Name: isolation of primary rat hepatocytes with multiparameter perfusion control
Uploaded: 2021-04-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control at JoVE.com

Este trabalho é apoiado em parte pelo MOE ARC (MOE2017-T2-1-149); NuHS Innovation Seed Grant 2017 (NUHSRO/2017/051/InnovSeed/02); Instituto de Mecanobiologia de Cingapura (R-714-106-004-135); e Instituto de Bioengenharia e Nanotecnologia, Conselho de Pesquisa Biomédica, Agência de Ciência, Tecnologia e Pesquisa (A*STAR) (Projeto Números IAF-PP H18/01/a0/014, IAF-PP H18/01/a0/K14 e MedCaP-LOA-18-02) para Hanry Yu. Ng Chan Way é um pesquisador da Universidade Nacional de Singapura. Gostaríamos de agradecer à Unidade de Microscopia Confocal & Unidade de Citometria de Fluxo da Universidade Nacional de Cingapura por ajuda e aconselhamento na análise da pureza hepatocyte.

Todos os procedimentos e habitação animal foram realizados nos números do protocolo R15-0027 e R19-0669 de acordo com as exigências do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Nacional de Cingapura.
1. Elaboração de soluções e instrumentos cirúrgicos
<ol><li>Prepare buffers e mídia de cultura celular na Tabela 1 usando água ultrapurada.</li>
	<li>Pré-aqueça o tampão sem cálcio e o tampão de colagem até 37 °C em um banho de ...

<ol>
	<li>Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. H., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+rat+hepatic+cells.">Isolation and primary culture of rat hepatic cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).</li><li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion.">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).</li><li>Green, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+primary+hepatocytes+from+human+tissue:+optimising+the+use+of+small+non-encapsulated+liver+resection+surplus.">The isolation of primary hepatocytes from human tissue: optimising the use of small non-encapsulated liver resection surplus.</a> Cell and Tissue Banking. 18 (4), 597-604 (2017).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).</li><li>Gopalakrishnan, S., Harris, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+liver+endocytosis+followed+by+purification+of+liver+cells+by+liver+perfusion.">In vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3138 (2011).</li><li>Wen, J. W., Olsen, A. L., Perepelyuk, M., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+rat+portal+fibroblasts+by+in+situ+liver+perfusion.">Isolation of rat portal fibroblasts by in situ liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3669 (2012).</li><li>Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+3D+collagen+sandwich+culture+of+primary+mouse+hepatocytes+to+study+the+role+of+cytoskeleton+in+bile+canalicular+formation+in+vitro.">Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60501 (2019).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+purification+of+immune+cells+from+the+liver.">Isolation and purification of immune cells from the liver.</a> International Immunopharmacology. 85 (95), 106632 (2020).</li><li>Salem, E. S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+mouse+hepatocytes+for+nascent+protein+synthesis+analysis+by+non-radioactive+L-azidohomoalanine+labeling+method.">Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive L-azidohomoalanine labeling method.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323 (2018).</li><li>Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethered+spheroids+as+an+in+vitro+hepatocyte+model+for+drug+safety+screening.">Tethered spheroids as an in vitro hepatocyte model for drug safety screening.</a> Biomaterials. 33 (7), 2165-2176 (2012).</li><li>Kegel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+isolation+of+primary+human+hepatocytes+and+corresponding+major+populations+of+non-parenchymal+liver+cells.">Protocol for isolation of primary human hepatocytes and corresponding major populations of non-parenchymal liver cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53069 (2016).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vertical-flow+bioreactor+array+compacts+hepatocytes+for+enhanced+polarity+and+functions.">A vertical-flow bioreactor array compacts hepatocytes for enhanced polarity and functions.</a> Lab on a Chip. 16 (20), 3898-3908 (2016).</li><li>Du, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+sandwich+culture+of+3D+hepatocyte+monolayer.">Synthetic sandwich culture of 3D hepatocyte monolayer.</a> Biomaterials. 29 (3), 290-301 (2008).</li><li>Tong, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constrained+spheroids+for+prolonged+hepatocyte+culture.">Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture.</a> Biomaterials. 80, 106-120 (2016).</li><li>Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar-flow+immediate-overlay+hepatocyte+sandwich+perfusion+system+for+drug+hepatotoxicity+testing.">Laminar-flow immediate-overlay hepatocyte sandwich perfusion system for drug hepatotoxicity testing.</a> Biomaterials. 30 (30), 5927-5936 (2009).</li><li>Gupta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+canaliculi+contract+autonomously+by+releasing+calcium+into+hepatocytes+via+mechanosensitive+calcium+channel.">Bile canaliculi contract autonomously by releasing calcium into hepatocytes via mechanosensitive calcium channel.</a> Biomaterials. 259, 120283 (2020).</li><li>Horner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Percoll+purification+on+isolation+of+primary+human+hepatocytes.">Impact of Percoll purification on isolation of primary human hepatocytes.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6542 (2019).</li><li>Osypiw, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpopulations+of+rat+hepatocytes+separated+by+Percoll+density-gradient+centrifugation+show+characteristics+consistent+with+different+acinar+locations.">Subpopulations of rat hepatocytes separated by Percoll density-gradient centrifugation show characteristics consistent with different acinar locations.</a> The Biochemical Journal. 304, 617-624 (1994).</li><li>Beal, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+animal+model+of+ex+vivo+normothermic+liver+perfusion.">A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541 (2018).</li><li>Hillebrandt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedure+for+decellularization+of+rat+livers+in+an+oscillating-pressure+perfusion+device.">Procedure for decellularization of rat livers in an oscillating-pressure perfusion device.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), e53029 (2015).</li></ol>

