Name: confocal laser scanning microscopy of calcium dynamics in acute mouse pancreatic tissue slices
Uploaded: 2021-04-13T13:30:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices at JoVE.com

Det arbejde, der præsenteres i denne undersøgelse, blev støttet økonomisk af det slovenske forskningsagentur (forskningskernefinansieringsnr. P3-0396 og I0-0029 samt forskningsprojekter nr. J3-9289, N3-0048 og N3-0133) og af den østrigske videnskabsfond / Fonds zur Förderung der Wissenschaftlichen Forschung (bilaterale tilskud I3562--B27 og I4319--B30). Vi takker Maruša Rošer, Maša Čater og Rudi Mlakar for fremragende teknisk assistance.

Forfatterne erklærer, at forskningen blev udført i mangel af kommerciel eller økonomisk interesse.

Bugspytkirtelvævsskivemetoden er en hurtig eksperimentel metode til at studere morfologien og fysiologien af de endokrine og eksokrine dele af bugspytkirtlen i et mere konserveret in situ-præparat. Mange af fordelene er allerede blevet påpeget i indledningen. Det er værd at påpege, at skivemetoden til undersøgelse af bugspytkirtelfysiologi generelt (dvs. ikke kun til calciumbilleddannelse) sparer tid, fordi den ikke involverer en genopretningsperiode efter isolering. Sidstnævnte er ikke absolut nødvendigt med alle typer forsøg og anvendelser af isolerede holme fra forskellige arter, men anvendes typisk til at øge renheden, genoprette levedygtighed og funktionalitet og undertiden til at indsamle holme fra flere donorer 59,60,61,62,63,64 . I forbindelse med calciumbilleddannelse har betacelleresponser imidlertid vist sig at afhænge af kulturens varighed og betingelser, og dette er en vigtig kilde til variation, der bør tages i betragtning ved anvendelse af isolerede holme15,65. Det samme problem bør overvejes for vævsskiver, hvis deres langsigtede kultur bliver en udbredt mulighed i fremtiden22,36. Vævsskivemetoden har også et højt udbytte og reducerer dermed potentielt dyrs lidelser og øger statistisk effekt. Desuden kan der fremstilles så mange skiver fra et enkelt dyr, og fordi skiverne overlever i lange perioder, bliver det muligt at inkludere det samme dyr eller endda den samme ø i både forsøgs- og kontrolgrupperne.
Da den oprindelige arkitektur og celle-til-celle-kommunikation er bevaret, og fordi den er kompatibel med en række strukturelle analyser, elektrofysiologiske, billeddannelsesmetoder og hormonsekretionsassays, er denne metode især nyttig til at studere bugspytkirtelfunktioner, der afhænger af uforstyrrede interaktioner mellem individuelle celler, fx følsomhed over for sekretagoger, parakrine og immuninteraktioner mellem forskellige celletyper, mønstre af elektrisk aktivitet, egenskaber af calciumdynamik og udskillelse af forskellige hormoner. Specielt til calciumbilleddannelse er de vigtigste fordele ved at bruge skiver eksponeringen af økernen og muligheden for at erhverve signaler fra mange forskellige celletyper med høj opløsning. Afhængigt af forsøgets krav og dyrenes alder kan tykkelsen varieres, skiverne kan transficeret eller opnås fra dyr med genetisk kodede journalister. Som forklaret mere detaljeret nedenfor muliggør de to sidstnævnte tilgange også specifik funktionel identifikation og karakterisering af reaktioner fra ikke-betaceller 31,66. Desuden kan øer fra veldefinerede dele af organet undersøges for forskelle i lydhørhed eller modtagelighed for sygdom. Selvom de ikke kræver en genopretning inkubationsperiode, kan de let inkuberes med forskellige farmakologiske midler, fedtsyrer, høj glucose og cytokiner.
