeltesting. Den nåværende gullstandarden for primær hepatocytisolasjon er den to-trinns kollagenære perfusjonsprosedyren 1,2,3 introdusert av Seglen på 1970-tallet4. Imidlertid er denne prosedyren teknisk utfordrende og har en høy feilfrekvens når den utføres av nybegynnere kirurger. Selv når en perfusjon anses som vellykket, kan drastiske forskjeller i hepatocytt levedyktighet (vanligvis 60% -95%) og utbytte (0,5-5 x 108 per 200-300 g rotte) observeres mellom isolasjoner. Dette påvirker kvaliteten og omfanget av nedstrømseksperimenter. Bortsett fra den tekniske prosedyren, er perfusjonsoppsettet som brukes til isolasjonen, enten kommersielt tilgjengelig eller spesialbygget, en medvirkende faktor. Det må tas hensyn til montering, optimalisering og vedlikehold av perfusjonsoppsettet. Formålet med denne protokollen er å forbedre suksessraten og stabiliteten mellom isolasjoner av primærrotter hepatocytter gjennom multiparameterperfusjonskontroll av den tekniske prosedyren og perfusjonsoppsettet for totrinns kollagenalusperfusjonsprosedyren.
Fra det tekniske aspektet er det vanskeligste trinnet i prosedyren portalvenekannasjonen. Når det gjelder de andre trinnene, hvis god praksis overholdes og generelle forholdsregler tas, kan isolasjonens stabilitet forbedres. Derfor er forståelse av resonnementet for hvert trinn viktig slik at kirurgen kan reagere på ulike variabler som kan oppstå under prosedyren.
Ulike protokoller for isolering av hepatocytter og lever ikke-parenchymale celler fra rotte og mus har blitt publisert 1,2,5,6,7,8,9. Perfusjonsoppsettene som ble brukt i disse protokollene hadde flere ulemper, som inkluderer gjenbruk av perfusjonsrør, problemer med temperaturkontroll, behov for rutinemessig optimalisering av perfusjonsparametere og / eller bruk av uegnet type intravenøst (IV) kateter for portalvennekannasjon. Gjenbruk av perfusjonsrør vil øke sjansene for forurensning, spesielt hvis slangen ikke ble rengjort og desinfisert riktig. Gjenbruk av rør uten rutinemessig utskifting vil også utsette perfusjonsoppsettet for problemer som lekkende rør eller kontakter, tilstoppet boblefelle og innsnevret rør, som alle vil redusere perfusattrykket og strømningshastigheten betydelig, og dermed påvirke leverfordøyelighetseffektiviteten. Uten en konstant varmekilde i noen oppsett for temperaturkontroll, vil forhåndsvarmede buffere avkjøles over tid, noe som fører til lav kollagenaktivitet og fordøyelse. Selv om andre oppsett bruker en jakket glasskondensator koblet til en vannsirkulasjon for å varme bufferen, er de store og krever forsiktig rengjøring. Temperatur, trykk og strømningshastighet for buffer som går ut av kateteret må måles og optimaliseres før starten av isolasjonen for å sikre stabil perfusjonstilstand. Selv etter optimalisering kan parametrene fortsatt endres halvveis under isolasjon på grunn av operatørens handlinger, og dermed føre til suboptimal perfusjon og fordøyelse. De fleste typer IV kateter er ikke egnet for portal vene kannasjon fordi de ikke tillater kontinuerlig perfusjon under kannasjon. De er ikke i stand til umiddelbart å informere kirurgen når kannasjonen er vellykket. Videre er det utfordrende å sikre portalvenen på det myke kateteret uten å deformere det.
Her løser vi disse problemene ved hjelp av standardiserte sterile rør til engangsbruk, en silikonvarmerjakke for presis og stabil temperaturkontroll, sanntidsovervåking og alarmsystem med datalagring og styring og bruk av et spesielt IV-kateter, som tillater kontinuerlig perfusjon mens du punkterer portalvenen under kanalisering. Så vidt vi vet, er vi den første gruppen som kombinerer alle disse funksjonene i et integrert perfusjonssystem (IPS) som er kompakt, noe som gjør det svært bærbart og i stand til å passe inn i en laminær strømningshette for å sikre aseptisk drift.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Nipro</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>Nipro</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black braided silk non-absorbable, non-sterile surgical suture</td>
			<td>Look</td>
			<td>SP117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bochem 18/10 stainless steel forceps, sharp tip contain bent round tip</td>
			<td>Bochem</td>
			<td>10333511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Perfusion Set</td>
			<td>Vasinfuse</td>
			<td>BPF-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floating circular 1.5 mL microcentrifuge tube rack</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>German Standard Tissue Forceps, Serrated / 1&#215;2 teeth , 14.5cm</td>
			<td>Walentech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Cellstar aspirating pipette</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GN710183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrated Perfusion System</td>
			<td>Vasinfuse</td>
			<td>IPS-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors curved, stainless, 11cm</td>
			<td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td>
			<td>CVD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope with 10X lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh Sheet 100&#181;M Nylon</td>
			<td>Spectra-Teknic(s) Pte Ltd</td>
			<td>06630-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors, BL/BL, 13cm</td>
			<td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td>
			<td>STR &#8211; BL/BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors, SH/BL, 13cm</td>
			<td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td>
			<td>STR &#8211; SH/BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse force hemostatic clip</td>
			<td>Shanghai Jin Zhong Pte Ltd</td>
			<td>XEC230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents/Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>137101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17104019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>TCI</td>
			<td>D1961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31600-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11344-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1-9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC26764.298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type I bovine collagen</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>William&#8217;s E Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W1878</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary rat hepatocytes with multiparameter perfusion control

