Name: isolation of primary rat hepatocytes with multiparameter perfusion control
Uploaded: 2021-04-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control at JoVE.com

Эта работа частично поддерживается MOE ARC (MOE2017-T2-1-149); Грант NUHS innovation Seed Grant 2017 (NUHSRO/2017/051/InnovSeed/02); Институт механобиологии Сингапура (R-714-106-004-135); и Институт биоинженерии и нанотехнологий, Совет по биомедицинским исследованиям, Агентство по науке, технологиям и исследованиям (A*STAR) (номера проектов IAF-PP H18/01/a0/014, IAF-PP H18/01/a0/K14 и MedCaP-LOA-18-02) финансируют Hanry Yu. Нг Чан Уэй является научным сотрудником Национального университета Сингапура. Мы хотели бы поблагодарить Confocal Microscopy Unit & Flow Cytometry Unit Национального университета Сингапура за помощь и советы в анализе чистоты гепатоцитов.

Все процедуры и содержание животных проводились по протокольным номерам R15-0027 и R19-0669 в соответствии с требованиями Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC) Национального университета Сингапура.
1. Приготовление растворов и хирургических инстру...

<ol>
	<li>Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. H., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+rat+hepatic+cells.">Isolation and primary culture of rat hepatic cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).</li><li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion.">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).</li><li>Green, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+primary+hepatocytes+from+human+tissue:+optimising+the+use+of+small+non-encapsulated+liver+resection+surplus.">The isolation of primary hepatocytes from human tissue: optimising the use of small non-encapsulated liver resection surplus.</a> Cell and Tissue Banking. 18 (4), 597-604 (2017).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).</li><li>Gopalakrishnan, S., Harris, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+liver+endocytosis+followed+by+purification+of+liver+cells+by+liver+perfusion.">In vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3138 (2011).</li><li>Wen, J. W., Olsen, A. L., Perepelyuk, M., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+rat+portal+fibroblasts+by+in+situ+liver+perfusion.">Isolation of rat portal fibroblasts by in situ liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3669 (2012).</li><li>Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+3D+collagen+sandwich+culture+of+primary+mouse+hepatocytes+to+study+the+role+of+cytoskeleton+in+bile+canalicular+formation+in+vitro.">Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60501 (2019).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+purification+of+immune+cells+from+the+liver.">Isolation and purification of immune cells from the liver.</a> International Immunopharmacology. 85 (95), 106632 (2020).</li><li>Salem, E. S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+mouse+hepatocytes+for+nascent+protein+synthesis+analysis+by+non-radioactive+L-azidohomoalanine+labeling+method.">Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive L-azidohomoalanine labeling method.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323 (2018).</li><li>Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethered+spheroids+as+an+in+vitro+hepatocyte+model+for+drug+safety+screening.">Tethered spheroids as an in vitro hepatocyte model for drug safety screening.</a> Biomaterials. 33 (7), 2165-2176 (2012).</li><li>Kegel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+isolation+of+primary+human+hepatocytes+and+corresponding+major+populations+of+non-parenchymal+liver+cells.">Protocol for isolation of primary human hepatocytes and corresponding major populations of non-parenchymal liver cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53069 (2016).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vertical-flow+bioreactor+array+compacts+hepatocytes+for+enhanced+polarity+and+functions.">A vertical-flow bioreactor array compacts hepatocytes for enhanced polarity and functions.</a> Lab on a Chip. 16 (20), 3898-3908 (2016).</li><li>Du, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+sandwich+culture+of+3D+hepatocyte+monolayer.">Synthetic sandwich culture of 3D hepatocyte monolayer.</a> Biomaterials. 29 (3), 290-301 (2008).</li><li>Tong, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constrained+spheroids+for+prolonged+hepatocyte+culture.">Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture.</a> Biomaterials. 80, 106-120 (2016).</li><li>Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar-flow+immediate-overlay+hepatocyte+sandwich+perfusion+system+for+drug+hepatotoxicity+testing.">Laminar-flow immediate-overlay hepatocyte sandwich perfusion system for drug hepatotoxicity testing.</a> Biomaterials. 30 (30), 5927-5936 (2009).</li><li>Gupta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+canaliculi+contract+autonomously+by+releasing+calcium+into+hepatocytes+via+mechanosensitive+calcium+channel.">Bile canaliculi contract autonomously by releasing calcium into hepatocytes via mechanosensitive calcium channel.</a> Biomaterials. 259, 120283 (2020).</li><li>Horner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Percoll+purification+on+isolation+of+primary+human+hepatocytes.">Impact of Percoll purification on isolation of primary human hepatocytes.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6542 (2019).</li><li>Osypiw, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpopulations+of+rat+hepatocytes+separated+by+Percoll+density-gradient+centrifugation+show+characteristics+consistent+with+different+acinar+locations.">Subpopulations of rat hepatocytes separated by Percoll density-gradient centrifugation show characteristics consistent with different acinar locations.</a> The Biochemical Journal. 304, 617-624 (1994).</li><li>Beal, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+animal+model+of+ex+vivo+normothermic+liver+perfusion.">A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541 (2018).</li><li>Hillebrandt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedure+for+decellularization+of+rat+livers+in+an+oscillating-pressure+perfusion+device.">Procedure for decellularization of rat livers in an oscillating-pressure perfusion device.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), e53029 (2015).</li></ol>