Vigtigst af alt, da høj opløsning kan opnås i kombination med enkeltcellet eller endda subcellulær opløsning, er konfokal calciumbilleddannelse i skiver en af de mest egnede metoder til analyse af calciumbølger, funktionel forbindelse og de forskellige funktionelle roller af celler i forskellige dele af en ø54,67. På trods af en række fordele har vævsskivemetoden vigtige begrænsninger. For det første er det stadig i det mindste delvist forstyrrende for holmens og eksokrine arkitektur, især ved skærefladen, og forholdsregler, såsom lav temperatur, hyppig udveksling af opløsninger og skånsom og hurtig manipulation, er nødvendige under forberedelsen for at forhindre yderligere mekanisk og endogen enzymatisk skade. For det andet er mønstrene for næringsstof- og sekretagogilevering stadig ringere end in vivo-ruten, præparatet er løsrevet fra systemisk innervering, og interorganfeedback, såsom mellem øen og dens målvæv, er umulig i modsætning til in vivo-tilgange. For det tredje er maksimal skivetykkelse begrænset af iltning, næringsstoftilførsel og pH-regulering ved ~ 200 μm9. Desuden kræver både forberedelse af skiver og billeddannelse meget træning, og dybdegående analyser af calciumdata fra lange tidsserier og fra mange celler kræver specialiseret viden, der ofte ikke er inkluderet i en klassisk fysiologs værktøjskasse og kræver hjælp fra fysikere eller dataforskere. Fordelen ved, at homo- og heterotypiske interaktioner bevares, kan også komplicere analysen af prøver på grund af tilstedeværelsen af signaler fra andre celler i områder af interesse. Afhængigt af protokoller kan aktivering af andre celler føre til indirekte yderligere stimulering eller hæmning af en observeret celle.
Dette kan kun løses endeligt ved hjælp af dekonvolutionsmetoder, ved mere komplekse stimuleringsprotokoller, herunder stoffer, der blokerer nogle af de indirekte virkninger, ved hjælp af specifikke knock-out-dyr og ved omhyggelig sammenligning af resultater med resultater fra andre undersøgelser, der anvender mere reduktionistiske metoder. Derudover, hvis sekretionsmålinger er nødvendige, skal det huskes, at nogle skiver kan mangle holme, og den samlede masse af endokrint væv i en enkelt skive er typisk lav. Forberedelsen af akutte bugspytkirtelvævsskiver til billeddannelse involverer flere kritiske trin, der diskuteres i de følgende afsnit og opsummeres i tabel 1, hvor læseren også kan finde korte, men vigtige tip til fejlfinding. For det første skal agarosepulveret opløses fuldstændigt, når agaroseopløsningen fremstilles, ellers kan de uopløste partikler blokere injektionen. Den homogene agaroseopløsning opbevares ved 37-45 °C for at forhindre hærdning af agarose på grund af for lav temperatur på den ene side og for at forhindre vævsskade på grund af for høje temperaturer på den anden side. Efter brug kan den resterende agarose opbevares ved 4 °C og genopvarmes, selv om gentagen genopvarmning kan resultere i øget tæthed på grund af vandfordampning, hvilket i sidste ende gør injektionen vanskelig eller umulig.
Det næste kritiske trin i forberedelsen er at fastspænde den store duodenale papilla korrekt. En hvid plet på tolvfingertarmen angiver krydset mellem den fælles galdekanal og tolvfingertarmen. En klemme placeret for proximalt vil resultere i obstruktion af nogle laterale bugspytkirtelgrene i den fælles kanal, hvilket deaktiverer injektionen af disse dele, mens en klemme placeret for distalt vil resultere i, at agarose lækker gennem den nedre modstandsvej direkte ind i tolvfingertarmen. Før kannulering af den fælles galdekanal kan det omgivende fedtvæv fjernes omhyggeligt for bedre visualisering af kanalen og større kontrol under injektion. Utilstrækkelig præcision under fjernelse af det omgivende væv kan resultere i perforering af kanalen. Valget af nålediameteren, der anvendes til agaroseinjektion, er også vigtigt. Hos mus anvendes fortrinsvis en 30 G nål; mindre (32 eller 33 G) nåle kræver mere indsats på grund af høj viskositet af agaroseopløsningen og er mere tilbøjelige til obstruktion. Men hvis de anvendes i kombination med en agaroseopløsning med lavere densitet, kan de være meget nyttige i mindre musestammer og yngre dyr. I løbet af de første postnatale dage kan agarose alternativt injiceres subkapsulært snarere end intradukt2. Brug af nåle med større diameter hos mus vil sandsynligvis resultere i beskadigelse af den fælles galdegang. Dette kan også ske med den korrekte nålediameter, og en tang kan hjælpe med at holde nålen på plads under injektionen. Nåle med større diameter kan være den eneste løsning i tilfælde af større kanaler, som findes hos rotter. Hvis nålen er for smal til at sikre en tæt tætning, der forhindrer tilbagelækage, kan der placeres en ligatur omkring den ved vellykket indtræden i kanalen.
