Name: isolation of primary rat hepatocytes with multiparameter perfusion control
Uploaded: 2021-04-05T13:00:00
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Este trabajo está respaldado en parte por MOE ARC (MOE2017-T2-1-149); NUHS Innovation Seed Grant 2017 (NUHSRO/2017/051/InnovSeed/02); Instituto de Mecanobiología de Singapur (R-714-106-004-135); y el Instituto de Bioingeniería y Nanotecnología, Consejo de Investigación Biomédica, Agencia de Ciencia, Tecnología e Investigación (A*STAR) (Números de proyecto IAF-PP H18/01/a0/014, IAF-PP H18/01/a0/K14 y MedCaP-LOA-18-02) financiación a Hanry Yu. Ng Chan Way es un investigador de la Universidad Nacional de Singapur. Nos gustaría agradecer a la Unidad de Microscopía Confocal y a la Unidad de Citometría de Flujo de la Universidad Nacional de Singapur por su ayuda y asesoramiento en el análisis de la pureza de los hepatocitos.

Todos los procedimientos y alojamientos de animales se llevaron a cabo bajo los números de protocolo R15-0027 y R19-0669 de acuerdo con los requisitos del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Nacional de Singapur.
1. Preparación de soluciones e instrumentos quirúrgicos
<ol><li>Prepare tampones y medios de cultivo celular en la Tabla 1 utilizando agua ultrapura.</li>
	<li>Precaliente el tampón libre de calcio y el tampón de colagen...

<ol>
	<li>Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. H., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+rat+hepatic+cells.">Isolation and primary culture of rat hepatic cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).</li><li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion.">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).</li><li>Green, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+primary+hepatocytes+from+human+tissue:+optimising+the+use+of+small+non-encapsulated+liver+resection+surplus.">The isolation of primary hepatocytes from human tissue: optimising the use of small non-encapsulated liver resection surplus.</a> Cell and Tissue Banking. 18 (4), 597-604 (2017).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).</li><li>Gopalakrishnan, S., Harris, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+liver+endocytosis+followed+by+purification+of+liver+cells+by+liver+perfusion.">In vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3138 (2011).</li><li>Wen, J. W., Olsen, A. L., Perepelyuk, M., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+rat+portal+fibroblasts+by+in+situ+liver+perfusion.">Isolation of rat portal fibroblasts by in situ liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3669 (2012).</li><li>Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+3D+collagen+sandwich+culture+of+primary+mouse+hepatocytes+to+study+the+role+of+cytoskeleton+in+bile+canalicular+formation+in+vitro.">Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60501 (2019).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+purification+of+immune+cells+from+the+liver.">Isolation and purification of immune cells from the liver.</a> International Immunopharmacology. 85 (95), 106632 (2020).</li><li>Salem, E. S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+mouse+hepatocytes+for+nascent+protein+synthesis+analysis+by+non-radioactive+L-azidohomoalanine+labeling+method.">Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive L-azidohomoalanine labeling method.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323 (2018).</li><li>Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethered+spheroids+as+an+in+vitro+hepatocyte+model+for+drug+safety+screening.">Tethered spheroids as an in vitro hepatocyte model for drug safety screening.</a> Biomaterials. 33 (7), 2165-2176 (2012).</li><li>Kegel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+isolation+of+primary+human+hepatocytes+and+corresponding+major+populations+of+non-parenchymal+liver+cells.">Protocol for isolation of primary human hepatocytes and corresponding major populations of non-parenchymal liver cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53069 (2016).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vertical-flow+bioreactor+array+compacts+hepatocytes+for+enhanced+polarity+and+functions.">A vertical-flow bioreactor array compacts hepatocytes for enhanced polarity and functions.</a> Lab on a Chip. 16 (20), 3898-3908 (2016).</li><li>Du, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+sandwich+culture+of+3D+hepatocyte+monolayer.">Synthetic sandwich culture of 3D hepatocyte monolayer.</a> Biomaterials. 29 (3), 290-301 (2008).</li><li>Tong, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constrained+spheroids+for+prolonged+hepatocyte+culture.">Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture.</a> Biomaterials. 80, 106-120 (2016).</li><li>Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar-flow+immediate-overlay+hepatocyte+sandwich+perfusion+system+for+drug+hepatotoxicity+testing.">Laminar-flow immediate-overlay hepatocyte sandwich perfusion system for drug hepatotoxicity testing.</a> Biomaterials. 30 (30), 5927-5936 (2009).</li><li>Gupta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+canaliculi+contract+autonomously+by+releasing+calcium+into+hepatocytes+via+mechanosensitive+calcium+channel.">Bile canaliculi contract autonomously by releasing calcium into hepatocytes via mechanosensitive calcium channel.</a> Biomaterials. 259, 120283 (2020).</li><li>Horner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Percoll+purification+on+isolation+of+primary+human+hepatocytes.">Impact of Percoll purification on isolation of primary human hepatocytes.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6542 (2019).</li><li>Osypiw, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpopulations+of+rat+hepatocytes+separated+by+Percoll+density-gradient+centrifugation+show+characteristics+consistent+with+different+acinar+locations.">Subpopulations of rat hepatocytes separated by Percoll density-gradient centrifugation show characteristics consistent with different acinar locations.</a> The Biochemical Journal. 304, 617-624 (1994).</li><li>Beal, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+animal+model+of+ex+vivo+normothermic+liver+perfusion.">A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541 (2018).</li><li>Hillebrandt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedure+for+decellularization+of+rat+livers+in+an+oscillating-pressure+perfusion+device.">Procedure for decellularization of rat livers in an oscillating-pressure perfusion device.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), e53029 (2015).</li></ol>

