Name: isolation of primary rat hepatocytes with multiparameter perfusion control
Uploaded: 2021-04-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control at JoVE.com

Bu çalışma kısmen MOE ARC (MOE2017-T2-1-149) tarafından desteklenmektedir; NUHS İnovasyon Tohum Hibe 2017 (NUHSRO/2017/051/InnovSeed/02); Singapur Mekanobiyoloji Enstitüsü (R-714-106-004-135); ve Biyomühendislik ve Nanoteknoloji Enstitüsü, Biyomedikal Araştırma Konseyi, Bilim, Teknoloji ve Araştırma Ajansı (A * STAR) (Proje Numaraları IAF-PP H18/01/a0/014, IAF-PP H18/01/a0/K14 ve MedCaP-LOA-18-02) Hanry Yu'ya fon sağladı. Ng Chan Way, Singapur Ulusal Üniversitesi'nde araştırma görevlisidir. Singapur Ulusal Üniversitesi Konfokal Mikroskopi Ünitesi ve Akış Sitometri Ünitesi'ne hepatosit saflık analizinde yardım ve tavsiyeler için teşekkür ederiz.

Tüm prosedürler ve hayvan barınağı, Singapur Ulusal Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin (IACUC) gerekliliklerine uygun olarak R15-0027 ve R19-0669 protokol numaraları altında gerçekleştirilmiştir.
1. Solüsyonların ve cerrahi aletlerin hazırlanması
<ol><li>Ultra saf su kullanarak Tablo 1'deki tamponları ve hücre kültürü ortamlarını hazırlayın.</li>
	<li>Kullanmadan önce kalsiyum içermeyen tamponu ve kollajenaz tamponunu ...

<ol>
	<li>Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. H., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+rat+hepatic+cells.">Isolation and primary culture of rat hepatic cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).</li><li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion.">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).</li><li>Green, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+primary+hepatocytes+from+human+tissue:+optimising+the+use+of+small+non-encapsulated+liver+resection+surplus.">The isolation of primary hepatocytes from human tissue: optimising the use of small non-encapsulated liver resection surplus.</a> Cell and Tissue Banking. 18 (4), 597-604 (2017).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).</li><li>Gopalakrishnan, S., Harris, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+liver+endocytosis+followed+by+purification+of+liver+cells+by+liver+perfusion.">In vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3138 (2011).</li><li>Wen, J. W., Olsen, A. L., Perepelyuk, M., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+rat+portal+fibroblasts+by+in+situ+liver+perfusion.">Isolation of rat portal fibroblasts by in situ liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3669 (2012).</li><li>Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+3D+collagen+sandwich+culture+of+primary+mouse+hepatocytes+to+study+the+role+of+cytoskeleton+in+bile+canalicular+formation+in+vitro.">Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60501 (2019).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+purification+of+immune+cells+from+the+liver.">Isolation and purification of immune cells from the liver.</a> International Immunopharmacology. 85 (95), 106632 (2020).</li><li>Salem, E. S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+mouse+hepatocytes+for+nascent+protein+synthesis+analysis+by+non-radioactive+L-azidohomoalanine+labeling+method.">Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive L-azidohomoalanine labeling method.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323 (2018).</li><li>Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethered+spheroids+as+an+in+vitro+hepatocyte+model+for+drug+safety+screening.">Tethered spheroids as an in vitro hepatocyte model for drug safety screening.</a> Biomaterials. 33 (7), 2165-2176 (2012).</li><li>Kegel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+isolation+of+primary+human+hepatocytes+and+corresponding+major+populations+of+non-parenchymal+liver+cells.">Protocol for isolation of primary human hepatocytes and corresponding major populations of non-parenchymal liver cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53069 (2016).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vertical-flow+bioreactor+array+compacts+hepatocytes+for+enhanced+polarity+and+functions.">A vertical-flow bioreactor array compacts hepatocytes for enhanced polarity and functions.</a> Lab on a Chip. 16 (20), 3898-3908 (2016).</li><li>Du, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+sandwich+culture+of+3D+hepatocyte+monolayer.">Synthetic sandwich culture of 3D hepatocyte monolayer.</a> Biomaterials. 29 (3), 290-301 (2008).</li><li>Tong, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constrained+spheroids+for+prolonged+hepatocyte+culture.">Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture.</a> Biomaterials. 80, 106-120 (2016).</li><li>Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar-flow+immediate-overlay+hepatocyte+sandwich+perfusion+system+for+drug+hepatotoxicity+testing.">Laminar-flow immediate-overlay hepatocyte sandwich perfusion system for drug hepatotoxicity testing.</a> Biomaterials. 30 (30), 5927-5936 (2009).</li><li>Gupta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+canaliculi+contract+autonomously+by+releasing+calcium+into+hepatocytes+via+mechanosensitive+calcium+channel.">Bile canaliculi contract autonomously by releasing calcium into hepatocytes via mechanosensitive calcium channel.</a> Biomaterials. 259, 120283 (2020).</li><li>Horner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Percoll+purification+on+isolation+of+primary+human+hepatocytes.">Impact of Percoll purification on isolation of primary human hepatocytes.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6542 (2019).</li><li>Osypiw, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpopulations+of+rat+hepatocytes+separated+by+Percoll+density-gradient+centrifugation+show+characteristics+consistent+with+different+acinar+locations.">Subpopulations of rat hepatocytes separated by Percoll density-gradient centrifugation show characteristics consistent with different acinar locations.</a> The Biochemical Journal. 304, 617-624 (1994).</li><li>Beal, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+animal+model+of+ex+vivo+normothermic+liver+perfusion.">A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541 (2018).</li><li>Hillebrandt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedure+for+decellularization+of+rat+livers+in+an+oscillating-pressure+perfusion+device.">Procedure for decellularization of rat livers in an oscillating-pressure perfusion device.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), e53029 (2015).</li></ol>