Existem alguns pontos que são particularmente importantes de se observar para o procedimento de coagem de duas etapas em geral. Em primeiro lugar, deve-se dar um cuidado especial ao resseccionar o fígado. Certifique-se de que o trato gastrointestinal não esteja danificado, pois o vazamento do conteúdo resultará em contaminação bacteriana. Além disso, evite danificar a cápsula do Glisson, que cobre a superfície do fígado durante o procedimento animal. Se a lágrima for grande o suficiente, pode permitir a liber...

Hepatócitos primários são ferramentas importantes para pesquisa básica relacionada ao fígado, tratamento de doenças e aplicação, como testes de drogas. O padrão-ouro atual para o isolamento primário do hepatocito é o procedimento de perfusão de colagem de duas etapas 1,2,3 introduzido pela Seglen na década de 19704. No entanto, este procedimento é tecnicamente desafiador e tem uma alta taxa de falha quando realizado por cirurgiões iniciantes. Mesmo quando uma perfusão é considerada bem sucedida, podem ser observadas diferenças drásticas na viabilidade do hepatocito (tipicamente 60%-95%) e rendimento (0,5-5 x 108 por rato de 200-300 g) entre os isolamentos. Isso influencia a qualidade e a escala dos experimentos a jusante. Além do procedimento técnico, a configuração de perfusão utilizada para o isolamento, seja comercialmente disponível ou personalizada, é um fator contribuinte. Deve-se prestar atenção à montagem, otimização e manutenção da configuração da perfusão. O objetivo deste protocolo é melhorar a taxa de sucesso e a estabilidade entre os isolamentos dos hepatócitos primários de ratos através do controle de perfusão multiparmétrica do procedimento técnico e da configuração de perfusão do procedimento de perfusão de colagenase em duas etapas.
Do ponto de vista técnico, o passo mais difícil no procedimento é a cannulação venosa do portal. Quanto às outras etapas, se forem observadas boas práticas e forem tomadas precauções gerais, a estabilidade do isolamento pode ser melhorada. Portanto, a compreensão do raciocínio de cada passo é importante para que o cirurgião possa responder a diversas variáveis que podem ocorrer durante o procedimento.
Vários protocolos para o isolamento de hepatócitos e células não-parenchímicas hepáticas de ratos e camundongos foram publicados 1,2,5,6,7,8,9. As configurações de perfusão utilizadas nesses protocolos apresentaram diversas desvantagens, que incluem o reaproveitamento da tubulação de perfusão, problemas com controle de temperatura, necessidade de otimização rotineira dos parâmetros de perfusão e/ou uso de tipo inadequado de cateter intravenoso (IV) para cannulação venosa portal. O reaproveitamento da tubulação de perfusão aumentará as chances de contaminação, especialmente se a tubulação não foi limpa e desinfetada corretamente. O reaproveitamento de tubos sem substituição de rotina também exporá a configuração de perfusão a problemas como tubos ou conectores com vazamento, armadilha de bolha entupida e tubulação constrito, que reduzirá substancialmente a pressão e a taxa de fluxo perfusadas, afetando assim a eficiência da digestão hepática. Sem uma fonte de calor constante em algumas configurações para controle de temperatura, os buffers pré-aquecidos esfriarão ao longo do tempo, levando a baixa atividade de colagem e digestão. Embora outras configurações utilizem um condensador de vidro com jaqueta conectado a um circulador de água para aquecer o tampão, eles são volumosos e requerem uma limpeza cuidadosa. A temperatura, pressão e taxa de fluxo de tampão que sai do cateter devem ser medidos e otimizados antes do início do isolamento para garantir a condição estável de perfusão. Mesmo após a otimização, os parâmetros ainda podem mudar na metade durante o isolamento devido às ações do operador, levando assim à perfusão e digestão abaixo do tempo. A maioria dos tipos de cateter IV não são adequados para a cannulação venosa portal porque não permitem perfusão contínua durante a cannulação. Eles são incapazes de informar imediatamente o cirurgião quando a cannulação é bem sucedida. Além disso, é desafiador proteger a veia portal no cateter macio sem deformá-la.
Aqui, abordamos esses problemas usando tubos estéreis descartáveis padronizados, uma jaqueta aquecedora de silicone para controle preciso e estável de temperatura, monitoramento e sistema de alarme em tempo real com armazenamento e gerenciamento de dados e uso de um cateter IV especial, que permite perfusão contínua ao perfurar a veia portal durante a cannulação. Pelo que sabemos, somos o primeiro grupo a combinar todos esses recursos em um sistema integrado de perfusão (IPS) compacto, tornando-o altamente portátil e capaz de ser encaixado em um capô de fluxo laminar para garantir a operação asséptica.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Nipro</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>Nipro</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black braided silk non-absorbable, non-sterile surgical suture</td>
			<td>Look</td>
			<td>SP117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bochem 18/10 stainless steel forceps, sharp tip contain bent round tip</td>
			<td>Bochem</td>
			<td>10333511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Perfusion Set</td>
			<td>Vasinfuse</td>
			<td>BPF-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floating circular 1.5 mL microcentrifuge tube rack</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>German Standard Tissue Forceps, Serrated / 1&#215;2 teeth , 14.5cm</td>
			<td>Walentech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Cellstar aspirating pipette</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GN710183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrated Perfusion System</td>
			<td>Vasinfuse</td>
			<td>IPS-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors curved, stainless, 11cm</td>
			<td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td>
			<td>CVD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope with 10X lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh Sheet 100&#181;M Nylon</td>
			<td>Spectra-Teknic(s) Pte Ltd</td>
			<td>06630-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors, BL/BL, 13cm</td>
			<td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td>
			<td>STR &#8211; BL/BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors, SH/BL, 13cm</td>
			<td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td>
			<td>STR &#8211; SH/BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse force hemostatic clip</td>
			<td>Shanghai Jin Zhong Pte Ltd</td>
			<td>XEC230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents/Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>137101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17104019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>TCI</td>
			<td>D1961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31600-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11344-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1-9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC26764.298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type I bovine collagen</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>William&#8217;s E Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W1878</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary rat hepatocytes with multiparameter perfusion control