Hay algunos puntos que son particularmente importantes a observar para el procedimiento de perfusión de colagenasa de dos pasos en general. En primer lugar, se debe tener especial cuidado al resecar el hígado. Asegúrese de que el tracto gastrointestinal no esté dañado, ya que la fuga del contenido dará lugar a la contaminación bacteriana. Además, evite dañar la cápsula de Glisson, que cubre la superficie del hígado durante el procedimiento animal. Si el desgarro es lo suficientemente grande, podría permitir l...

Los hepatocitos primarios son herramientas importantes para la investigación básica relacionada con el hígado, el tratamiento de enfermedades y la aplicación, como las pruebas de drogas. El estándar de oro actual para el aislamiento primario de hepatocitos es el procedimiento de perfusión de colagenasa de dos pasos 1,2,3 introducido por Seglen en la década de 19704. Sin embargo, este procedimiento es técnicamente desafiante y tiene una alta tasa de fracaso cuando es realizado por cirujanos novatos. Incluso cuando una perfusión se considera exitosa, se pueden observar diferencias drásticas en la viabilidad de los hepatocitos (típicamente 60%-95%) y el rendimiento (0.5-5 x 108 por 200-300 g de rata) entre los aislamientos. Esto influye en la calidad y la escala de los experimentos posteriores. Aparte del procedimiento técnico, la configuración de perfusión utilizada para el aislamiento, ya sea disponible comercialmente o hecha a medida, es un factor contribuyente. Se debe prestar atención al montaje, optimización y mantenimiento de la configuración de perfusión. El propósito de este protocolo es mejorar la tasa de éxito y la estabilidad entre los aislamientos de hepatocitos primarios de rata a través del control de perfusión multiparamétrico del procedimiento técnico y la configuración de perfusión del procedimiento de perfusión de colagenasa de dos pasos.
Desde el aspecto técnico, el paso más difícil en el procedimiento es la canulación de la vena porta. En cuanto a los otros pasos, si se observan buenas prácticas y se toman precauciones generales, se puede mejorar la estabilidad del aislamiento. Por lo tanto, la comprensión del razonamiento para cada paso es importante para que el cirujano pueda responder a varias variables que pueden ocurrir durante el procedimiento.
Se han publicado diversos protocolos para el aislamiento de hepatocitos y células hepáticas no parenquimatosas de rata y ratón 1,2,5,6,7,8,9. Las configuraciones de perfusión utilizadas en estos protocolos tenían varias desventajas, que incluyen la reutilización de tubos de perfusión, problemas con el control de la temperatura, la necesidad de optimización rutinaria de los parámetros de perfusión y / o el uso de un tipo inadecuado de catéter intravenoso (IV) para la canulación de la vena porta. La reutilización de los tubos de perfusión aumentará las posibilidades de contaminación, especialmente si los tubos no se limpiaron y desinfectaron adecuadamente. La reutilización de tubos sin reemplazo de rutina también expondrá la configuración de perfusión a problemas como tubos o conectores con fugas, trampa de burbujas obstruida y tubos constreñidos, todo lo cual reducirá sustancialmente la presión de perfuso y la tasa de flujo, lo que afectará la eficiencia de la digestión hepática. Sin una fuente de calor constante en algunas configuraciones para el control de la temperatura, los tampones precalentados se enfriarán con el tiempo, lo que provocará una baja actividad y digestión de la colagenasa. Aunque otras configuraciones utilizan un condensador de vidrio con camisa conectado a un circulador de agua para calentar el amortiguador, son voluminosas y requieren una limpieza cuidadosa. La temperatura, la presión y el caudal del tampón que sale del catéter deben medirse y optimizarse antes del inicio del aislamiento para garantizar una condición de perfusión estable. Incluso después de la optimización, los parámetros aún podrían cambiar a mitad de camino durante el aislamiento debido a las acciones del operador, lo que lleva a una perfusión y digestión subóptimas. La mayoría de los tipos de catéter intravenoso no son adecuados para la canulación de la vena porta porque no permiten la perfusión continua durante la canulación. No pueden informar inmediatamente al cirujano cuando la canulación es exitosa. Además, es difícil asegurar la vena porta en el catéter blando sin deformarla.