Genel olarak iki aşamalı kollajenaz perfüzyon prosedürü için özellikle dikkat edilmesi gereken birkaç nokta vardır. İlk olarak, karaciğeri rezeke ederken özel dikkat gösterilmelidir. İçeriğin sızması bakteriyel kontaminasyona neden olacağından gastrointestinal sistemin zarar görmediğinden emin olun. Ek olarak, hayvan prosedürü sırasında karaciğerin yüzeyini kaplayan Glisson kapsülüne zarar vermekten kaçının. Yırtık yeterince büyükse, ilişkisiz hepatositlerin kollajenaz tamponuna erke...

Primer hepatositler, karaciğer ile ilgili temel araştırmalar, hastalık tedavisi ve ilaç testi gibi uygulamalar için önemli araçlardır. Primer hepatosit izolasyonu için mevcut altın standart, Seglen tarafından 1970'lerde tanıtılan iki aşamalı kollajenaz perfüzyon prosedürü 1,2,3'tür 4. Bununla birlikte, bu prosedür teknik olarak zordur ve acemi cerrahlar tarafından yapıldığında yüksek bir başarısızlık oranına sahiptir. Bir perfüzyonun başarılı olduğu düşünülse bile, izolasyonlar arasında hepatosit canlılığında (tipik olarak% 60-95) ve verimde (200-300 g sıçan başına 0.5-5 x 108) ciddi farklılıklar gözlenebilir. Bu, aşağı akış deneylerinin kalitesini ve ölçeğini etkiler. Teknik prosedürün yanı sıra, ticari olarak temin edilebilen veya özel olarak inşa edilen izolasyon için kullanılan perfüzyon kurulumu, katkıda bulunan bir faktördür. Perfüzyon kurulumunun montajına, optimizasyonuna ve bakımına dikkat edilmelidir. Bu protokolün amacı, teknik prosedürün çok parametreli perfüzyon kontrolü ve iki aşamalı kollajenaz perfüzyon prosedürünün perfüzyon kurulumu yoluyla primer sıçan hepatositlerinin izolasyonları arasındaki başarı oranını ve stabiliteyi arttırmaktır.
Teknik açıdan, prosedürdeki en zor adım portal ven kanülasyonudur. Diğer adımlara gelince, iyi uygulamalara uyulması ve genel önlemler alınması durumunda izolasyonun stabilitesi geliştirilebilir. Bu nedenle, cerrahın işlem sırasında ortaya çıkabilecek çeşitli değişkenlere cevap verebilmesi için her adımın mantığının anlaşılması önemlidir.
Hepatositlerin ve karaciğer parankimal olmayan hücrelerin sıçan ve fareden izole edilmesi için çeşitli protokoller yayınlanmıştır 1,2,5,6,7,8,9. Bu protokollerde kullanılan perfüzyon kurulumlarının, perfüzyon borularının yeniden kullanımı, sıcaklık kontrolü ile ilgili problemler, perfüzyon parametrelerinin rutin optimizasyonuna duyulan ihtiyaç ve / veya portal ven kanülasyonu için uygun olmayan intravenöz (IV) kateter tipinin kullanılması gibi çeşitli dezavantajları vardı. Perfüzyon borularının yeniden kullanılması, özellikle boru uygun şekilde temizlenmemiş ve dezenfekte edilmemişse, kontaminasyon olasılığını artıracaktır. Boruların rutin olarak değiştirilmeden yeniden kullanılması, perfüzyon kurulumunu sızdıran boru veya konektörler, tıkanmış kabarcık tuzağı ve daralmış boru gibi sorunlara da maruz bırakacak ve bunların hepsi perfüzyon basıncını ve akış hızını önemli ölçüde azaltacak ve böylece karaciğer sindirim verimliliğini etkileyecektir. Sıcaklık kontrolü için bazı kurulumlarda sabit bir ısı kaynağı olmadan, önceden ısıtılmış tamponlar zamanla soğur ve bu da düşük kollajenaz aktivitesine ve sindirime yol açar. Diğer kurulumlar, tamponu ısıtmak için bir su sirkülatörüne bağlı ceketli bir cam kondenser kullansa da, hacimlidir ve dikkatli temizlik gerektirir. Kateterden çıkan tamponun sıcaklığı, basıncı ve akış hızı, stabil perfüzyon durumunu sağlamak için izolasyon başlamadan önce ölçülmeli ve optimize edilmelidir. Optimizasyondan sonra bile, parametreler operatörün eylemleri nedeniyle izolasyon sırasında yarı yolda değişebilir, böylece yetersiz perfüzyon ve sindirime yol açabilir. Çoğu IV kateter tipi portal ven kanülasyonu için uygun değildir, çünkü kanülasyon sırasında sürekli perfüzyona izin vermezler. Kanülasyon başarılı olduğunda cerrahı hemen bilgilendiremezler. Ayrıca, portal veni yumuşak kateter üzerinde deforme etmeden sabitlemek zordur.
