Name: isolation of primary rat hepatocytes with multiparameter perfusion control
Uploaded: 2021-04-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control at JoVE.com

Detta arbete stöds delvis av MOE ARC (MOE2017-T2-1-149); NUHS Innovation Seed Grant 2017 (NUHSRO/2017/051/InnovSeed/02); Mekanobiologiska institutet i Singapore (R-714-106-004-135); och Institute of Bioengineering and Nanotechnology, Biomedical Research Council, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR) (Projektnummer IAF-PP H18/01/a0/014, IAF-PP H18/01/a0/K14 och MedCaP-LOA-18-02) finansiering till Hanry Yu. Ng Chan Way är forskare vid National University of Singapore. Vi vill tacka Confocal Microscopy Unit &Flow Cytometry Unit vid National University of Singapore för hjälp och råd inom hepatocytrenhetsanalys.

Alla procedurer och djurhem utfördes under protokollnummer R15-0027 och R19-0669 i enlighet med kraven från Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid National University of Singapore.
1. Beredning av lösningar och kirurgiska instrument
<ol><li>Förbered buffertar och cellodlingsmedier i tabell 1 med ultrarent vatten.</li>
	<li>Förvärm den kalciumfria bufferten och kollagenasbufferten till 37 °C i ett vattenbad före användning.</li>
	<li>Autoklavera föl...

<ol>
	<li>Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. H., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+rat+hepatic+cells.">Isolation and primary culture of rat hepatic cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).</li><li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion.">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).</li><li>Green, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+primary+hepatocytes+from+human+tissue:+optimising+the+use+of+small+non-encapsulated+liver+resection+surplus.">The isolation of primary hepatocytes from human tissue: optimising the use of small non-encapsulated liver resection surplus.</a> Cell and Tissue Banking. 18 (4), 597-604 (2017).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).</li><li>Gopalakrishnan, S., Harris, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+liver+endocytosis+followed+by+purification+of+liver+cells+by+liver+perfusion.">In vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3138 (2011).</li><li>Wen, J. W., Olsen, A. L., Perepelyuk, M., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+rat+portal+fibroblasts+by+in+situ+liver+perfusion.">Isolation of rat portal fibroblasts by in situ liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3669 (2012).</li><li>Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+3D+collagen+sandwich+culture+of+primary+mouse+hepatocytes+to+study+the+role+of+cytoskeleton+in+bile+canalicular+formation+in+vitro.">Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60501 (2019).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+purification+of+immune+cells+from+the+liver.">Isolation and purification of immune cells from the liver.</a> International Immunopharmacology. 85 (95), 106632 (2020).</li><li>Salem, E. S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+mouse+hepatocytes+for+nascent+protein+synthesis+analysis+by+non-radioactive+L-azidohomoalanine+labeling+method.">Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive L-azidohomoalanine labeling method.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323 (2018).</li><li>Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethered+spheroids+as+an+in+vitro+hepatocyte+model+for+drug+safety+screening.">Tethered spheroids as an in vitro hepatocyte model for drug safety screening.</a> Biomaterials. 33 (7), 2165-2176 (2012).</li><li>Kegel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+isolation+of+primary+human+hepatocytes+and+corresponding+major+populations+of+non-parenchymal+liver+cells.">Protocol for isolation of primary human hepatocytes and corresponding major populations of non-parenchymal liver cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53069 (2016).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vertical-flow+bioreactor+array+compacts+hepatocytes+for+enhanced+polarity+and+functions.">A vertical-flow bioreactor array compacts hepatocytes for enhanced polarity and functions.</a> Lab on a Chip. 16 (20), 3898-3908 (2016).</li><li>Du, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+sandwich+culture+of+3D+hepatocyte+monolayer.">Synthetic sandwich culture of 3D hepatocyte monolayer.</a> Biomaterials. 29 (3), 290-301 (2008).</li><li>Tong, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constrained+spheroids+for+prolonged+hepatocyte+culture.">Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture.</a> Biomaterials. 80, 106-120 (2016).</li><li>Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar-flow+immediate-overlay+hepatocyte+sandwich+perfusion+system+for+drug+hepatotoxicity+testing.">Laminar-flow immediate-overlay hepatocyte sandwich perfusion system for drug hepatotoxicity testing.</a> Biomaterials. 30 (30), 5927-5936 (2009).</li><li>Gupta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+canaliculi+contract+autonomously+by+releasing+calcium+into+hepatocytes+via+mechanosensitive+calcium+channel.">Bile canaliculi contract autonomously by releasing calcium into hepatocytes via mechanosensitive calcium channel.</a> Biomaterials. 259, 120283 (2020).</li><li>Horner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Percoll+purification+on+isolation+of+primary+human+hepatocytes.">Impact of Percoll purification on isolation of primary human hepatocytes.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6542 (2019).</li><li>Osypiw, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpopulations+of+rat+hepatocytes+separated+by+Percoll+density-gradient+centrifugation+show+characteristics+consistent+with+different+acinar+locations.">Subpopulations of rat hepatocytes separated by Percoll density-gradient centrifugation show characteristics consistent with different acinar locations.</a> The Biochemical Journal. 304, 617-624 (1994).</li><li>Beal, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+animal+model+of+ex+vivo+normothermic+liver+perfusion.">A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541 (2018).</li><li>Hillebrandt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedure+for+decellularization+of+rat+livers+in+an+oscillating-pressure+perfusion+device.">Procedure for decellularization of rat livers in an oscillating-pressure perfusion device.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), e53029 (2015).</li></ol>