Aquí, abordamos estos problemas utilizando tubos estériles desechables estandarizados, una camisa de calentador de silicona para un control de temperatura preciso y estable, monitoreo en tiempo real y sistema de alarma con almacenamiento de datos y administración y uso de un catéter IV especial, que permite la perfusión continua mientras perfora la vena porta durante la canulación. Hasta donde sabemos, somos el primer grupo en combinar todas estas características en un sistema de perfusión integrado (IPS) que es compacto, lo que lo hace altamente portátil y capaz de caber en una campana de flujo laminar para garantizar un funcionamiento aséptico.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Nipro</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>Nipro</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black braided silk non-absorbable, non-sterile surgical suture</td>
			<td>Look</td>
			<td>SP117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bochem 18/10 stainless steel forceps, sharp tip contain bent round tip</td>
			<td>Bochem</td>
			<td>10333511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Perfusion Set</td>
			<td>Vasinfuse</td>
			<td>BPF-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floating circular 1.5 mL microcentrifuge tube rack</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>German Standard Tissue Forceps, Serrated / 1&#215;2 teeth , 14.5cm</td>
			<td>Walentech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Cellstar aspirating pipette</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GN710183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrated Perfusion System</td>
			<td>Vasinfuse</td>
			<td>IPS-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors curved, stainless, 11cm</td>
			<td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td>
			<td>CVD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope with 10X lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh Sheet 100&#181;M Nylon</td>
			<td>Spectra-Teknic(s) Pte Ltd</td>
			<td>06630-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors, BL/BL, 13cm</td>
			<td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td>
			<td>STR &#8211; BL/BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors, SH/BL, 13cm</td>
			<td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td>
			<td>STR &#8211; SH/BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse force hemostatic clip</td>
			<td>Shanghai Jin Zhong Pte Ltd</td>
			<td>XEC230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents/Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>137101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17104019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>TCI</td>
			<td>D1961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31600-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11344-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1-9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC26764.298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type I bovine collagen</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>William&#8217;s E Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W1878</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary rat hepatocytes with multiparameter perfusion control

Los hepatocitos primarios son ampliamente utilizados en la investigación básica sobre enfermedades hepáticas y para pruebas de toxicidad in vitro. El procedimiento de perfusión de colagenasa de dos pasos para el aislamiento primario de hepatocitos es técnicamente desafiante, especialmente en la canulación de la vena porta. El procedimiento también es propenso a la contaminación ocasional y las variaciones en las condiciones de perfusión debido a dificultades en el montaje, la optimización o el mantenimiento de la configuración de perfusión. Aquí, se presenta un protocolo detallado para un procedimiento mejorado de perfusión de colagenasa de dos pasos con control de perfusión multiparamétrico. Los hepatocitos primarios de rata se aislaron de manera exitosa y confiable tomando las precauciones técnicas necesarias en los pasos críticos del procedimiento, y reduciendo la dificultad operativa y mitigando la variabilidad de los parámetros de perfusión a través de la adopción de un catéter intravenoso especial, tubos desechables estériles estandarizados, control de temperatura y monitoreo y sistema de alarma en tiempo real. Los hepatocitos primarios de rata aislados exhiben consistentemente una alta viabilidad celular (85% -95%), rendimiento (2-5 x 108 células por rata de 200-300 g) y funcionalidad (actividad de albúmina, urea y CYP). El procedimiento se complementó con un sistema de perfusión integrado, que es lo suficientemente compacto como para instalarse en la campana de flujo laminar para garantizar un funcionamiento aséptico.

