Name: confocal laser scanning microscopy of calcium dynamics in acute mouse pancreatic tissue slices
Uploaded: 2021-04-13T13:30:00
Duration: 10 min 49 s
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本研究中介绍的工作得到了斯洛文尼亚研究机构的财政支持（研究核心资金Nos.P3-0396和I0-0029，以及研究项目编号。J3-9289、N3-0048 和 N3-0133）和奥地利科学基金 /Fonds zur Förderung der Wissenschaftlichen Forschung（双边赠款 I3562--B27 和 I4319--B30）。我们感谢Maruša Rošer、Maša Čater和Rudi Mlakar提供的出色技术援助。

作者声明，该研究是在没有任何商业或经济利益的情况下进行的。

胰腺组织切片法是一种快速实验方法，用于研究胰腺内分泌和外分泌部分的形态和生理学，以更保守的原位制备。引言中已经指出了许多优点。值得指出的是，一般来说（即，不仅用于钙成像），研究胰腺生理学的切片方法可以节省时间，因为它不涉及隔离后的恢复期。后者对于所有类型的实验和使用来自不同物种的分离胰岛并不是绝对必要的，但通常用于提高纯度，恢复活力和功能，有时用于从几个供体收集胰岛59，60，61，62，63，64.然而，在钙成像的背景下，已经发现β细胞反应取决于培养的持续时间和条件，这是使用分离的胰岛15，65时应考虑的重要变异源。如果组织切片的长期培养在未来成为广泛使用的选择，则应考虑同样的问题22，36。组织切片方法也具有高产量，因此可以潜在地减少动物痛苦并提高统计能力。此外，由于切片可以从单个动物中制备，并且由于切片可以存活很长时间，包括实验组和对照组中的相同动物甚至相同的胰岛变得可行。
由于保留了原始结构和细胞间通讯，并且由于它与许多结构分析，电生理学，成像方法和激素分泌测定兼容，因此该方法对于研究依赖于单个细胞之间不受干扰的相互作用的胰腺功能特别有用，例如，对分泌物的敏感性，旁分泌和不同细胞类型之间的免疫相互作用， 电活动的模式，钙动力学的性质以及不同激素的分泌。特别是对于钙成像，使用切片的主要优点是胰岛核心的暴露以及以高分辨率从许多不同细胞类型获取信号的可能性。根据实验的要求和动物的年龄，厚度可以变化，切片可以转染，或者从具有遗传编码报告基因的动物中获得。正如下面更详细地解释的那样，后两种方法还能够特异性地识别和表征来自非β细胞 31，66的反应。此外，可以研究来自器官明确定义的部分的胰岛，以了解对疾病的反应性或易感性的差异。虽然它们不需要恢复潜伏期，但它们可以很容易地与不同的药理学药物，脂肪酸，高糖和细胞因子一起孵育。
最重要的是，由于高分辨率可以与单细胞甚至亚细胞分辨率结合使用，因此切片中的共聚焦钙成像是分析钙波，功能连接以及胰岛不同部分细胞的不同功能角色的最合适方法之一54，67。尽管具有许多优点，但组织切片方法具有重要的局限性。首先，它仍然至少部分地破坏胰岛和外分泌结构，特别是在切割表面，并且在制备过程中需要采取预防措施，例如低温，频繁交换溶液以及温和快速的操作，以防止额外的机械和内源性酶损伤。其次，与体内方法相比，营养和促泌剂递送的模式仍然不如体内途径，制剂与全身神经支配分离，器官间反馈（例如胰岛与其靶组织之间）是不可能的。第三，最大切片厚度受氧化，营养物质输送和pH调节在〜200μm9处的限制。此外，切片的制备和成像都需要大量的培训，并且从长时间序列和许多细胞中对钙数据进行深入分析需要专业知识，这些知识通常不包括在经典生理学家的工具包中，需要物理学家或数据科学家的帮助。由于感兴趣区域中存在来自其他细胞的信号，保持同型和异型相互作用的优势也可能使样品分析复杂化。根据方案的不同，其他细胞的活化可以导致间接的额外刺激或抑制观察到的细胞。