Agaroseinjektion kræver en vis indsats på grund af opløsningens viskositet, og når injektionsprocessen er startet, bør den ikke afbrydes, da agaroseopløsningen med lavt smeltepunkt kan størkne i nålen eller de største dele af duktaltræet, før injektionen er afsluttet. Dette vil resultere i dårlig vævsindtrængning og dårligere støtte under skæring. Kanalen skal altid kannuleres på det punkt, hvor den venstre leverkanal og den cystiske kanal sammenføjes for at danne den fælles galdekanal. Hvis den fælles galdekanal bliver perforeret, skal du gentagne gange prøve at cannulating tættere på tolvfingertarmen. Når bugspytkirtlen er tilstrækkeligt stabiliseret med agaroseopløsning og ekstraheret fra peritonealhulen, skæres små stykker godt injiceret væv. Før du indlejrer dem i agarosen, er det afgørende at fjerne alt fedt- og bindevæv, da deres rester gør udskæring mere udfordrende. Det samme gælder for blodkar og kanalrester, undtagen når de er fokus for eksperimentet. I dette tilfælde skal du sørge for at placere dem på en sådan måde, at det ønskede tværsnit opnås. Når vævet indlejres i agarose, skal du sikre dig, at temperaturen er passende (37 °C), og at vævet er helt omgivet af agarose, da kræfter under vibratomskæring kan rive bugspytkirtelvævet ud af agaroseblokkene.
Hurtig tørring af vævsblokkene, før de placeres i agarose ved at placere dem kort på et papirservietter, kan hjælpe med at forhindre dårlig kontakt mellem væv og agarose under dette trin. Under størkning af agaroseblokke skal du placere petriskålen vandret og forhindre kontakt mellem bugspytkirtelvævet og bunden af petriskålen. Hvis bugspytkirtlen ikke injiceres fuldt ud, vil skæreprocessen være udfordrende. Prøv derfor at reducere skærehastigheden for at opnå vævsskiver. For at minimere celleskader under vibratomskæring skal du udskifte ECS (og isterningerne lavet af ECS) i skærekammeret regelmæssigt. Sidstnævnte vil reducere aktiviteten af bugspytkirtlenzymer frigivet fra acinarvæv under udskæring. Tykkelsen af skiverne er også af afgørende betydning. Til calciumdynamik og elektrofysiologiske eksperimenter skæres normalt 140 μm skiver; Ifølge undersøgelsens formål kan skivetykkelsen imidlertid variere fra 90 μm til 200 μm. Husk, at diffusionen af ilt og næringsstoffer i tykkere skiver vil være begrænset, men de vil omfatte mere væv. Derudover kan andelen af uskårne holme forventes at stige med stigende skivetykkelse. Skiver kan opbevares i en regelmæssigt udvekslet ECS ved stuetemperatur i flere timer eller endda dyrkes i et passende cellemedium i flere dage; dette kan dog i sidste ende påvirke den normale øcellefysiologi 3,22.