Burada, standartlaştırılmış tek kullanımlık steril boru, hassas ve kararlı sıcaklık kontrolü için silikon ısıtıcı ceket, veri depolama ve yönetimi ile gerçek zamanlı izleme ve alarm sistemi ve kanülasyon sırasında portal damarı delerken sürekli perfüzyona izin veren özel bir IV kateterin kullanımı ile bu sorunları ele alıyoruz. Bildiğimiz kadarıyla, tüm bu özellikleri kompakt bir entegre perfüzyon sisteminde (IPS) birleştiren ilk grubuz, bu da onu son derece taşınabilir hale getiriyor ve aseptik çalışmayı sağlamak için laminer bir akış davlumbazına sığdırılabiliyor.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Nipro</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>Nipro</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black braided silk non-absorbable, non-sterile surgical suture</td>
			<td>Look</td>
			<td>SP117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bochem 18/10 stainless steel forceps, sharp tip contain bent round tip</td>
			<td>Bochem</td>
			<td>10333511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Perfusion Set</td>
			<td>Vasinfuse</td>
			<td>BPF-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floating circular 1.5 mL microcentrifuge tube rack</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>German Standard Tissue Forceps, Serrated / 1&#215;2 teeth , 14.5cm</td>
			<td>Walentech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Cellstar aspirating pipette</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GN710183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrated Perfusion System</td>
			<td>Vasinfuse</td>
			<td>IPS-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors curved, stainless, 11cm</td>
			<td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td>
			<td>CVD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope with 10X lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh Sheet 100&#181;M Nylon</td>
			<td>Spectra-Teknic(s) Pte Ltd</td>
			<td>06630-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors, BL/BL, 13cm</td>
			<td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td>
			<td>STR &#8211; BL/BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors, SH/BL, 13cm</td>
			<td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td>
			<td>STR &#8211; SH/BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse force hemostatic clip</td>
			<td>Shanghai Jin Zhong Pte Ltd</td>
			<td>XEC230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents/Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>137101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17104019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>TCI</td>
			<td>D1961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31600-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11344-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1-9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC26764.298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type I bovine collagen</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>William&#8217;s E Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W1878</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary rat hepatocytes with multiparameter perfusion control