Un cirujano podría saber si la perfusión hepática está ocurriendo sin problemas observando el resultado después de ciertos pasos. El primer resultado se puede observar en la canulación, el corte de la CIV infrahepática y la restauración del caudal de perfusión. El hígado debe haber cambiado completamente de color de rojo oscuro a marrón, manteniendo su volumen. Si el hígado se ve ligeramente desinflado y tiene un tinte rojizo o manchas de rojo, significa que la tasa de flujo de perfusión se estableció erró...

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Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Este protocolo detalla el uso de un catéter intravenoso especial, tubos desechables estériles estandarizados, control de temperatura complementado con monitoreo en tiempo real y un sistema de alarma para el procedimiento de perfusión de colagenasa de dos pasos para mejorar la consistencia en la viabilidad, el rendimiento y la funcionalidad de los hepatocitos primarios aislados de ratas.

Aislamiento de hepatocitos primarios de rata con control de perfusión multiparamétrico

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...

Este protocolo de aislamiento de hepatocitos de rata se basa en la resección hepática antes del enfoque de digestión. El protocolo introduce un sistema de perfusión integrado compacto y portátil para el aislamiento celular. Esta técnica implica la recirculación de la colagenasa que reduce el volumen de uso de la colagenasa y proporciona más flexibilidad en la extensión del tiempo de digestión al tiempo que garantiza un alto rendimiento de gravedad y la función específica de los hepatocitos.Pon la rata en la capucha. Después de cortar los músculos abdominales, empuje los intestinos hacia la derecha con la parte posterior de las pinzas curvas. Rompa la membrana debajo del conducto biliar con la punta de las pinzas curvas para enrollar la sutura alrededor de la vena porta y el conducto biliar.Use una sutura quirúrgica de seda para hacer una ligadura muy suelta alrededor de la vena porta cerca del hígado, justo antes de que la vena se ramifique a izquierda y derecha en diferentes lóbulos hepáticos. Alrededor de dos a tres centímetros aguas arriba de la primera ligadura, justo antes de que la vena gástrica se ramifique de la vena porta, crea un agujero a través del tejido debajo de la vena porta con las puntas de dos pares de fórceps curvos. Luego estire el orificio para apoyar la vena porta durante la canulación.Evite la acumulación de presión en el hígado reduciendo la velocidad de la bomba a cuatro RPM para un caudal de aproximadamente tres mililitros por minuto. Y asegúrese de que la salida del tampón libre de calcio del catéter intravenoso se reduzca a un goteo lento. Mientras apoya suavemente la vena porta con fórceps, sostenga el catéter intravenoso con el bisel de la aguja hacia arriba.E inserte la aguja en la vena porta en un ángulo de 10 a 20 grados. Luego avance lentamente hasta que todo el bisel esté dentro de la vena. La inserción correcta debe resultar en el escaldado del color del hígado.Avance la cánula sobre la aguja y retraiga la aguja detrás de la cánula tirando hacia atrás del ala con el dedo índice mientras sostiene el catéter con el pulgar y el dedo medio. Asegure la vena porta en el catéter con un clip de vena y un clip debajo de la vena porta para evitar la interrupción del flujo de perfusión. A continuación, corte la vena cava inferior infrahepática para evitar la acumulación de presión en el hígado y observe los impulsos de chorro de sangre para garantizar el corte correcto.Aumente la velocidad de la bomba a 38 RPM para un caudal de aproximadamente 33 mililitros por minuto. Y enjuague el hígado tres veces cerrando la vena cava inferior infrahepática con fórceps durante dos o tres segundos, y luego volviéndola a abrir. Para perfundir todos los lóbulos hepáticos, ajuste la posición de la punta de la cánula y asegúrese de que se coloque antes de que la vena porta se ramifique en diferentes lóbulos hepáticos.Luego, apriete la ligadura suelta alrededor de la vena porta, ligeramente aguas arriba del punto de ramificación, y asegure la posición de la cánula en la vena porta para evitar el reflujo del tampón haciendo tres nudos en el punto donde la aguja dura sostiene la cánula, entre el bisel y el orificio lateral. Después de la resección hepática, permita que el hígado