Når du forbereder farvestofopløsningen, skal du sikre omhyggelig blanding af alle komponenter og undgå udsættelse for omgivende lys. Bugspytkirtelskiven består af mange cellelag, og optagelsen af calciumfarvestof er begrænset til de første par mest overfladiske cellelag, som tidligere beskrevet for isolerede holme58,68 og hypofyseskiver69. I modsætning til isolerede øer, hvor den omgivende kapsel og ydre cellelag forhindrer farvestoffets indtrængning i dybere lag, giver vævsskiver adgang til hele øens tværsnitsoverflade, hvilket muliggør samtidig måling af calciumdynamik i hundredvis af celler fra alle lag af en ø. Fluorescerende Ca2+ indikatorer er de mest anvendte til måling af calciumdynamik, og sammen med CLSM muliggør de optagelser med høj tidsmæssig opløsning, der når flere hundrede Hertz. Når du vælger den mest passende fluorescerende Ca2+ indikator, skal du overveje forskellige faktorer, herunder indikatorformen, som påvirker cellebelastningsmetoden, måletilstanden (kvalitativ eller kvantitativ) og dissociationskonstant (Kd), der skal være i Ca2+ koncentrationsområdet af interesse og afhænger af pH, temperatur, tilstedeværelse af Mg2+ og andre ioner, samt proteinbinding. Da cellulære Ca2+ signaler normalt er forbigående, bør Ca2+ bindingshastighedskonstanten også overvejes. Til måling af [Ca2+]IC-dynamik i bugspytkirtelceller bruger denne gruppe hovedsageligt det cellegennemtrængelige Ca2+ indikatorfarvestof beskrevet i denne protokol (Materialetabel), da det er en lang bølgelængdeindikator med emissionsbølgelængderne i spektret, hvor cellulær autofluorescens normalt er mindre problematisk, og energien i excitationslys er lav, hvilket reducerer potentialet for cellulær fotoskade. Fordi dette farvestof er fluorescerende ved lave Ca2+ koncentrationer, letter dette bestemmelsen af baseline [Ca2+] IC og øger cellulær synlighed før stimulering. Efter binding ca2+ øges farvestoffets fluorescensintensitet 14 gange, hvilket muliggør detektion af selv små ændringer i [Ca2+] IC.
For vellykket live-celle calciumbilleddannelse skal flere vigtige hardwareparametre overvejes, som beskrevet i protokolafsnittet. Til levende cellebilleddannelse, hvor signalamplituder er lave, og chancerne for fototoksicitet er høje, bruges mål med en højere NA fortrinsvis til at indsamle mere lys fra prøven. Hvis calciumdynamik skal registreres med en høj tidsmæssig opløsning, skal du bruge resonansscanneren i stedet for lineære galvanometre. Udover at vælge det rigtige mål undgår brugen af meget følsomme detektorer - såsom hybriddetektorer, der kræver mindre laserkraft - fototoksicitet og fotobleaching. Dette er af særlig betydning for langvarig calciumbilleddannelse. Andre vigtige trin i calciumbilleddannelse er parameterindstillinger for billedkvalitet til tidsserieopkøb. Det vigtigste er den tidsmæssige og den rumlige opløsning. Da calciumdynamikken i sig selv bestemmer den laveste acceptable tidsmæssige opløsning, skal samplingshastigheden være mindst to gange højere end den forventede signalfrekvens for at detektere signalet eller endda 10 gange højere for at detektere signalets form pålideligt. I akutte skiver af bugspytkirtelvæv kan calciumdynamik måles i hundredvis af celler samtidigt, og derfor er den rumlige opløsning også vigtig. Dette kan forbedres ved at øge antallet af pixels eller ved at øge linjegennemsnittet under live erhvervelse. På grund af det omvendte forhold mellem den rumlige og den tidsmæssige opløsning er der imidlertid behov for en afvejning mellem begge indstillinger.