Primer hepatositler, karaciğer hastalıkları üzerine yapılan temel araştırmalarda ve in vitro toksisite testlerinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Primer hepatosit izolasyonu için iki aşamalı kollajenaz perfüzyon prosedürü, özellikle portal ven kanülasyonunda teknik olarak zordur. Prosedür ayrıca perfüzyon kurulumunun montajı, optimizasyonu veya bakımındaki zorluklar nedeniyle ara sıra kontaminasyona ve perfüzyon koşullarındaki değişikliklere eğilimlidir. Burada, çok parametreli perfüzyon kontrolü ile geliştirilmiş iki aşamalı kollajenaz perfüzyon prosedürü için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Primer sıçan hepatositleri, prosedürün kritik aşamalarında gerekli teknik önlemler alınarak ve özel bir intravenöz kateter, standartlaştırılmış steril tek kullanımlık boru, sıcaklık kontrolü ve gerçek zamanlı izleme ve alarm sisteminin benimsenmesi yoluyla operasyonel zorluğu azaltarak ve perfüzyon parametrelerinin değişkenliğini azaltarak başarılı ve güvenilir bir şekilde izole edildi. İzole primer sıçan hepatositleri sürekli olarak yüksek hücre canlılığı (% 85-% 95), verim (200-300 g sıçan başına 2-5 x 108 hücre) ve işlevsellik (albümin, üre ve CYP aktivitesi) sergiler. Prosedür, aseptik çalışmayı sağlamak için laminer akış davlumbazına kurulabilecek kadar kompakt olan entegre bir perfüzyon sistemi ile tamamlandı.

Bir cerrah, belirli adımlardan sonra sonucu gözlemleyerek karaciğer perfüzyonunun sorunsuz bir şekilde devam edip etmediğini söyleyebilir. İlk sonuç kanülasyon, infrahepatik IVC'nin kesilmesi ve perfüzyon akış hızının geri kazanılması üzerine gözlemlenebilir. Karaciğer, hacmini korurken koyu kırmızıdan kahverengiye tamamen renk değiştirmiş olmalıdır. Karaciğer hafifçe sönük görünüyorsa ve kırmızımsı bir renk tonu veya kırmızı lekeleri varsa, perfüzyon akış hızının yanlış...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control at JoVE.com

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Bu protokol, özel bir intravenöz kateter, standartlaştırılmış steril tek kullanımlık tüp, gerçek zamanlı izleme ile tamamlanan sıcaklık kontrolü ve izole primer sıçan hepatositlerinin yaşayabilirliği, verimi ve işlevselliğindeki tutarlılığı artırmak için iki aşamalı kollajenaz perfüzyon prosedürü için bir alarm sisteminin kullanımını detaylandırmaktadır.

Primer Sıçan Hepatositlerinin Çok Parametreli Perfüzyon Kontrolü ile İzolasyonu

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...