这只能通过反卷积方法，通过更复杂的刺激方案（包括阻断某些间接效应的物质），通过使用特定的敲除动物，以及通过将结果与其他采用更简化方法的研究结果仔细比较来最终解决。此外，如果需要进行分泌物测量，应记住，某些切片可能缺少胰岛，并且单个切片中内分泌组织的总质量通常较低。用于成像的急性胰腺组织切片的制备涉及以下各节中讨论的几个关键步骤，并在 表1中总结，读者还可以在其中找到简短但重要的故障排除提示。首先，在制备琼脂糖溶液时，琼脂糖粉末必须完全溶解，否则未溶解的颗粒可能会阻碍注射。将均匀的琼脂糖溶液保持在37-45°C，一方面防止琼脂糖因温度过低而硬化，另一方面防止由于温度过高而造成的组织损伤。使用后，剩余的琼脂糖可以储存在4°C并重新加热，尽管反复再加热可导致由于水分蒸发而增加密度，最终使注射变得困难或不可能。
制剂的下一个关键步骤是正确夹紧主要的十二指肠。十二指肠上的白点表示胆总管和十二指肠的交界处。夹子放置得太近会导致共同导管的一些外侧胰腺分支阻塞，使这些部位的注射无效，而放置得太远的夹子会导致琼脂糖通过较低的阻力路径直接泄漏到十二指肠。在胆总管插管之前，可以小心地去除周围的脂肪组织，以便更好地可视化胆管并在注射过程中更好地控制。去除周围组织时精度不足可能导致导管穿孔。用于琼脂糖注射的针径的选择也很重要。在小鼠中，优选使用30G针头;较小的（32 或 33 G）针头由于琼脂糖溶液粘度高而需要更多力气，并且更容易阻塞。然而，如果与低密度琼脂糖溶液结合使用，它们对较小的小鼠品系和年轻动物非常有帮助。在最初的产后几天，琼脂糖也可以通过囊下注射而不是管内注射2。在小鼠中使用直径较大的针头很可能导致胆总管受损。使用正确的针径也可以发生这种情况，并且镊子可以帮助在注射过程中将针头保持在适当的位置。在大鼠导管较大的情况下，较大直径的针头可能是唯一的解决方案。如果针太窄，无法确保紧密密封以防止背部泄漏，则在成功进入导管后，可以在其周围放置结扎。
琼脂糖注射由于溶液的粘度而需要一些努力，一旦注射过程开始，就不应中断，因为低熔点琼脂糖溶液可能会在注射完成后在针状物或导管树的最大部分中固化。这将导致组织穿透力差，切割过程中的支撑力较差。胆管应始终在左肝管和囊性导管连接形成胆总管的点进行插管。如果胆总管穿孔，反复尝试在靠近十二指肠的地方插管。当胰腺用琼脂糖溶液充分稳定并从腹膜腔中提取时，切割小块注射良好的组织。在将它们嵌入琼脂糖之前，去除所有脂肪和结缔组织至关重要，因为它们的残留物使切片更具挑战性。这同样适用于血管和导管残留物，除非它们是实验的焦点。在这种情况下，请确保以这样的方式放置它们，以获得所需的横截面。当将组织嵌入琼脂糖中时，请确保温度合适（37°C），并且组织完全被琼脂糖包围，因为振动切片过程中的力可以从琼脂糖块中撕出胰腺组织。
在将纸巾块放入琼脂糖中之前，通过将它们短暂地放在纸巾上来快速干燥纸巾块可以帮助防止在此步骤中组织与琼脂糖之间的不良接触。在琼脂糖块凝固过程中，水平放置培养皿，并防止胰腺组织与培养皿底部之间的接触。如果胰腺没有完全注射，切割过程将具有挑战性。因此，尝试降低切割速度以获得组织切片。为了尽量减少振动切片过程中的细胞损伤，请定期更换切片室中的ECS（以及由ECS制成的冰块）。后者会降低切片过程中从腺泡组织释放的胰腺酶的活性。切片的厚度也至关重要。对于钙动力学和电生理学实验，通常切割140μm切片;然而，根据研究的目的，切片厚度的范围可以从90μm到200μm。请记住，在较厚的切片中，氧气和营养物质的扩散将受到限制，但它们将包括更多的组织。此外，未切割的胰岛的比例可能随着切片厚度的增加而增加。切片可以在室温下在定期交换的ECS中储存数小时，甚至可以在适当的细胞培养基中培养数天;然而，这可能最终影响正常的胰岛细胞生理学3，22。