Есть несколько моментов, которые особенно важно соблюдать для двухэтапной процедуры перфузии коллагеназы в целом. Во-первых, необходимо соблюдать особую осторожность при резецировании печени. Убедитесь, что желудочно-кишечный тракт не поврежден, так как утечка содержимого приведет к ...

Первичные гепатоциты являются важными инструментами для фундаментальных исследований, связанных с печенью, лечения заболеваний и применения, таких как тестирование на наркотики. В настоящее время золотым стандартом первичной изоляции гепатоцитов является двухэтапная процедура перфузии коллагеназы 1,2,3, введенная Сегленом в 1970-хгодах 4. Тем не менее, эта процедура является технически сложной и имеет высокий уровень неудач при выполнении начинающими хирургами. Даже когда перфузия считается успешной, между выделениями могут наблюдаться резкие различия в жизнеспособности гепатоцитов (обычно 60-95%) и выходе (0,5-5 х 108 на 200-300 г крысы). Это влияет на качество и масштаб последующих экспериментов. Помимо технической процедуры, перфузионная установка, используемая для изоляции, либо коммерчески доступная, либо изготовленная на заказ, является способствующим фактором. Необходимо уделить внимание сборке, оптимизации и обслуживанию перфузионной установки. Целью данного протокола является повышение успешности и стабильности между выделениями первичных гепатоцитов крыс посредством многопараметрического перфузионного контроля технической процедуры и перфузионной установки двухэтапной процедуры перфузии коллагеназы.
С технической точки зрения самым сложным этапом процедуры является канюляция воротной вены. Что касается других шагов, то при соблюдении надлежащей практики и принятии общих мер предосторожности стабильность изоляции может быть улучшена. Поэтому понимание причин для каждого шага важно, чтобы хирург мог реагировать на различные переменные, которые могут возникнуть во время процедуры.
Различные протоколы выделения гепатоцитов и непаренхиматозных клеток печени у крыс и мышей были опубликованы 1,2,5,6,7,8,9. Перфузионные установки, используемые в этих протоколах, имели несколько недостатков, которые включают повторное использование перфузионных трубок, проблемы с контролем температуры, необходимость рутинной оптимизации параметров перфузии и / или использование неподходящего типа внутривенного (IV) катетера для канюляции портальных вен. Повторное использование перфузионных трубок увеличит вероятность загрязнения, особенно если трубки не были очищены и продезинфицированы должным образом. Повторное использование трубок без рутинной замены также подвергнет перфузионную установку таким проблемам, как протекающие трубки или соединители, засорение пузырьковой ловушки и суженные трубки, все из которых значительно снизят давление перфусата и скорость потока, тем самым влияя на эффективность пищеварения печени. Без постоянного источника тепла в некоторых установках для контроля температуры предварительно нагретые буферы со временем будут охлаждаться, что приводит к низкой активности коллагеназы и пищеварению. Хотя в других установках используется стеклянный конденсатор с рубашкой, подключенный к циркуляции воды для нагрева буфера, они громоздкие и требуют тщательной очистки. Температура, давление и расход буфера, выходящего из катетера, должны быть измерены и оптимизированы до начала изоляции, чтобы обеспечить стабильное состояние перфузии. Даже после оптимизации параметры все равно могли меняться на полпути во время изоляции из-за действий оператора, что приводило к неоптимальной перфузии и пищеварению. Большинство типов внутривенных катетеров не подходят для канюляции воротных вен, поскольку не допускают непрерывной перфузии во время канюляции. Они не могут немедленно сообщить хирургу, когда канюляция успешна. Кроме того, трудно закрепить воротную вену на мягком катетере, не деформируя ее.