Bu sıçan hepatosit izolasyon protokolü, sindirim yaklaşımından önce karaciğer rezeksiyonuna dayanmaktadır. Protokol, hücre izolasyonu için kompakt ve taşınabilir entegre bir perfüzyon sistemi sunar. Bu teknik, kollajenaz kullanım hacmini azaltan kollajenaz resirkülasyonunu içerir ve yüksek yerçekimi verimi ve hepatositlerin spesifik fonksiyonunu sağlarken sindirim süresinin uzatılmasında daha fazla esneklik sağlar.Sıçanı kaputun içine koyun. Karın kaslarını kestikten sonra, bağırsakları kavisli forsepslerin arkasıyla sağa doğru itin. Safra kanalının altındaki zarı, dikişi portal ven ve safra kanalı etrafında ilmek için kavisli forsepslerin ucuyla kırın.Portal venin etrafında, karaciğere yakın çok gevşek bir ligatür yapmak için, damar farklı karaciğer loblarına sola ve sağa dallanmadan hemen önce ipek bir cerrahi sütür kullanın. Gastrik ven portal venden ayrılmadan hemen önce, ilk ligatür yukarı doğru yaklaşık iki ila üç santimetre yukarı doğru dalar, portal venin altındaki dokudan iki çift kavisli forseps uçlarıyla bir delik oluşturur. Daha sonra kanülasyon sırasında portal damarı desteklemek için deliği gerin.Dakikada yaklaşık üç mililitrelik bir akış hızı için pompa hızını dört RPM'ye düşürerek karaciğerde basınç birikmesini önleyin. Ve kalsiyum içermeyen tamponun intravenöz kateterden çıkışının yavaş bir damlamaya indirgendiğinden emin olun. Portal veni forseps ile nazikçe desteklerken, intravenöz kateteri iğnenin eğimi yukarı bakacak şekilde tutun.Ve iğneyi portal damara 10 ila 20 derecelik bir açıyla yerleştirin. Sonra tüm eğim damarın içine girene kadar yavaşça ilerleyin. Doğru yerleştirme, karaciğer renginin ağartılmasına neden olmalıdır.Kanülü iğnenin üzerine ilerletin ve kateteri baş parmak ve orta parmakla tutarken kanülü işaret parmağıyla geri çekerek iğneyi kanülün arkasına geri çekin. Portal damarı, perfüzyon akışının bozulmasını önlemek için portal damarın altındaki bir damar klipsi ve klipsi ile kateterin üzerine sabitleyin. Daha sonra, karaciğerde basınç birikmesini önlemek için infrahepatik inferior vena kavayı kesin ve doğru kesimi sağlamak için kan fışkırtma dürtülerini gözlemleyin.Dakikada yaklaşık 33 mililitre akış hızı için pompa hızını 38 RPM'ye yükseltin. Ve infrahepatik inferior vena kavayı forseps ile iki ila üç saniye kapatarak karaciğeri üç kez yıkayın ve sonra tekrar açın. Tüm karaciğer loblarını perfüze etmek için, kanül ucunun pozisyonunu ayarlayın ve portal ven dallarından önce farklı karaciğer loblarına yerleştirildiğinden emin olun.Daha sonra, portal venin etrafındaki gevşek bağı dallanma noktasının hafifçe yukarı doğru doğru sıkın ve sert iğnenin kanülü desteklediği noktada, eğim ve yan delik arasında üç düğüm yaparak tamponun geri akışını önlemek için kanülün portal damardaki konumunu sabitleyin. Karaciğer rezeksiyonundan sonra karaciğerin 12 dakika boyunca kalsiyum serbest tamponu ile perfüzyona girmesine izin verin. Daha sonra, kalsiyum içermeyen tamponun silindir kelepçesini sıkın ve perfüzyon tamponunu değiştirmek için kollajenaz tamponunun silindir kelepçesini gevşetin.Kollajenaz tamponu karaciğere ulaştıktan sonra, suprahepatik inferior vena kavayı iki ila üç saniye kapatıp tekrar açarak karaciğeri üç kez yıkayın. Kateteri desteklerken diyaframı forseps ile tutarak, kazara ayrılmayı önlemek için kateteri çekmemeye özen