Primære hepatocytter er mye brukt i grunnleggende forskning på leversykdommer og for toksisitetstesting in vitro. Den to-trinns kollagennasperfusjonsprosedyren for primær hepatocytisolasjon er teknisk utfordrende, spesielt i portal venekannasjon. Prosedyren er også utsatt for sporadisk forurensning og variasjoner i perfusjonsforhold på grunn av vanskeligheter med montering, optimalisering eller vedlikehold av perfusjonsoppsettet. Her presenteres en detaljert protokoll for en forbedret to-trinns kollagenalenperfusjonsprosedyre med multiparameterperfusjonskontroll. Primær rottehpopatocytter ble vellykket og pålitelig isolert ved å ta de nødvendige tekniske forholdsreglene ved kritiske trinn i prosedyren, og ved å redusere driftsvansker og redusere variasjonen av perfusjonsparametere gjennom vedtakelse av et spesielt intravenøst kateter, standardisert steril engangsrør, temperaturkontroll og sanntidsovervåking og alarmsystem. De isolerte primærrottene hepatocytter viser konsekvent høy celle levedyktighet (85% -95%), utbytte (2-5 x 108 celler per 200-300 g rotte) og funksjonalitet (albumin, urea og CYP aktivitet). Prosedyren ble supplert med et integrert perfusjonssystem, som er kompakt nok til å settes opp i laminær strømningshette for å sikre aseptisk drift.

En kirurg kan fortelle om leverperfusjon skjer jevnt ved å observere utfallet etter visse trinn. Det første utfallet kan observeres ved kannasjon, kutting av infrahepatisk IVC og gjenoppretting av perfusjonsstrømningshastigheten. Leveren skal ha endret farge helt fra mørk rød til brun, samtidig som volumet opprettholdes. Hvis leveren ser litt deflatert ut og har en rødaktig fargetone eller flekker av rødt, betyr det at perfusjonsstrømmen ble satt feil (for lav), eller portalvenen ble ikke kanylert riktig. Hvis le...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control at JoVE.com

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Denne protokollen beskriver bruken av et spesielt intravenøst kateter, standardisert steril engangsrør, temperaturkontroll supplert med sanntidsovervåking og et alarmsystem for to-trinns kollagennaseperfusjonsprosedyre for å forbedre konsistensen i levedyktigheten, utbyttet og funksjonaliteten til isolerte primærrottehedopatocytter.

Isolering av primær rotte hepatocytter med multiparameter perfusjonskontroll

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...