Здесь мы решаем эти проблемы с помощью стандартизированной одноразовой стерильной трубки, силиконовой рубашки нагревателя для точного и стабильного контроля температуры, системы мониторинга и сигнализации в режиме реального времени с хранением и управлением данными и использованием специального катетера IV, который позволяет непрерывную перфузию при прокалывании воротной вены во время канюляции. Насколько нам известно, мы являемся первой группой, которая объединила все эти функции в компактную интегрированную перфузионную систему (IPS), что делает ее очень портативной и способной помещаться в ламинарный проточный капот для обеспечения асептической работы.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Nipro</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>Nipro</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black braided silk non-absorbable, non-sterile surgical suture</td>
			<td>Look</td>
			<td>SP117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bochem 18/10 stainless steel forceps, sharp tip contain bent round tip</td>
			<td>Bochem</td>
			<td>10333511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Perfusion Set</td>
			<td>Vasinfuse</td>
			<td>BPF-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floating circular 1.5 mL microcentrifuge tube rack</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>German Standard Tissue Forceps, Serrated / 1&#215;2 teeth , 14.5cm</td>
			<td>Walentech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Cellstar aspirating pipette</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GN710183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrated Perfusion System</td>
			<td>Vasinfuse</td>
			<td>IPS-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors curved, stainless, 11cm</td>
			<td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td>
			<td>CVD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope with 10X lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh Sheet 100&#181;M Nylon</td>
			<td>Spectra-Teknic(s) Pte Ltd</td>
			<td>06630-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors, BL/BL, 13cm</td>
			<td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td>
			<td>STR &#8211; BL/BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors, SH/BL, 13cm</td>
			<td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td>
			<td>STR &#8211; SH/BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse force hemostatic clip</td>
			<td>Shanghai Jin Zhong Pte Ltd</td>
			<td>XEC230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents/Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>137101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17104019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>TCI</td>
			<td>D1961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31600-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11344-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1-9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC26764.298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type I bovine collagen</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>William&#8217;s E Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W1878</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary rat hepatocytes with multiparameter perfusion control

Первичные гепатоциты широко используются в фундаментальных исследованиях заболеваний печени и для тестирования токсичности in vitro. Двухэтапная процедура перфузии коллагеназы для первичной изоляции гепатоцитов технически сложна, особенно при канюляции воротных вен. Процедура также подвержена случайным загрязнениям и изменениям условий перфузии из-за трудностей в сборке, оптимизации или обслуживании перфузионной установки. Здесь представлен подробный протокол улучшенной двухэтапной процедуры перфузии коллагеназы с многопараметрическим перфузионным контролем. Первичные гепатоциты крыс были успешно и надежно выделены путем принятия необходимых технических мер предосторожности на критических этапах процедуры, а также путем снижения эксплуатационных трудностей и смягчения изменчивости параметров перфузии путем принятия специального внутривенного катетера, стандартизированной стерильной одноразовой трубки, контроля температуры, а также системы мониторинга и сигнализации в режиме реального времени. Изолированные первичные гепатоциты крысы последовательно демонстрируют высокую жизнеспособность клеток (85%-95%), выход (2-5 х 108 клеток на 200-300 г крысы) и функциональность (альбумин, мочевина и активность CYP). Процедура была дополнена интегрированной перфузионной системой, которая достаточно компактна, чтобы быть установленной в ламинарной вытяжке для обеспечения асептической работы.