Hvis calciumbilleddannelse skal udføres i en bestemt cellepopulation i bugspytkirtlen, er det nødvendigt med en stimulus, der er i stand til funktionelt at differentiere cellerne i skiven. Høj glukose aktiverer pålideligt og hurtigt betaceller til et oscillerende mønster, der er overlejret på et forhøjet calciumniveau og er stærkt synkroniseret blandt alle celler inden for en ø 32,58,70. Betacellerne er den mest talrige celletype på en ø og er for det meste placeret i økernen hos mus. Den samme stimuleringsprotokol falder og ændrer undertiden ikke mærkbart sprængningen i alfaceller 30,32,58,70,71,72. For at diskriminere alfaceller funktionelt kan lav (3 mM) glucose, glutamat eller adrenalin bruges til at øge deres frekvens eller basal [Ca2+] IC 21,72,73,74,75. De repræsenterer 10-20% af holmcellerne og vil blive detekteret på øens periferi1. Deltaceller findes også i periferien. De udgør kun ~ 5% af det samlede antal endokrine celler i en ø og er typisk aktive i 6 mM glukose og reagerer på glukosestimulering med en øget uregelmæssig sprængaktivitet fra basislinjen eller et let forhøjet calciumniveau 1,32,71,76. Ghrelin kan anvendes til specifik stimulering af deltaceller 21,77,78,79 i calciumbilleddannelsesforsøg. Der mangler dog stadig at blive fastlagt protokoller for specifik funktionel identifikation af PP- og epsilonceller. Endvidere aktiverer 25 nM acetylcholin pålideligt acinarceller til sprængningsaktivitet 35,80,81. Derudover kan en række andre sekretagoger, såsom cerulein, cholecystokinin og carbamylcholin, bruges til at fremkalde calciumresponser i acinarceller 22,40,82,83.
Endelig fremkalder 1 mM chenodeoxycholsyre pålideligt calciumresponser i duktale celler i vævsskiver; Angiotensin II, ATP og nogle andre sekretagoger kan også bruges 11,23,84,85. Når en funktionel identifikation baseret på karakteristiske reaktioner på specifikke sekretagoger og hæmmere ikke er tilstrækkelig, kan genetisk mærkede dyr31, transinficerede celler73 eller immuncytokemi anvendes til identifikation af forskellige celletyper 9,22,71,86 . I løbet af de sidste par år er vævsskivemetoden med succes blevet tilpasset humant væv, hvilket åbner mange nye vigtige forskningsveje inden for både eksokrin41 og endokrin fysiologi 9,36,37,39. Interessant nok har en detaljeret vurdering af calciumdynamikken i menneskelige holme været notorisk vanskelig og skal stadig undersøges nærmere87. Kombineret med avanceret konfokal mikroskopi har bugspytkirtelvævsskivemetoden muliggjort mange nye indsigter i calciumdynamikken hos mus og vil forhåbentlig gøre det samme for humant væv.

Pattedyrets bugspytkirtel er en stor eksokrine og endokrin kirtel. Den eksokrine del udgør 96-99% af det samlede bugspytkirtelvolumen og består af acini og kanaler. Den endokrine del består af et stort antal øer af Langerhans, der tegner sig for de resterende 1-4% af det samlede bugspytkirtelvolumen1. Den eksokrine del udskiller store fordøjelsesenzymer, der nedbryder energirige polymerer i fødevarer, samt en bicarbonatrig væske, der kombineres med andre gastrointestinale sekreter for at tilvejebringe et miljø, der er egnet til virkningen af enzymer. Den endokrine del udskiller hormoner, der regulerer postprandial distribution, opbevaring og interprandial frigivelse af energirige næringsstoffer. Selvom det eksokrine væv er relativt underudviklet og det endokrine relativt veludviklet ved fødslen, vokser førstnævnte hurtigt sidstnævnte ved fravænningaf 2,3,4. Tidlige studier af bugspytkirtelfunktionen markerede fødslen af moderne fysiologi, og store metodiske fremskridt på området er blevet efterfulgt af store videnskabelige gennembrud5. At arbejde med bugspytkirtlen er teknisk udfordrende på grund af kirtlens indviklede struktur, men er også en stor motivation på grund af sygdomme som kræft i bugspytkirtlen, pancreatitis og diabetes, der udgør store trusler mod folkesundheden, og for hvilke der er behov for nye terapeutiske tilgange.