Hepatócitos primários são amplamente utilizados em pesquisas básicas sobre doenças hepáticas e para testes de toxicidade in vitro. O procedimento de perfusão de colagem de duas etapas para isolamento primário de hepatócitos é tecnicamente desafiador, especialmente na canulação venosa do portal. O procedimento também é propenso a contaminação ocasional e variações nas condições de perfusão devido a dificuldades na montagem, otimização ou manutenção da configuração de perfusão. Aqui, é apresentado um protocolo detalhado para um procedimento de perfusão de colagem de duas etapas melhorado com controle de perfusão multiparmétrica. Os hepatócitos primários foram isolados com sucesso e confiabilidade, tomando as precauções técnicas necessárias em etapas críticas do procedimento, e reduzindo a dificuldade operacional e mitigando a variabilidade dos parâmetros de perfusão através da adoção de um cateter intravenoso especial, tubos descartáveis estéreis padronizados, controle de temperatura e sistema de monitoramento e alarme em tempo real. Os hepatócitos primários isolados exibem consistentemente alta viabilidade celular (85%-95%), rendimento (2-5 x 108 células por rato de 200-300 g) e funcionalidade (atividade albumina, ureia e CYP). O procedimento foi complementado por um sistema integrado de perfusão, compacto o suficiente para ser configurado na coifa de fluxo laminar para garantir o funcionamento asséptico.

Um cirurgião poderia dizer se a perfusão hepática está acontecendo sem problemas observando o resultado após certos passos. O primeiro desfecho pode ser observado após a canulação, corte do IVC infrahético e restauração da vazão de perfusão. O fígado deve ter mudado completamente a cor do vermelho escuro para o marrom, mantendo seu volume. Se o fígado parece ligeiramente deflacionado e tem uma tonalidade avermelhada ou manchas de vermelho, significa que a taxa de fluxo de perfusão foi definida erroneament...

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Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Este protocolo detalha o uso de um cateter intravenoso especial, tubos descartáveis estéreis padronizados, controle de temperatura complementado por monitoramento em tempo real e um sistema de alarme para procedimento de perfusão de colagem em duas etapas para melhorar a consistência na viabilidade, rendimento e funcionalidade de hepatócitos primários isolados.

Isolamento de Hepatócitos Primários de Ratos com Controle de Perfusão Multiparâmetro

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...