se perfunda con el tampón libre de calcio durante 12 minutos. Luego, apriete la abrazadera del rodillo del tampón libre de calcio y afloje la abrazadera del rodillo del tampón de colagenasa para cambiar el tampón de perfusión.Después de que el tampón de colagenasa llegue al hígado, enjuague el hígado tres veces cerrando la vena cava inferior suprahepática durante dos o tres segundos y volviéndola a abrir. Mueva cuidadosamente el hígado a la etapa en la parte superior del vaso de precipitados para la recirculación del tampón de colagenasa sosteniendo el diafragma con fórceps mientras apoya el catéter, teniendo cuidado de no tirar del catéter para evitar el desprendimiento accidental. Digiera el hígado durante 12 minutos y detenga la perfusión cuando el hígado pierda su textura marrón lisa y se vuelva blando.Extender el tiempo de digestión si es necesario. Después de la digestión del hígado, corte la vena porta con cuidado retire la cánula. Y luego transfiera el hígado a DMEM frío para aislar los hepatocitos.Golpee suavemente el hígado con la parte posterior de las pinzas curvas para romper y despegar la cápsula glistens. Y libere las células hepáticas balanceando suavemente el hígado en DMEM hasta que las células estén completamente disociadas en los medios. La viabilidad de los hepatocitos fue de entre el 88 y el 94,8%, según lo determinado por el trip y el conteo azul.El rendimiento de los hepatocitos de ratas que pesaban de 200 a 300 gramos fue de hasta cinco veces 10 a las octavas células por aislamiento. Las imágenes representativas muestran suspensión de células hepáticas no purificadas y suspensión de hepatocitos purificados. La pureza de los hepatocitos aislados fue de aproximadamente el 96,8%, que se cuantificó contando las células teñidas fluorescentes positivas con albúmina en relación con el número total de núcleos celulares.En las imágenes representativas que se muestran en color falso, el verde representa la albúmina, y el azul indica los núcleos celulares con albúmina. Los núcleos celulares sin albúmina están resaltados en rojo. Los hepatocitos en cultivo sándwich formaron distintos canalículos biliares y tuvieron un buen contacto celular.Como lo demuestran los ensayos de albúmina, urea y citocromo P450, los hepatocitos exhibieron una alta secreción de urea y albúmina. En el tercer día, los hepatocitos exhibieron altas actividades enzimáticas para CYP1A2, CYP2B1/2 y CYP3B2. Prepárese mentalmente antes de insertar la aguja en la vena porta.Tras la inserción, un cirujano deberá continuar sin pulso hasta que se aumente la velocidad de la bomba después de cortar el IVC.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultivo primario de miocitos adultos de corazón de rata

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Investigación

Biología

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

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El aislamiento de fibroblastos portales rata por<em&gt; In situ</em&gt; Hígado de perfusión

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Aislamiento y cultivo primario de células hepáticas de ratas

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

El aislamiento de las células inmunes de tumores primarios

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Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells

El cultivo primarios de rata medular interna recolección de células del conducto

Arginine-vasopressin (AVP) facilitates water reabsorption by renal collecting duct principal cells and thereby fine-tunes body water homeostasis. AVP ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Aislamiento y cultivo de ratón primarias células acinares pancreáticas

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

El aislamiento de hepatocitos humanos por una colagenasa perfusión Procedimiento de dos pasos

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Aislamiento y cultivo primario de células endoteliales aórticas de ratón

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Determinación de la oxidación de ácidos grasos y la lipogénesis en el ratón hepatocitos primarios

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Protocolo para el aislamiento de hepatocitos primarios humanos y la correspondiente principales poblaciones de células hepáticas no parenquimatosas

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...