制备染料溶液时，请确保仔细混合所有组分，并避免暴露在环境光下。胰腺切片由许多细胞层组成，并且钙染料的摄取仅限于前几个最浅的细胞层，如前所述，用于分离的胰岛58，68和垂体切片69。然而，与孤立的胰岛相反，周围的胶囊和外细胞层阻碍染料渗透到更深层中，组织切片允许进入胰岛的整个横截面表面，从而能够同时测量来自胰岛所有层的数百个细胞中的钙动力学。荧光 Ca2+ 指示剂是用于测量钙动力学的最广泛用途，与 CLSM 一起，它们可以实现高时间分辨率的记录，达到数百赫兹。在选择最合适的荧光Ca2+指示剂时，应考虑不同的因素，包括影响细胞上样方法的指示剂形式，测量模式（定性或定量）以及需要在感兴趣的Ca2 +浓度范围内并取决于pH，温度，Mg2 +和其他离子存在的解离常数（Kd）， 以及蛋白质结合。由于细胞Ca2+信号通常是瞬态的，因此还应考虑Ca2+结合速率常数。为了测量胰腺细胞中的[Ca2 +]IC动力学，该组主要使用本方案（材料表）中描述的细胞渗透性Ca2 +指示剂染料，因为它是一种长波长指示剂，其发射波长在光谱中通常细胞自发荧光问题较少，并且激发光的能量较低，这降低了细胞光损伤的可能性。由于这种染料在低Ca2 +浓度下是荧光的，这有助于测定基线[Ca2 +]IC，并在刺激前增加细胞可见性。结合Ca2+后，染料的荧光强度增加14倍，即使[Ca2+]IC的微小变化也能被检测到。
为了成功进行活细胞钙成像，需要考虑几个关键的硬件参数，如方案部分所述。对于信号振幅低且光毒性几率高的活细胞成像，优选使用具有较高NA的物镜从标本中收集更多光。如果必须以高时间分辨率记录钙动力学，请使用共振扫描器而不是线性振镜。除了选择合适的物镜外，使用高灵敏度探测器（例如需要较少激光功率的混合探测器）还可以避免光毒性和光漂白。这对于持久的钙成像特别重要。钙成像中的其他重要步骤是时间序列采集的图像质量的参数设置。最重要的是时间和空间分辨率。由于钙动力学本身决定了可接受的最低时间分辨率，因此采样率需要至少比预期信号频率高两倍才能检测到信号，甚至需要高出10倍才能可靠地检测信号的形状。在急性胰腺组织切片中，钙动力学可以同时在数百个细胞中测量，因此，空间分辨率也很重要。这可以通过增加像素数或在实时采集期间增加行平均来增强。但是，由于空间分辨率和时间分辨率之间存在反比关系，因此需要在两种设置之间进行权衡。
如果必须在胰腺内的特定细胞群中进行钙成像，则需要能够功能性地分化切片内细胞的刺激。高葡萄糖可靠且快速地激活β细胞以振荡模式，该模式叠加在升高的钙水平上，并且在胰岛32，58，70内的所有细胞之间高度同步。β细胞是胰岛内数量最多的细胞类型，主要位于小鼠的胰岛核心中。相同的刺激方案减少，有时不会明显改变α细胞30，32，58，70，71，72的爆发。为了在功能上区分α细胞，可以使用低（3mM）葡萄糖，谷氨酸或肾上腺素来增加其频率或基础[Ca2 +]IC21，72，73，74，75。它们占胰岛细胞的10-20%，并将在胰岛外围1检测到。在外围也发现Δ细胞。它们仅占胰岛内分泌细胞总数的约5%，并且通常在6mM葡萄糖中活跃，并且对葡萄糖刺激的反应与基线相比增加的不规则爆发活性或钙水平略微升高1，32，71，76。Ghrelin可用于钙成像实验中δ细胞21，77，78，79的特异性刺激。然而，PP和ε细胞特异性功能鉴定的方案仍有待定义。此外，25 nM乙酰胆碱可靠地激活腺泡细胞以产生35，80，81的爆裂活性。此外，许多其他促分泌物，如蔚蓝，胆囊收缩素和氨基甲酰胆碱，可用于唤起腺泡细胞中的钙反应22，40，82，83。
最后，1 mM鹅去氧胆酸可靠地唤起组织切片中导管细胞中的钙反应;血管紧张素II，ATP和其他一些促分泌剂也可以使用11，23，84，85。每当基于对特定促分泌剂和抑制剂的特征反应的功能鉴定还不够时，遗传标记的动物31，转染的细胞73或免疫细胞化学可用于鉴定不同的细胞类型9，22，71，86.在过去的几年中，组织切片方法已成功适应人体组织，在外分泌41和内分泌生理学9，36，37，39中开辟了许多新的重要研究途径。有趣的是，对人类胰岛钙动力学的详细评估是出了名的困难，并且仍有待更详细地研究87。结合先进的共聚焦显微镜，胰腺组织切片方法已经对小鼠的钙动力学有了许多新的见解，并有望为人体组织做同样的事情。