Este protocolo de isolamento de hepatócitos de rato é baseado na ressecção hepática antes da abordagem de digestão. O protocolo introduz um sistema de perfusão integrado compacto e portátil para isolamento celular. Esta técnica envolve a recirculação de colagemnase que reduz o volume de uso de colagemnase, e proporciona mais flexibilidade na extensão do tempo de digestão, garantindo alto rendimento de gravidade e função específica de hepatócitos.Coloque o rato no capô. Depois de cortar os músculos abdominais, empurre os intestinos para a direita com a parte de trás dos fórceps curvos. Quebre a membrana sob o ducto biliar com a ponta das fórceps curvas para enrolar a sutura ao redor da veia do portal e do ducto biliar.Use uma sutura cirúrgica de seda para fazer uma ligadura muito solta ao redor da veia portal perto do fígado, pouco antes dos ramos da veia esquerda e direita em diferentes lóbulos do fígado. Cerca de dois a três centímetros a montante da primeira ligadura, pouco antes da veia gástrica se ramificar da veia portal, criar um buraco através do tecido sob a veia do portal com as pontas de dois pares de fórceps curvados. Em seguida, estique o orifício para apoiar a veia do portal durante a cannulação.Evite o acúmulo de pressão no fígado reduzindo a velocidade da bomba para quatro RPM para uma taxa de fluxo de aproximadamente três mililitros por minuto. E certifique-se de que o fluxo do tampão livre de cálcio do cateter intravenoso seja reduzido a um gotejamento lento. Enquanto apoia suavemente a veia portal com fórceps, segure o cateter intravenoso com o bisbilhoteiro da agulha virado para cima.E insira a agulha na veia portal em um ângulo de 10 a 20 graus. Em seguida, avance lentamente até que todo o bisel esteja dentro da veia. A inserção correta deve resultar em branqueamento da cor hepática.Avance a cânula sobre a agulha, e retraia a agulha atrás da cânula puxando para trás a asa com o dedo indicador enquanto segura o cateter com o polegar e o dedo médio. Fixar a veia do portal no cateter com um grampo de veia e clipe abaixo da veia do portal para evitar interrupções de fluxo perfusante. Em seguida, corte a veia cava inferior infrahóptica para evitar o acúmulo de pressão no fígado, e observe impulsos de esguicho sanguíneo para garantir o corte correto.Aumente a velocidade da bomba para 38 RPM para uma vazão de aproximadamente 33 mililitros por minuto. E lave o fígado três vezes fechando a veia cava inferior infraháptica com fórceps por dois a três segundos, e depois reabrindo-o. A fim de perfundir todos os lóbulos do fígado, ajuste a posição da ponta da cânula e certifique-se de que ela seja colocada antes que a veia do portal se espeúda em diferentes lóbulos do fígado.Em seguida, aperte a ligadura solta ao redor da veia portal, ligeiramente a montante do ponto de ramificação, e fixe a posição da cânula na veia portal para evitar o backflow do buffer fazendo três nós no ponto onde a agulha dura suporta a cânula, entre o chanfrado e o orifício lateral. Após a ressecção hepática, permita que o fígado peruse com o tampão livre de cálcio por 12 minutos. Em seguida, aperte o grampo do tampão livre de cálcio e solte o grampo do rolo do tampão de colagem para alterar o tampão de perfusão.Depois que o tampão de colagem chega ao fígado, lave o fígado três vezes fechando a veia