Denne rotten hepatocytes isolasjon protokollen er basert på leveren reseksjon før fordøyelsen tilnærming. Protokollen introduserer et kompakt og bærbart integrert perfusjonssystem for celleisolering. Denne teknikken innebærer kollagenaseresirkulasjon som reduserer volumet av kollagenalissebruk, og gir mer fleksibilitet i forlengelsen av fordøyelsestiden samtidig som den sikrer høyt tyngdekraftsutbytte og hepatocytter spesifikk funksjon.Sett rotten i panseret. Etter å ha kuttet magemusklene, skyv tarmene til høyre med baksiden av de buede tangene. Bryt membranen under gallekanalen med spissen av de buede tangene for å sløyfe suturen rundt portalvenen og gallekanalen.Bruk en silke kirurgisk sutur for å lage en veldig løs ligatur rundt portalvenen nær leveren, like før venen grener venstre og høyre inn i forskjellige leverlober. Omtrent to til tre centimeter oppstrøms for den første ligaturen, like før magevenen forgrener seg fra portalvenen, lag et hull gjennom vevet under portalvenen med spissene på to par buede tang. Strekk deretter hullet for å støtte portalvenen under kannasjon.Forhindre trykkoppbygging i leveren ved å redusere pumpehastigheten til fire RPM for en strømningshastighet på omtrent tre milliliter per minutt. Og sørg for at utstrømningen av kalsiumfri buffer fra det intravenøse kateteret reduseres til et sakte drypp. Mens du forsiktig støtter portalvenen med tang, hold det intravenøse kateteret med nålens skråkant vendt opp.Og sett nålen inn i portalvenen i en 10 til 20 graders vinkel. Deretter sakte frem til hele skråkanten er inne i venen. Riktig innsetting bør resultere i blanchering av leverfargen.Før kanylen over nålen, og trekk nålen bak kanylen tilbake ved å trekke tilbake vingen med pekefingeren mens du holder kateteret med tommelen og langfingeren. Fest portalvenen på kateteret med en veneklemme og klips under portalvenen for å unngå gjennomgripende strømningsforstyrrelser. Deretter kutter du den infrahepatiske dårligere vena cava for å forhindre trykkoppbygging i leveren, og observere for blodspurtende impulser for å sikre riktig kutt.Øk pumpehastigheten til 38 RPM for en strømningshastighet på ca. 33 milliliter per minutt. Og skyll leveren tre ganger ved å lukke den infrahepatiske dårligere vena cava med tang i to til tre sekunder, og deretter gjenåpne den. For å parfyme alle leverlober, juster plasseringen av kanylespissen og sørg for at den er plassert før portalvenen forgrener seg i forskjellige leverlober.Stram deretter den løse ligaturen rundt portalvenen, litt oppstrøms forgreningspunktet, og fest kanylens posisjon i portalvenen for å forhindre tilbakestrømning av bufferen ved å lage tre knop på det punktet hvor den harde nålen støtter kanylen, mellom skråkanten og sidehullet. Etter leverreseksjon la leveren parfymere med kalsiumfri buffer i 12 minutter. Stram deretter rulleklemmen til kalsiumfri buffer og løsne rulleklemmen til kollagenalissebufferen for å endre perfusjonsbufferen.Etter at kollagenasebufferen når leveren, skyll leveren tre ganger ved å lukke den suprahepatic dårligere vena cava i to til tre sekunder og åpne den på nytt. Beveg leveren forsiktig til scenen på toppen av begeret for resirkulering av kollagensbufferen ved å holde membranen med tang mens du støtter kateteret, pass på at du ikke trekker kateteret for å forhindre utilsiktet løsrivelse. Fordøye leveren i 12 minutter, og stopp perfusjonen når leveren mister sin glatte brune tekstur og blir grøtaktig.Forlenge fordøyelsestiden om nødvendig. Etter fordøyelsen av leveren kuttet portalvenen forsiktig fjerne kanylen. Og overfør deretter leveren til kald DMEM for å isolere hepatocyttene.Trykk forsiktig på leveren ved hjelp av baksiden av de buede tangene for å bryte og skrelle av glinskapselen. Og slipp levercellene ved å forsiktig svinge leveren i DMEM til cellene er helt dissosiert i media. Levedyktigheten til hepatocytter var mellom 88 og 94,8% som bestemt av tur og blå telling.Utbyttet av hepatocytter fra rotter som veide 200 til 300 gram var opptil fem ganger 10 til de åttende cellene per isolasjon. De representative bildene viser uoppgjort levercelle suspensjon og renset hepatocyt suspensjon. Renheten til de isolerte hepatocyttene var ca. 96,8%, som ble kvantifisert ved å telle albumin positive fluorescerende fargede celler i forhold til det totale antallet cellekjerner.I de representative bildene som vises i falsk farge, representerer grønt albuminet, og blått angir cellekjernene med albumin. Cellekjerner uten albumin er uthevet rødt. Hepatocyttene i sandwichkulturen dannet distinkt galle canaliculi, og hadde god cellecellekontakt.Som vist av albumin, urea og cytokrom P450-analyser, viste hepatocyttene høy urea og albuminsekresjon. På dag tre viste hepatocyttene høye enzymaktiviteter for CYP1A2, CYP2B1/2 og CYP3B2. Vær mentalt forberedt før du setter nålen inn i portalvenen.Ved innsetting må en kirurg fortsette uten puls til pumpehastigheten ble økt etter kutting av IVC.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Isolering av Rat Portal Fibroblaster av<em&gt; In situ</em&gt; Liver Perfusjons

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolering og Primær kultur Rat Nedsatt Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells

Dyrking Primær Rat Indre Medullary Samle Duct Cells

Arginine-vasopressin (AVP) facilitates water reabsorption by renal collecting duct principal cells and thereby fine-tunes body water homeostasis. AVP ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolasjon og kultur av mus Primær acinøse Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

Isolering av humane hepatocytter av en to-trinns Collage Perfusjons Prosedyre

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolasjon og Primær Culture of Mouse endotelceller fra aorta

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Bestemmelse av fettsyreoksidasjon og lipogenese i Mouse primære hepatocytter

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Protokoll for isolering av Primære humane hepatocytter og tilsvarende store Bestander av ikke-parenkymatøs leverceller

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...