哺乳动物胰腺是一个大的外分泌和内分泌腺。外分泌部分占胰腺总体积的96-99%，由acini和导管组成。内分泌部分由大量的朗格汉斯胰岛组成，占胰腺总体积的1-4%1。外分泌部分分泌主要的消化酶，分解食物中富含能量的聚合物，以及富含碳酸氢盐的液体，与其他胃肠道分泌物结合，提供适合酶作用的环境。内分泌部分分泌激素，调节餐后分布，储存和餐间富含能量的营养素的释放。虽然外分泌组织相对不发达，内分泌在出生时相对发达，但前者在断奶后迅速过度生长2，3，4。对胰腺功能的早期研究标志着现代生理学的诞生，该领域的主要方法学进步之后是主要的科学突破5。由于腺体结构错综复杂，与胰腺一起工作在技术上具有挑战性，但由于胰腺癌，胰腺炎和糖尿病等疾病对公共卫生构成重大威胁，因此也是一个很大的动机，并且需要新的治疗方法。
分离的胰岛6，acini7，8和导管碎片已被开发并用作金标准方法，因为它们与细胞系和原代分散的内分泌，腺泡和导管细胞相比具有优势9，10。尽管分离的细胞集合体的功能显着改善，但这些方法仍然涉及相当大的机械和酶应激，从周围组织中分离细胞，因此缺乏旁分泌相互作用和机械支持，最重要的是，伴随着正常生理学的显着变化11，12，13.急性小鼠胰腺组织切片是在2001年开发的，因为人们认为需要开发一种类似于大脑，垂体和肾上腺切片的实验平台，具有保留的细胞间接触，旁分泌相互作用，间充质和组织结构，并且没有一些最重要的缺点金标准方法在那个时间的胰岛研究中 - 分离的胰岛12，14.这些缺点包括对最外层的破坏，核心胰岛区域缺乏可及性，以及需要培养可能对细胞身份和生理学有重要影响12，15。此外，组织切片方法能够研究具有严重紊乱的胰岛结构的动物模型，其中不可能分离胰岛，或者当胰岛产量极低时，传统分离16，17，18，19，20，21。
此外，切片更适合研究糖尿病和胰腺炎发展过程中的形态变化，例如，因为它可以更好地概述整个组织，并且还与研究区域差异相容。重要的是，尽管早期关注内分泌部分，但组织切片方法固有地能够研究外分泌成分9，22，23。在引入后的第一个十年中，该方法被用于β14，24，25，26，27，28，29和α30，31细胞的电生理学研究以及检查胰腺的形态和功能成熟2，3.十年后的2013年，该方法成功地适用于胰岛细胞的活细胞钙成像，使用CLSM表征其对葡萄糖32的反应，其功能连接模式33，以及膜电位与细胞内钙之间的关系，通过将荧光钙染料与膜电位染料34相结合。同年晚些时候，该方法还用于评估腺泡细胞22，35中的钙动力学。在接下来的几年中，胰腺组织切片已被用于许多不同的研究，并成功地适应了猪和人体组织的9，36，37，38，39，40，41。然而，综合来看，钙成像 - 在小鼠胰腺组织切片中，特别是在胰岛中 - 仍然主要由该组进行。其中一个主要原因可能在于技术上具有挑战性的组织切片制备，对共聚焦显微镜的需求以及相当复杂的数据分析的组合。本文件的主要目的是使其他潜在用户更容易获得这种强大的方法。
已经有一些优秀的方法学文章详细处理了组织切片的制备和使用切片进行结构和分泌研究，但没有用于共聚焦钙成像9，42，43。因此，本文重点介绍了切片制备过程中的一些额外技巧和窍门，成功上浆染料、图像采集的关键步骤，以及基础钙数据分析的主要步骤。因此，应将这种贡献视为对上述方法的补充，而不是替代。同样，小鼠胰腺组织切片中的钙成像应被视为一种用于回答特定问题的实验方法，因此是对胰腺生理学中其他钙成像方法的补充，而不是绝对的替代方案，例如孤立的导管或acini，孤立的胰岛，类器官，移植到眼睛前房的胰岛， 和体内记录11，44，45，46，47，48。钙成像在小鼠胰腺组织切片中的前景可能最好地说明，最近成功记录了胰岛间充质细胞（如周细胞49 和巨噬细胞50）以及导管细胞23中的钙动力学。