Det finns några punkter som är särskilt viktiga att observera för tvåstegs kollagenasperfusionsförfarande i allmänhet. För det första måste särskild försiktighet ges vid resektering av levern. Se till att mag-tarmkanalen inte skadas eftersom läckage av innehållet kommer att leda till bakteriell kontaminering. Undvik dessutom att skada Glissons kapsel, som täcker leverns yta under djurproceduren. Om tåren är tillräckligt stor kan det tillåta för tidig frisättning av disassocierade hepatocyter i kollag...

Primära hepatocyter är viktiga verktyg för leverrelaterad grundforskning, sjukdomsbehandling och tillämpning som drogtestning. Den nuvarande guldstandarden för primär hepatocytisolering är tvåstegs kollagenasperfusionsproceduren 1,2,3 som introducerades av Seglen på 1970-talet4. Denna procedur är dock tekniskt utmanande och har en hög felfrekvens när den utförs av nybörjare. Även när en perfusion anses vara framgångsrik kan drastiska skillnader i hepatocytviabilitet (vanligtvis 60% -95%) och utbyte (0,5-5 x 108 per 200-300 g råtta) observeras mellan isoleringar. Detta påverkar kvaliteten och omfattningen av nedströms experiment. Bortsett från den tekniska proceduren är perfusionsinställningen som används för isoleringen, antingen kommersiellt tillgänglig eller specialbyggd, en bidragande faktor. Uppmärksamhet måste ägnas åt montering, optimering och underhåll av perfusionsinställningen. Syftet med detta protokoll är att förbättra framgångsgraden och stabiliteten mellan isoleringar av primära råtthepatocyter genom multiparameterperfusionskontroll av det tekniska förfarandet och perfusionsinställning av tvåstegs kollagenasperfusionsproceduren.
Ur den tekniska aspekten är det svåraste steget i proceduren portalvenens kannulering. När det gäller de andra stegen, om god praxis följs och allmänna försiktighetsåtgärder vidtas, kan isoleringens stabilitet förbättras. Därför är förståelse för resonemanget för varje steg viktigt så att kirurgen kan svara på olika variabler som kan uppstå under proceduren.
Olika protokoll för isolering av hepatocyter och lever icke-parenkymala celler från råtta och mus har publicerats 1,2,5,6,7,8,9. Perfusionsinställningarna som användes i dessa protokoll hade flera nackdelar, som inkluderar återanvändning av perfusionsrör, problem med temperaturkontroll, behov av rutinoptimering av perfusionsparametrar och / eller användning av olämplig typ av intravenös (IV) kateter för portalvenkannulering. Återanvändning av perfusionsslangar ökar risken för kontaminering, särskilt om slangen inte rengjordes och desinficerades ordentligt. Återanvändning av slangar utan rutinmässigt byte kommer också att utsätta perfusionsinställningen för problem som läckande slangar eller kontakter, igensatt bubbelfälla och trånga slangar, som alla avsevärt kommer att minska perfusattrycket och flödeshastigheten, vilket påverkar leverens matsmältningseffektivitet. Utan en konstant värmekälla i vissa inställningar för temperaturkontroll kommer förvärmda buffertar att svalna med tiden, vilket leder till låg kollagenasaktivitet och matsmältning. Även om andra inställningar använder en mantlad glaskondensor ansluten till en vattencirkulation för att värma bufferten, är de skrymmande och kräver noggrann rengöring. Temperatur, tryck och flödeshastighet för buffert som lämnar katetern måste mätas och optimeras innan isoleringen påbörjas för att säkerställa ett stabilt perfusionstillstånd. Även efter optimering kan parametrarna fortfarande förändras halvvägs under isolering på grund av operatörens handlingar, vilket leder till suboptimal perfusion och matsmältning. De flesta typer av IV-kateter är inte lämpliga för portalvenkannulering eftersom de inte tillåter kontinuerlig perfusion under kannulering. De kan inte omedelbart informera kirurgen när kannuleringen är framgångsrik. Dessutom är det utmanande att säkra portalvenen på den mjuka katetern utan att deformera den.
Här tar vi itu med dessa problem med hjälp av standardiserade sterila engångsrör, en silikonvärmarjacka för exakt och stabil temperaturkontroll, realtidsövervakning och larmsystem med datalagring och hantering och användning av en speciell IV-kateter, vilket möjliggör kontinuerlig perfusion medan du punkterar portalvenen under kannulering. Så vitt vi vet är vi den första gruppen som kombinerar alla dessa funktioner i ett integrerat perfusionssystem (IPS) som är kompakt, vilket gör det mycket bärbart och kan passas in i en laminär flödeshuv för att säkerställa aseptisk drift.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Nipro</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>Nipro</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black braided silk non-absorbable, non-sterile surgical suture</td>
			<td>Look</td>
			<td>SP117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bochem 18/10 stainless steel forceps, sharp tip contain bent round tip</td>
			<td>Bochem</td>
			<td>10333511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Perfusion Set</td>
			<td>Vasinfuse</td>
			<td>BPF-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floating circular 1.5 mL microcentrifuge tube rack</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>German Standard Tissue Forceps, Serrated / 1&#215;2 teeth , 14.5cm</td>
			<td>Walentech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Cellstar aspirating pipette</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GN710183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrated Perfusion System</td>
			<td>Vasinfuse</td>
			<td>IPS-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors curved, stainless, 11cm</td>
			<td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td>
			<td>CVD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope with 10X lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh Sheet 100&#181;M Nylon</td>
			<td>Spectra-Teknic(s) Pte Ltd</td>
			<td>06630-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors, BL/BL, 13cm</td>
			<td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td>
			<td>STR &#8211; BL/BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors, SH/BL, 13cm</td>
			<td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td>
			<td>STR &#8211; SH/BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse force hemostatic clip</td>
			<td>Shanghai Jin Zhong Pte Ltd</td>
			<td>XEC230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents/Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>137101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17104019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>TCI</td>
			<td>D1961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31600-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11344-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1-9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC26764.298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type I bovine collagen</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>William&#8217;s E Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W1878</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary rat hepatocytes with multiparameter perfusion control