Isolerede øer6, acini 7,8 og duktale fragmenter var blevet udviklet og brugt i årtier som guldstandardmetoder på grund af deres fordele sammenlignet med cellelinjer og primære dispergerede endokrine, acinar- og duktale celler 9,10. På trods af isolerede cellekollektivers markant forbedrede funktion involverer disse metoder stadig betydelig mekanisk og enzymatisk belastning, isolerer celler fra det omgivende væv og mangler således parakrine interaktioner og mekanisk støtte, og vigtigst af alt ledsages af betydelige ændringer i normal fysiologi 11,12,13 . Den akutte musespytkirtelvævsskive blev udviklet i 2001 ud fra et opfattet behov for at udvikle en eksperimentel platform svarende til hjerne-, hypofyse- og binyreskiver med bevarede intercellulære kontakter, parakrine interaktioner, mesenchym og vævsarkitektur samt uden nogle af de vigtigste mangler ved guldstandardmetoden i øforskning på den tid - de isolerede øer12, 14. Blandt disse mangler er skader på de yderste lag, manglende tilgængelighed af kerneøområder og behovet for dyrkning med muligvis vigtige virkninger på celleidentitet og fysiologi12,15. Desuden muliggør vævsskivemetoden undersøgelser af dyremodeller med groft forstyrret holmarkitektur, hvor det er umuligt at isolere holme, eller når holmudbyttet er ekstremt lavt ved traditionel isolering 16,17,18,19,20,21.
Derudover er skiven mere velegnet til at studere morfologiske ændringer under udviklingen af diabetes og pancreatitis, for eksempel, da den giver et bedre overblik over hele vævet og også er kompatibel med at studere regionale forskelle. På trods af det tidlige fokus på den endokrine del muliggør vævsskivemetoden i sagens natur undersøgelsen af de eksokrine komponenter 9,22,23. I løbet af det første årti efter introduktionen blev metoden anvendt til elektrofysiologiske undersøgelser af beta-14,24,25,26,27,28,29- og alfa-30,31-celler samt til undersøgelse af den morfologiske og funktionelle modning af bugspytkirtlen 2,3 . Et årti senere i 2013 blev metoden med succes tilpasset til levende celle calciumbilleddannelse af øceller ved hjælp af CLSM til at karakterisere deres reaktioner på glucose32, deres funktionelle forbindelsesmønstre33 og forholdet mellem membranpotentiale og intracellulært calcium ved at kombinere et fluorescerende calciumfarvestof med et membranpotentialefarvestof34. Senere samme år blev metoden også brugt til at vurdere calciumdynamikken i acinarcellerne22,35. I løbet af de følgende år er bugspytkirtelvævsskiver blevet anvendt i en række forskellige undersøgelser og med succes tilpasset svin og humant væv 9,36,37,38,39,40,41. Men samlet set udføres calciumbilleddannelse - i skiver af bugspytkirtelvæv i almindelighed og i holme i særdeleshed - stadig for det meste af denne gruppe. En af hovedårsagerne til dette kan ligge i kombinationen af et teknisk udfordrende vævsskivepræparat, behovet for et konfokalt mikroskop og ret kompleks dataanalyse. Hovedformålet med dette papir er at gøre denne kraftfulde metode mere tilgængelig for andre potentielle brugere.