göstererek karaciğeri kollajenaz tamponunun devridaimi için beherin üstündeki aşamaya dikkatlice hareket ettirin. Karaciğeri 12 dakika boyunca sindirin ve karaciğer pürüzsüz kahverengi dokusunu kaybettiğinde ve küflendiğinde perfüzyonu durdurun.Gerekirse sindirim süresini uzatın. Karaciğerin sindiriminden sonra portal damar kesilerek kanülü dikkatlice çıkarın. Ve sonra hepatositleri izole etmek için karaciğeri soğuk DMEM'e aktarın.Parıltı kapsülünü kırmak ve soymak için kavisli forsepslerin arka tarafını kullanarak karaciğere hafifçe dokunun. Ve hücreler medyada tamamen ayrışana kadar karaciğeri DMEM'de hafifçe sallayarak karaciğer hücrelerini serbest bırakın. Hepatositlerin yaşayabilirliği, gezi ve mavi sayımı ile belirlenen% 88 ila% 94.8 arasındaydı.200 ila 300 gram ağırlığındaki sıçanlardan hepatositlerin verimi, izolasyon başına sekizinci hücrelere beş kat 10 kadardı. Temsili görüntüler saflaştırılmamış karaciğer hücresi süspansiyonunu ve saflaştırılmış hepatosit süspansiyonunu göstermektedir. İzole hepatositlerin saflığı yaklaşık% 96.8 idi ve albümin pozitif floresan boyalı hücrelerin hücre çekirdeğinin toplam sayısına göre sayılmasıyla ölçüldü.Yanlış renkte gösterilen temsili görüntülerde, yeşil albümini temsil eder ve mavi, albüminli hücre çekirdeklerini gösterir. Albüminsiz hücre çekirdekleri kırmızı renkle vurgulanır. Sandviç kültüründeki hepatositler farklı safra kanalikülleri oluşturdu ve iyi hücre hücre temasına sahipti.Albümin, üre ve sitokrom P450 tahlillerinde gösterildiği gibi, hepatositler yüksek üre ve albümin sekresyonu sergiledi. Üçüncü günde, hepatositler CYP1A2, CYP2B1 / 2 ve CYP3B2 için yüksek enzim aktiviteleri sergiledi. İğneyi portal damara sokmadan önce zihinsel olarak hazırlıklı olun.Yerleştirildikten sonra, bir cerrahın IVC'yi kestikten sonra pompa hızı artana kadar nabız olmadan devam etmesi gerekecektir.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Yetişkin Sıçan Kalp miyositler İlköğretim Kültür

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Sıçan Portal Fibroblastlar izolasyonu ile<em&gt; Yerinde</em&gt; Karaciğer Perfüzyon

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Sıçan Karaciğer Hücreleri İzolasyon ve İlköğretim Kültür

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Primer Tümörler gelen Bağışıklık Hücre İzolasyonu

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells

Kanal Hücreleri Toplama kültür İlköğretim Rat İç Medüller

Arginine-vasopressin (AVP) facilitates water reabsorption by renal collecting duct principal cells and thereby fine-tunes body water homeostasis. AVP ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Fare Primer Pankreas Asiner Hücreleri İzolasyon ve Kültür

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

Bir iki aşamalı kolajenes perfüzyon prosedür ile insan Hepatositlerin İzolasyonu

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

İzolasyon ve Fare aort endotel hücreleri İlköğretim Kültür

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Fare İlköğretim Hepatositlerde Yağ Asidi Oksidasyon ve lipogenez Belirlenmesi

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

İlköğretim İnsan Hepatositlerin İzolasyonu ve Non-parankimal karaciğer hücrelerinin Binbaşı popülasyonları İlgili Protokolü

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...