Primära hepatocyter används ofta i grundforskning om leversjukdomar och för toxicitetstestning in vitro. Tvåstegs kollagenasperfusionsproceduren för primär hepatocytisolering är tekniskt utmanande, särskilt vid kannulering av portalvener. Förfarandet är också benäget för tillfällig kontaminering och variationer i perfusionsförhållanden på grund av svårigheter vid montering, optimering eller underhåll av perfusionsinställningen. Här presenteras ett detaljerat protokoll för ett förbättrat tvåstegs kollagenasperfusionsförfarande med multiparameterperfusionskontroll. Primära råtthepatocyter isolerades framgångsrikt och tillförlitligt genom att vidta nödvändiga tekniska försiktighetsåtgärder vid kritiska steg i proceduren och genom att minska driftssvårigheterna och mildra variationen i perfusionsparametrar genom antagande av en speciell intravenös kateter, standardiserad steril engångsslang, temperaturkontroll och realtidsövervaknings- och larmsystem. De isolerade primära råtthepatocyterna uppvisar konsekvent hög cellviabilitet (85% -95%), utbyte (2-5 x 108 celler per 200-300 g råtta) och funktionalitet (albumin, urea och CYP-aktivitet). Förfarandet kompletterades med ett integrerat perfusionssystem, som är tillräckligt kompakt för att ställas in i den laminära flödeshuven för att säkerställa aseptisk drift.

En kirurg kan berätta om leverperfusion pågår smidigt genom att observera resultatet efter vissa steg. Det första resultatet kan observeras vid kannulering, skärning av den infrahepatiska IVC och återställande av perfusionsflödet. Levern borde ha helt ändrat färg från mörkröd till brun, samtidigt som volymen bibehålls. Om levern ser något tömd ut och har en rödaktig nyans eller fläckar av rött, betyder det att perfusionsflödeshastigheten ställdes in felaktigt (för lågt), eller att portalvenen inte ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control at JoVE.com

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Detta protokoll beskriver användningen av en speciell intravenös kateter, standardiserade sterila engångsrör, temperaturkontroll kompletterad med realtidsövervakning och ett larmsystem för tvåstegs kollagenasperfusionsförfarande för att förbättra konsistensen i livskraften, utbytet och funktionaliteten hos isolerade primära råtthepatocyter.

Isolering av primära råtthepatocyter med multiparameterperfusionskontroll

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...