Хирург может определить, проходит ли перфузия печени гладко, наблюдая за результатом после определенных шагов. Первый исход можно наблюдать при канюляции, разрезании инфрахепатического ИВК и восстановлении скорости перфузионного потока. Печень должна была полностью изменить цвет с т...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control at JoVE.com

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Этот протокол подробно описывает использование специального внутривенного катетера, стандартизированной стерильной одноразовой трубки, контроля температуры, дополненного мониторингом в режиме реального времени, и системы сигнализации для двухэтапной процедуры перфузии коллагеназы для улучшения согласованности жизнеспособности, выхода и функциональности изолированных первичных гепатоцитов крыс.

Выделение первичных гепатоцитов крыс с помощью многопараметрического перфузионного контроля

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...

Этот протокол выделения гепатоцитов крыс основан на резекции печени до подхода к пищеварению. Протокол представляет компактную и портативную интегрированную перфузионную систему для изоляции клеток. Этот метод включает рециркуляцию коллагеназы, которая уменьшает объем использования коллагеназы и обеспечивает большую гибкость в продлении времени пищеварения, обеспечивая при этом высокий гравитационный выход и специфическую функцию гепатоцитов.Положите крысу в капюшон. После разрезания мышц живота оттолкните кишечник вправо задней частью изогнутых щипцов. Разорвите мембрану под желчным протоком кончиком изогнутых щипцов для закольцовки шва вокруг воротной вены и желчного протока.Используйте шелковый хирургический шов, чтобы сделать очень рыхлую лигатуру вокруг воротной вены близко к печени, непосредственно перед тем, как вена разветвляется влево и вправо в разные доли печени. Примерно в двух-трех сантиметрах вверх по течению от первой лигатуры, непосредственно перед тем, как желудочная вена ответвляется от воротной вены, создают отверстие через ткань под воротной веной с кончиками двух пар изогнутых щипцов. Затем растяните отверстие, чтобы поддержать воротную вену во время канюляции.Предотвратите накопление давления в печени, уменьшив скорость насоса до четырех оборотов в минуту при скорости потока примерно три миллилитра в минуту. И убедитесь, что отток буфера без кальция из внутривенного катетера уменьшается до медленной капельницы. Осторожно поддерживая воротную вену щипцами, удерживайте внутривенный катетер со скосом иглы вверх.И вставьте иглу в воротную вену под углом от 10 до 20 градусов. Затем медленно продвигайтесь до тех пор, пока весь скос не окажется внутри вены. Правильное введение должно привести к бланшированию цвета печени.Переместите канюлю над иглой и втяните иглу за канюлю, оттянув крыло указательным пальцем, удерживая катетер большим и средним пальцем. Закрепите воротную вену на катетере с помощью зажима вены и зажмите под воротной веной, чтобы избежать нарушения перфузирующего потока. Затем отрежьте инфрахепатическую нижнюю полую вену, чтобы предотвратить накопление давления в печени, и наблюдайте за импульсами, брызгающими кровью, чтобы обеспечить правильный разрез.Увеличьте скорость насоса до 38 об/мин при скорости потока около 33 миллилитров в минуту. И промыть печень три раза, закрыв инфрахепатическую нижнюю полую вену щипцами на две-три секунды, а затем вновь открыв ее. Для того чтобы перфузировать все доли печени, отрегулируйте положение кончика канюли и убедитесь, что она размещена перед тем, как воротная вена разветвляется на разные доли печени.Затем затяните свободную лигатуру вокруг воротной вены, немного выше по течению от точки ветвления, и закрепите положение канюли в воротной вене, чтобы предотвратить обратный поток буфера, сделав три узла в точке, где твердая игла поддерживает канюлю, между скосом и боковым отверстием. После резекции печени дайте печени перфузировать с буфером без кальция в течение 12 минут. Затем затяните роликовый зажим буфера без кальция и ослабьте роликовый зажим коллагеназного буфера, чтобы изменить буфер перфузии.