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance KERN ALJ 120-4</td>
			<td>KERN &#38; SOHN GmbH</td>
			<td>ALJ 160-4A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope Leica TCS SP5 II Upright setup</td>
			<td>Leica</td>
			<td>5100001578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope Leica TCS SP5 AOBS Tandem II setup</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork pad 15 cm x 15 cm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>CLS430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Round Ice Bucket with Lid, 4 L</td>
			<td>Fischer Scientific, Leicestershire, UK</td>
			<td>432124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge razor blade</td>
			<td>Personna, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes 0.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 121.023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask 200 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>027.01.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - ToughCut</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat orbital shaker&#160; IKA KS 260 basic</td>
			<td>IKA</td>
			<td>Ident. No.: 0002980200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass lab bottle 1000 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>091.01.901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hartman Hemostat, curved</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>13003-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX APO L 20x/1.00 W HCX APO L (water immersion objective, 20x, NA 1.0)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15507701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring cylinder 25 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>015.01.025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator Control box SM-7, Keypad SM-7</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>&#160;200-100 900 7311, 200-100 900 9050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave owen</td>
			<td>Gorenje, Slovenia</td>
			<td>MO20MW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer Gonotec 010</td>
			<td>Gonotec, Berlin, Germany</td>
			<td>OSMOMAT 010 Nr. 01-02-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush</td>
			<td>Faber-Castell, No.2</td>
			<td></td>
			<td>Any thin soft round paint brush No.2, preferably black</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perifusion pumps</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>ISM 827</td>
			<td>Reglo Analog MS - 4/8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100/20 mm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35/10 mm</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>627102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35 x 10 mm Nunclon Delta</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA</td>
			<td>153066</td>
			<td>NON-STICKY for agarose blocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter inoLab pH Level 1</td>
			<td>WTW, Weilheim, Germany</td>
			<td>E163694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 1000 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3121 000.120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 50 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3121 000.066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Push pins 23 mm</td>
			<td>Deli, Ningbo, China</td>
			<td>E0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tube, 15 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semken Forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>11008-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stabilizing ring for Erlenmeyer flask</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>027.11.048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope Nikon SMZ 745</td>
			<td>Nikon, Melville, NY USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Injekt Solo 5 mL</td>
			<td>Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>4606051V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle 0.30 x 12 mm (30 G x 1/2&#34;)</td>
			<td>Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>4656300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>200-100 500 0150, 200-150-500-145</td>
			<td>Slice mini chamber, Temperature controller TC 07</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubings for perifusion system</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>SC0310</td>
			<td>Ismatec Pharmed 1.14 mm(ID) + silicone tubing 1.0 (ID) x 1.8 mm(OD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath Studio GT-7810A</td>
			<td>Globaltronics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrotome Leica VT 1000 S</td>
			<td>Leica, Nussloch, Germany</td>
			<td>14047235613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetric flask 1000 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>013.01.910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer Neolab 7-2020</td>
			<td>Neolab</td>
			<td>&#160;7-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath Thermo Haake open-bath circulator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Z527912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material/Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate - CaCl2.2H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4540-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-lactic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>L1250-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas mixture containing 95% O2 and 5% CO2 at barometric pressure</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue Wekem sekundenkleber WK-110</td>
			<td>Wekem GmbH, Bergkamen, Germany</td>
			<td>WK 110-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>H3375-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(+)-ascorbic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>A9,290-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate - MgCl2.2H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>M2670-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myo-inositol</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>I5125-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon Green 488 BAPTA-1, AM</td>
			<td>Invitrogen (Thermo FisherScientific)</td>
			<td>O6807</td>
			<td>cell-permeable Ca2+ indicator (excitation/emission: 495/523 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO)</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td>polaxamer: nonionic triblock copolymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride - KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>31248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaPlaque GTG agarose</td>
			<td>Lonza, Rockland, USA</td>
			<td>50111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate - NaHCO3</td>
			<td>Honeywell, Germany</td>
			<td>31437-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride - NaCl</td>
			<td>Honeywell, Germany</td>
			<td>31434-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide - NaOH</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>30620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic- NaH2PO4</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>S0751-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>15990-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>FIJI is an open source project</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LASAF</td>
			<td>Leica microsystems, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python</td>
			<td>Python Software Foundation</td>
			<td></td>
			<td>Python is an open source project</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal laser scanning microscopy of calcium dynamics in acute mouse pancreatic tissue slices