Detta isoleringsprotokoll för råtthepatocyter är baserat på leverresektion före matsmältningsmetoden. Protokollet introducerar ett kompakt och bärbart integrerat perfusionssystem för cellisolering. Denna teknik involverar kollagenascirkulation som minskar volymen av kollagenasanvändning och ger mer flexibilitet vid förlängning av matsmältningstiden samtidigt som man säkerställer högt tyngdkraftutbyte och hepatocyterspecifik funktion.Sätt råttan i huven. Efter att ha klippt magmusklerna, tryck tarmarna åt höger med baksidan av de krökta tångarna. Bryt membranet under gallgången med spetsen på de böjda tångarna för att slingra suturen runt portalvenen och gallgången.Använd en silkekirurgisk sutur för att göra en mycket lös ligatur runt portalvenen nära levern, strax innan venen grenar åt vänster och höger in i olika leverlober. Cirka två till tre centimeter uppströms den första ligaturen, strax innan magvenen förgrenar sig från portalvenen, skapar ett hål genom vävnaden under portalvenen med spetsarna på två par böjda pincett. Sträck sedan hålet för att stödja portalvenen under kannulering.Förhindra tryckuppbyggnad i levern genom att minska pumphastigheten till fyra varv / min för en flödeshastighet på cirka tre milliliter per minut. Och se till att utflödet av den kalciumfria bufferten från den intravenösa katetern reduceras till ett långsamt dropp. Medan du försiktigt stöder portalvenen med pincett, håll den intravenösa katetern med nålens avfasning uppåt.Och sätt in nålen i portalvenen i 10 till 20 graders vinkel. Gå sedan långsamt framåt tills hela avfasningen är inne i venen. Korrekt insättning bör resultera i blanchering av leverfärgen.För kanylen över nålen och dra tillbaka nålen bakom kanylen genom att dra tillbaka vingen med pekfingret medan du håller katetern med tummen och långfingret. Fäst portalvenen på katetern med en venklämma och kläm under portalvenen för att undvika störningar i flödet. Skär sedan den infrahepatiska underlägsna vena cava för att förhindra tryckuppbyggnad i levern och observera för blodspurtande impulser för att säkerställa rätt snitt.Öka pumphastigheten till 38 varv / min för en flödeshastighet på cirka 33 milliliter per minut. Och spola levern tre gånger genom att stänga den infrahepatiska underlägsna vena cava med pincett i två till tre sekunder och sedan öppna den igen. För att genomfusera alla leverlober, justera kanylspetsens position och se till att den placeras innan portalvenen grenar sig i olika leverlober.Dra sedan åt den lösa ligaturen runt portalvenen, något uppströms om förgreningspunkten, och säkra kanylens position i portalvenen för att förhindra återflöde av bufferten genom att göra tre knutar vid den punkt där den hårda nålen stöder kanylen, mellan avfasningen och sidohålet. Efter leverresektion tillåter levern att perfuse med den kalciumfria bufferten i 12 minuter. Dra sedan åt rullklämman på kalciumfri buffert och lossa rullklämman på kollagenasbufferten för att ändra perfusionsbufferten.När kollagenasbufferten når levern, spola levern tre gånger genom att stänga den suprahepatiska underlägsna vena cava i två till tre sekunder och öppna den igen. Flytta försiktigt levern till scenen ovanpå bägaren för