cava inferior suprahepática por dois a três segundos e reabrindo-o. Mova cuidadosamente o fígado para o palco em cima do béquer para recirculação do tampão de colagenase segurando o diafragma com fórceps enquanto apoia o cateter, tomando cuidado para não puxar o cateter para evitar o descolamento acidental. Digerir o fígado por 12 minutos, e parar a perfusão quando o fígado perde sua textura marrom lisa e fica mole.Estenda o tempo de digestão, se necessário. Após a digestão do fígado cortar a veia portal cuidadosamente remover a cânula. E então transfira o fígado para dMEM frio para isolar os hepatócitos.Bata suavemente o fígado usando a parte de trás das fórceps curvas para quebrar e descascar a cápsula de brilho. E libere as células hepáticas balançando suavemente o fígado no DMEM até que as células estejam totalmente dissociadas na mídia. A viabilidade dos hepatócitos foi entre 88 a 94,8%, conforme determinado pela viagem e pela contagem azul.O rendimento de hepatócitos de ratos pesando de 200 a 300 gramas foi de até cinco vezes 10 para as oitavas células por isolamento. As imagens representativas mostram suspensão não purificada de células hepáticas e suspensão de hepatocitado purificada. A pureza dos hepatócitos isolados foi de aproximadamente 96,8%, quantificada pela contagem de albuminas positivas fluorescentes em relação ao número total dos núcleos celulares.Nas imagens representativas mostradas em cores falsas, o verde representa a albumina, e o azul indica os núcleos celulares com albumina. Núcleos celulares sem albumina são destacados em vermelho. Os hepatócitos na cultura sanduíche formaram canais biliais distintos, e tiveram um bom contato celular.Como mostrado pelos ensaios albumina, ureia e citocromo P450, os hepatócitos exibiam alta ureia e secreção de albumina. No terceiro dia, os hepatócitos apresentaram altas atividades enzimáticas para CYP1A2, CYP2B1/2 e CYP3B2. Esteja preparado mentalmente antes de inserir a agulha na veia do portal.Após a inserção, um cirurgião precisará continuar sem pulso até que a velocidade da bomba seja aumentada após o corte do IVC.

Research

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Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Isolamento de células imunes de tumores primários

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells

Cultura primária Rat coletor medular interno células dos ductos

Arginine-vasopressin (AVP) facilitates water reabsorption by renal collecting duct principal cells and thereby fine-tunes body water homeostasis. AVP ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolamento e Cultura do mouse primárias células pancreáticas acinares

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

Isolamento de hepatócitos humanos por duas etapas Collagenase Perfusão Procedimento

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolamento e cultura primária de células de camundongo aórtica endoteliais

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Determinação da oxidação de ácidos gordos e Lipogênese em Rato Os hepatócitos primária

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Protocolo para o isolamento de hepatócitos humanos primários e Correspondente principais populações de células do fígado não-parenquimatosas

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...