急性小鼠胰腺组织切片是一种独特的原位制剂，具有保留的细胞间通讯和组织结构，与典型体外研究中描述的分离胰岛，acini，导管或分散细胞相比，其需要的制剂诱导的变化显着更少。通过在共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）中将急性胰腺组织切片与活细胞钙成像相结合，可以同时在大量内分泌和外分泌细胞中研究钙信号，具有单细胞甚至亚细胞的分辨率。灵敏度允许检测变化，并能够研究细胞间波和功能连接，以及研究细胞生理反应对胰岛内定位的依赖性以及与其他细胞的旁分泌关系。最后，从动物福利的角度来看，一次记录来自大量细胞的信号可以降低实验中所需的动物数量，从而有助于3R替代，减少和细化原理。

将琼脂糖溶液注射到胰管中是胰腺组织切片制备中最关键的步骤。成功的注射可以通过胰腺组织的增白来识别，如图 3A的左侧所示，而胰腺的不完全注射部分则出现在 图3A的右侧。朗格汉斯胰岛可以通过肉眼或在立体显微镜下识别，这有助于切割胰腺的适当部分，以便随后嵌入琼脂糖块中（图3B）。在新鲜切割的小鼠胰腺组织切片中，可以很容易地将朗格汉斯胰岛与周围的外分泌组织和间充质区分开来，在立体显微镜下为白点（图3C）或在光学显微镜下作为褐色结构（图3D）。胰腺组织切片可用于不同类型的实验，切片后至少12小时。除了在立体显微镜，光学显微镜下的大体形态学评估以及钙成像过程中细胞的功能反应外，还可以评估胰腺组织切片的活力（图4）。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig04.jpg"> 图4：组织切片内细胞的活力。 用活/死测定测定测定细胞的活力。活细胞被钙黄绿素AM染色（以绿色显示），而死细胞用同源二聚体-1染色（以红色显示）。黄线表示 Z 轴堆叠的 X-Y 横截面的位置，显示在底部和右侧。Z 轴堆叠的完整深度为 88 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig04large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的放大版本。</a>
对于钙成像实验，荧光钙指示剂需要穿透几层细胞。图5A显示细胞渗透性Ca2 +指示剂染料成功加载到胰腺组织切片中，其中可以识别单个胰岛和腺泡细胞。相比之下，由于染料渗透不成功（图5B），缺乏胰岛细胞（图5C）以及表面上存在大量坏死组织（图5D），图5B-D中的切片不是最佳的。这种切片可以被丢弃，检查是否存在其他被切割或染色更好的胰岛（参见表1进行故障排除），或用于记录外分泌细胞的反应。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig05.jpg"> 图5：可用和不可用制剂的实例。（A）在朗格汉斯胰岛以及导管细胞和周围腺泡组织中具有染色良好的细胞成功制备胰腺组织切片的一个例子。（B）染色不良的组织切片的一个例子。（C）具有结构中断的朗格汉斯小岛的例子。（D）一个包含许多死细胞和大量碎片的朗格汉斯小岛的例子。右侧的“发光，发光下”查找表以绿色显示 0 强度，以蓝色显示饱和度。比例尺 = 100 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
使用细胞渗透性Ca2 +指示剂染料进行钙成像的代表性结果如图6所示。在图6A中，呈现了胰腺组织切片的高分辨率图像，其中包含朗格汉斯胰岛，腺泡组织和胰管。为了更好地区分，图6A中呈现的胰腺组织切片的内分泌，外分泌和导管部分在图6B中着色。使用适当的刺激可以在功能上区分不同的胰岛细胞，或胰岛和非胰岛细胞51。β细胞通常会对葡萄糖的方脉冲刺激作出反应，[Ca2 + ]IC瞬时增加，然后在持续的平台上快速钙振荡（图6C，上图）。
由于所有β细胞都耦合成单个大的功能性合胞体，因此这些振荡也通过传播[Ca 2 +]IC波32，34，52，53，54在不同细胞之间很好地同步（图7C）。较慢的[Ca2 +]IC振荡，周期为5-15分钟，可能是快速振荡的基础，甚至是响应55，56的主要类型。相同的简单方案可以揭示其他类型的反应，特别是在胰岛的外围（图6C，下图）。由于这些细胞与β细胞不同步，并且以在低葡萄糖条件下已经存在的更快和更不规则的振荡或活性降低的反应，因此这种反应高度提示非β细胞21，32，57，58。然而，它们明确的功能表征需要更复杂的方案，包括额外的刺激步骤或替代方法，这将在下面讨论。腺泡细胞和导管细胞的典型反应分别在图6D和图6E中给出。有关腺泡和导管细胞22，23，35的更多详细信息，请参阅文献。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig06.jpg"> 图6：不同类型的胰腺细胞中钙动力学的代表性结果。 （A）朗格汉斯胰岛的高分辨率图像与周围组织。（B）胰腺组织的不同部分的描绘以黄色显示，一个朗格汉斯胰岛以红色显示，导管树的一段以蓝色显示。（C）在用12mM葡萄糖刺激期间β细胞和推定的非β细胞中钙动力学的典型痕迹;3mM葡萄糖用于非刺激性条件。可用于更特异性地区分非β细胞的协议在讨论部分进行了描述。（D）由25 nM乙酰胆碱刺激的腺泡细胞钙动力学的典型痕迹。（E）由1mM鹅去氧胆酸刺激的导管细胞钙动力学的典型痕迹。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
在成功的钙成像后，首先通过指数和线性拟合的组合导出数据并进行漂白校正，如方案部分所述。漂白校正前后的时间序列如图7A所示。此后，可以分析响应的活化和失活阶段以及平台阶段的几个参数。刺激后[Ca2 +]IC增加的延迟可以测量，如图7B中的延迟A和单个细胞间延迟的异质性（延迟A1）表示。可以使用相同的参数（延迟D 和延迟D1）来描述停用阶段。在初始瞬态[Ca2+]IC增加之后，胰岛中大多数胰腺β细胞的平台期的特征是相对规则的高频[Ca2 +]IC振荡。平台阶段可以通过分析经典功能参数来描述。[Ca2+]IC振荡持续时间、频率和有效时间百分比的示意图如图7C所示。在采集速率高于10 Hz的钙成像中，也可以清楚地识别在胰岛上反复扩散的钙波（图7C）。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig07.jpg"> 图7：时间序列数据分析。 （A）光漂白时间序列数据的校正。（B）分析刺激后激活和停止用12mM葡萄糖刺激后失活的延迟。刺激的持续时间由图像中的浅灰色阴影条表示。（C）分析平台阶段的几个参数：I）半高处确定的振荡持续时间，II）由间振荡区间确定的振荡频率。III）有功时间是振荡频率和持续时间的乘积。I-IV）在朗格汉斯胰岛传播的任何给定振荡波中振荡之间的延迟，由单个细胞达到振荡的一半高度的时间延迟（Δt）决定。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
表 1.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/Table%201%20(3).xlsx" target="_blank">请点击此处下载此表。</a>