återcirkulation av kollagenasbufferten genom att hålla membranet med pincett medan du stöder katetern, var noga med att inte dra katetern för att förhindra oavsiktlig lossning. Smält levern i 12 minuter och stoppa perfusionen när levern förlorar sin släta bruna konsistens och blir grumlig.Förläng matsmältningstiden vid behov. Efter matsmältningen av levern skär portalvenen försiktigt bort kanylen. Och överför sedan levern till kall DMEM för att isolera hepatocyterna.Knacka försiktigt på levern med baksidan av de böjda tångarna för att bryta och dra av glanskapseln. Och släpp levercellerna genom att försiktigt svänga levern i DMEM tills cellerna är helt dissocierade i media. Hepatocyternas livskraft var mellan 88 och 94,8%, vilket bestämdes av tripp och blå räkning.Utbytet av hepatocyter från råttor som väger 200 till 300 gram var upp till fem gånger 10 till de åttonde cellerna per isolering. De representativa bilderna visar orenad levercellssuspension och renad hepatocytsuspension. Renheten hos de isolerade hepatocyterna var cirka 96,8% vilket kvantifierades genom att räkna albuminpositiva fluorescerande färgade celler i förhållande till det totala antalet cellkärnor.I de representativa bilderna som visas i falsk färg representerar grönt albuminet och blått indikerar cellkärnorna med albumin. Cellkärnor utan albumin markeras röda. Hepatocyterna i sandwichkulturen bildade distinkta gallkanaliculi och hade god cellcellskontakt.Som framgår av albumin-, urea- och cytokrom P450-analyser uppvisade hepatocyterna hög urea- och albuminsekretion. Dag tre uppvisade hepatocyterna höga enzymaktiviteter för CYP1A2, CYP2B1/2 och CYP3B2. Var mentalt förberedd innan du sätter in nålen i portalvenen.Vid insättning måste en kirurg fortsätta utan puls tills pumphastigheten ökades efter skärning av IVC.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Primär kultur Vuxen myocyter Rat hjärta

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Isolering av råttfibroblaster portalen<em&gt; In situ</em&gt; Leverperfusion

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolering och Primär kultur av celler Rat Hepatiska

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Isolering av immunceller från primära tumörer

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells

Odling Primär Rat Inre Medullary uppsamlingskanal Cells

Arginine-vasopressin (AVP) facilitates water reabsorption by renal collecting duct principal cells and thereby fine-tunes body water homeostasis. AVP ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolering och odling av mus Primära bukspottkörtel Acinar

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

Isolering av humana hepatocyter med två steg kollagenas perfusion

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolering och Primär kultur av mus aortaendotelceller

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Fastställande av fettsyraoxidation och lipogenesen i mus primära hepatocyter

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Protokoll för isolering av primära humana hepatocyter och Motsvarande Större populationer av icke-parenkymala leverceller

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...