После того, как коллагеназный буфер достигнет печени, промывайте печень три раза, закрывая супрахепатическую нижнюю полую вену на две-три секунды и вновь открывая ее. Осторожно переместите печень в стадию поверх стакана для рециркуляции буфера коллагеназы, удерживая диафрагму щипцами, поддерживая катетер, следя за тем, чтобы не тянуть катетер, чтобы предотвратить случайное отслоение. Переваривайте печень в течение 12 минут и прекращайте перфузию, когда печень теряет свою гладкую коричневую текстуру и становится кашицеобразной.При необходимости продлите время пищеварения. После переваривания печени разрезают воротную вену, аккуратно удаляют канюлю. А затем перевести печень в холодный ДМЭМ для выделения гепатоцитов.Осторожно постучите по печени, используя заднюю сторону изогнутых щипцов, чтобы сломать и отклеить капсулу блеска. И высвобождайте клетки печени, мягко раскачивая печень в DMEM до тех пор, пока клетки не будут полностью диссоциированы в среде. Жизнеспособность гепатоцитов составляла от 88 до 94,8%, что определялось трипом и синим подсчетом.Выход гепатоцитов у крыс весом от 200 до 300 граммов составлял до пяти раз по 10-восьмым клеткам за выделение. На репрезентативных изображениях показана неочищенная суспензия клеток печени и очищенная суспензия гепатоцитов. Чистота выделенных гепатоцитов составляла приблизительно 96,8%, что было количественно определено путем подсчета альбумин-положительных флуоресцентных окрашенных клеток по отношению к общему числу клеточных ядер.На репрезентативных изображениях, показанных ложным цветом, зеленый представляет альбумин, а синий указывает на клеточные ядра с альбумином. Ядра клеток без альбумина выделены красным цветом. Гепатоциты в сэндвич-культуре образовывали отчетливые желчные канальцы и имели хороший клеточный контакт.Как показали анализы альбумина, мочевины и цитохрома Р450, гепатоциты демонстрировали высокую секрецию мочевины и альбумина. На третий день гепатоциты продемонстрировали высокую ферментную активность для CYP1A2, CYP2B1/2 и CYP3B2. Будьте морально подготовлены перед введением иглы в воротную вену.После введения хирургу нужно будет продолжать без импульса, пока скорость насоса не будет увеличена после разрезания IVC.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Первичные культуры взрослых Миоциты сердца крысы

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Выделение фибробластов крысы Портала<em&gt; В месте</em&gt; Печень перфузии

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Выделение и первичной культуре клеток крысы Печеночная

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Выделение иммунных клеток из первичной опухоли

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells

Культивирование первичных Крыса Внутренняя Медуллярной собирательных канальцев Клетки

Arginine-vasopressin (AVP) facilitates water reabsorption by renal collecting duct principal cells and thereby fine-tunes body water homeostasis. AVP ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Выделение и культивирование Мышь первичные клетки поджелудочной Ацинарных

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

Выделение гепатоцитов человека два-ступенчатой ​​коллагеназы процедуры перфузионный

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Выделение и первичной культуре мышиных эндотелиальных клеток аорты

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Определение жирных кислот и окисления Липогенез в первичных гепатоцитов мышей

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Протокол для изоляции первичных гепатоцитов человека и соответствующие основные популяциями Non-паренхиматозных клеток печени

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...