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Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices

我们介绍了急性胰腺组织切片的制备及其在共聚焦激光扫描显微镜中的应用，以研究大量活细胞中钙动力学，时间长，时空分辨率高。

急性小鼠胰腺组织切片钙动力学的共聚焦激光扫描显微镜

The acute mouse pancreatic tissue slice is a unique in situ preparation with preserved intercellular communication and tissue architecture that entails ...

结合活细胞钙成像，急性胰腺组织切片技术能够以长时间的高分辨率研究细胞间波和多细胞功能连接。该技术的主要优点是速度快，保留了组织结构，并减少了有限的酶和机械应力，同时保持了高产量的组织。通过检测疾病进展过程中的功能和形态变化，该技术有助于我们了解胰腺相关疾病，例如糖尿病。这种组织切片技术可以应用于大脑，垂体和肾上腺组织，重点是保持细胞间接触，旁分泌相互作用和组织结构。为了准备将琼脂糖注射到小鼠胰腺中，用40摄氏度的液体琼脂糖填充五毫升注射器，并为注射器配备30号针头。用盖子小心地盖住针头后，将注射器针头末端向下放置，将整个体积的琼脂糖放在水面以下，在40摄氏度的水浴中。在气压和室温下以每分钟1.5毫升的速度在冰上连续在冰上用碳原泡一瓶细胞外溶液，以确保氧合和7.4的pH值。为了进行琼脂糖注射，将安乐死的成年小鼠置于体视显微镜下，并通过剖腹手术进入小鼠腹部。轻轻地将肠道向左侧移动以暴露胆总管，并使用镊子稍微抬起导管的十二指肠末端以定位Vater的。使用止血剂将胆管夹在十二指肠处，以防止琼脂糖从胆管泄漏到十二指肠，并使用小的尖锐镊子到达胆总管下方，以破坏将胆管连接到胰腺组织的膜。从胆管中清除尽可能多的脂肪和结缔组织后，将导管垂直于一对较大的镊子的尖端，并牢牢按压注射器柱塞，将粘稠液体琼脂糖注射到胆总管的近端20至30秒。当组织变白并略微膨胀时，取出注射器并缓慢将20毫升起泡的冰冷细胞外溶液倒入胰腺上以冷却组织并使琼脂糖变硬。为了获得胰腺组织切片，使用镊子和细小的坚韧切割剪刀将琼脂糖注射的胰腺轻轻地转移到含有40毫升冰冷细胞外溶液的100毫米培养皿中。旋转培养皿以冲洗组织并将胰腺转移到第二盘冰冷的细胞外溶液中。使用镊子和剪刀将白色的，注射良好的胰腺部分切成多达六个0.1至0.2立方厘米的碎片，并从组织碎片中取出任何剩余的结缔组织和脂肪组织。将清洁的块放入35毫米不粘的底部培养皿中，其中含有约5毫升40摄氏度的液体琼脂糖，并立即将培养皿放在冰上。当琼脂糖变硬后，将培养皿倒置在100毫米培养皿的盖子上，并使用剃须刀片的一半小心地切入培养皿的侧壁和琼脂糖之间的边缘，以从培养皿中除去琼脂糖。使用剃须刀片从游离的琼脂糖中切割单个立方体，每个立方体含有一块琼脂糖组织块，并使用氰基丙烯酸酯胶将块连接到振动切片机的样品板上。用150毫升冰冷的细胞外溶液填充振动切片机的切割室，这些溶液连续用碳原起泡。用螺钉将样品板固定在振动筛上，然后安装新的剃须刀片。用冰包围腔室，加入两个10毫升体积的冰块，用细胞外溶液制成，并补充六毫摩尔葡萄糖。将切片机设置为每秒0.05至1毫米和70赫兹，然后开始切片以获得140微米厚的琼脂糖切片，表面积为20至100平方毫米。使用细油漆刷小心地将每片转移到100毫米培养皿中，培养皿中装有40毫米HEPES缓冲液，并补充了6毫摩尔葡萄糖。对于钙染料制备，将50微克细胞渗透性钙指示剂染料，7.5微升DMSO和2.5微升泊洛沙姆以及6.667毫升HBS溶解在15毫升螺旋盖管中。使用移液器将溶液彻底混合20秒，然后将管浸入超声波浴室中并涡旋，每次30秒。然后将3.333毫升所得钙指示剂染料溶液等分试样，放入每10片组织中待标记的5毫升培养皿中。对于染料装载，使用薄的软画笔将多达10个组织切片转移到每个染料溶液皿中，并将培养皿放在轨道振荡器上，在室温下以每分钟40转的速度进行50分钟的光照保护。在孵育结束时，将多达20个染色切片转移到充满无染料HBS的单个60毫升培养皿中。对于通过共聚焦显微镜进行的钙成像，请选择20或25倍放大倍率，并将采集模式设置为延时成像，将针孔设置为100至200微米，以及实验中使用的荧光团的激发和发射。将记录室和灌注系统安装到显微镜的温度控制载物台上，并将入口和出口放置在记录室的远端边缘。将流入和流出速率设置为每分钟 1 到 2 毫升。将富集系统的温度设置为37摄氏度，并用非刺激性溶液启动普华。为了记录组织的钙动力学，将单个组织切片放入记录室中，并用U形铂砝码和绷紧尼龙网固定组织。使用明场选项定位感兴趣的结构，并使用实时成像将研究的结构定位到视野中。要优化信噪比，请调整激光功率、检测器放大和线平均分档，同时保持最小的激光功率。将焦平面调整到切割表面以下15微米，以避免潜在受损细胞的记录并获取图像。将采样频率设置为一到两赫兹，以便对单个振荡进行初始检测并记录高分辨率图像。如果可用，请使用在线图表获取有关制备响应、过度照明、光漂白和机械漂移的即时反馈。采集完所有图像后，保存数据以供以后分析。这里可以观察到最佳组织切片的示例，其中细胞渗透性钙指示剂染料被成功加载到胰腺组织切片中。相比之下，由于染料渗透不成功，胰岛细胞缺乏或样品表面上有大量坏死组织，这些组织切片不是成像的最佳选择。胰腺组织切片的高分辨率图像可用于描绘胰腺组织的不同区域，例如朗格汉斯胰岛，腺泡组织或胰管。刺激可用于在功能上区分不同的胰岛细胞或胰岛和非胰岛细胞。例如，β细胞通常通过表现出细胞内钙的瞬时增加，然后在持续的平台上快速钙振荡来响应方脉冲葡萄糖刺激。相比之下，非β细胞的反应更快，更不规则。还可以测量刺激后细胞内钙发作的延迟增加，以及单个细胞之间的异质性和延迟。可以使用相同的参数来描述停用阶段。在这里，可以观察到细胞内钙振荡持续时间，频率和活动时间百分比的示意图。当以大于10赫兹的采集速率成像时，可以清楚地识别在胰岛上反复扩散的钙波。将胆总管尽可能紧贴十二指肠，以防止意外阻塞进入胰腺的分支。另外，在注射过程中不要停止压下柱塞，因为琼脂糖会立即在针头中变硬。急性小鼠胰腺组织切片技术也可以与膜片钳方法一起使用，以研究离子通道电流并进入细胞形成以及免疫组织化学研究和秘书研究。

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

基于荧光测定活细胞中的钙进入商店经营：从培养的肿瘤细胞，骨骼肌纤维

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

科研

生物学

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

扫描浸软组织的电子显微镜可视化的细胞外基质

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

激光扫描显微术实时跟踪眼球前室胸腺细胞

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

小鼠胰腺胰岛细胞亚群中的钙动力学成像

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

荧光活细胞显微镜对微孔裂变酵母核动力学的检测

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

生物组织样本的串行块面扫描电子显微镜 （SBF-SEM）

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...

Imaging of Mitochondrial Peroxide in Living Yeast Cells Using mtHyper7

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Advancing Mitochondrial Research Â– mtHyper7 Biosensor for Subcellular Analysis (Video) | JoVE

mtHyPer7（一种用于线粒体过氧化物的比例生物传感器）在活酵母细胞中的成像

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...

Intravital Imaging Using an Inverted Microscope to Track Skin Cell Dynamics

Streamlined Intravital Imaging Approach for Long-Term Monitoring of Epithelial Tissue Dynamics on an Inverted Confocal Microscope

Developing a Tool for Using Inverted Confocal Microscopes for In Vivo Intravital Imaging (Video) | JoVE

简化活体成像方法，用于在倒置共聚焦显微镜上长期监测上皮组织动力学

Understanding normal and aberrant in vivo cell behaviors is necessary to develop clinical interventions to thwart disease initiation and progression. It ...

Biological Samples Preparation for Confocal Microscopy, Image Acquisition Setup, and Confocal Microscopy Imaging

Biological Samples Preparation for Confocal Microscopy, Image Acquisition Setup, and Confocal Microscopy Imaging (Video) | JoVE 

用于共聚焦显微镜、图像采集设置和共聚焦显微镜成像的生物样品制备