Der er allerede nogle fremragende metodologiske artikler, der beskæftiger sig detaljeret med vævsskiveforberedelse og brugen af skiver til struktur- og sekretionsundersøgelser, men ikke til konfokal calciumbilleddannelse 9,42,43. Derfor fokuserer dette papir på nogle yderligere tips og tricks under forberedelsen af skiver, på trin, der er kritiske for vellykket farvestofindlæsning, billedoptagelse samt på hovedtrinnene i grundlæggende calciumdataanalyse. Dette bidrag bør derfor betragtes som et supplement til snarere end et alternativ til ovennævnte metode. På samme måde skal calciumdannelse i skiver af bugspytkirtelvæv betragtes som en eksperimentel tilgang, der skal anvendes til at besvare specifikke spørgsmål og er således komplementær til snarere end et absolut alternativ til andre calciumbilleddannelsesmetoder i bugspytkirtelfysiologi såsom isolerede kanaler eller acini, isolerede holme, organoider, holme transplanteret i øjets forreste kammer og optagelser in vivo 11,44,45,46,47,48. Løftet om calciumbilleddannelse i skiver af bugspytkirtelvæv illustreres sandsynligvis bedst af nylige vellykkede optagelser af calciumdynamik i ø-mesenkymale celler såsom pericytter49 og makrofager50 samt i duktale celler23.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance KERN ALJ 120-4</td>
			<td>KERN &#38; SOHN GmbH</td>
			<td>ALJ 160-4A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope Leica TCS SP5 II Upright setup</td>
			<td>Leica</td>
			<td>5100001578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope Leica TCS SP5 AOBS Tandem II setup</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork pad 15 cm x 15 cm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>CLS430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Round Ice Bucket with Lid, 4 L</td>
			<td>Fischer Scientific, Leicestershire, UK</td>
			<td>432124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge razor blade</td>
			<td>Personna, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes 0.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 121.023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask 200 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>027.01.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - ToughCut</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat orbital shaker&#160; IKA KS 260 basic</td>
			<td>IKA</td>
			<td>Ident. No.: 0002980200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass lab bottle 1000 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>091.01.901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hartman Hemostat, curved</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>13003-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX APO L 20x/1.00 W HCX APO L (water immersion objective, 20x, NA 1.0)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15507701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring cylinder 25 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>015.01.025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator Control box SM-7, Keypad SM-7</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>&#160;200-100 900 7311, 200-100 900 9050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave owen</td>
			<td>Gorenje, Slovenia</td>
			<td>MO20MW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer Gonotec 010</td>
			<td>Gonotec, Berlin, Germany</td>
			<td>OSMOMAT 010 Nr. 01-02-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush</td>
			<td>Faber-Castell, No.2</td>
			<td></td>
			<td>Any thin soft round paint brush No.2, preferably black</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perifusion pumps</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>ISM 827</td>
			<td>Reglo Analog MS - 4/8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100/20 mm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35/10 mm</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>627102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35 x 10 mm Nunclon Delta</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA</td>
			<td>153066</td>
			<td>NON-STICKY for agarose blocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter inoLab pH Level 1</td>
			<td>WTW, Weilheim, Germany</td>
			<td>E163694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 1000 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3121 000.120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 50 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3121 000.066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Push pins 23 mm</td>
			<td>Deli, Ningbo, China</td>
			<td>E0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tube, 15 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semken Forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>11008-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stabilizing ring for Erlenmeyer flask</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>027.11.048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope Nikon SMZ 745</td>
			<td>Nikon, Melville, NY USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Injekt Solo 5 mL</td>
			<td>Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>4606051V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle 0.30 x 12 mm (30 G x 1/2&#34;)</td>
			<td>Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>4656300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>200-100 500 0150, 200-150-500-145</td>
			<td>Slice mini chamber, Temperature controller TC 07</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubings for perifusion system</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>SC0310</td>
			<td>Ismatec Pharmed 1.14 mm(ID) + silicone tubing 1.0 (ID) x 1.8 mm(OD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath Studio GT-7810A</td>
			<td>Globaltronics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrotome Leica VT 1000 S</td>
			<td>Leica, Nussloch, Germany</td>
			<td>14047235613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetric flask 1000 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>013.01.910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer Neolab 7-2020</td>
			<td>Neolab</td>
			<td>&#160;7-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath Thermo Haake open-bath circulator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Z527912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material/Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate - CaCl2.2H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4540-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-lactic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>L1250-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas mixture containing 95% O2 and 5% CO2 at barometric pressure</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue Wekem sekundenkleber WK-110</td>
			<td>Wekem GmbH, Bergkamen, Germany</td>
			<td>WK 110-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>H3375-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(+)-ascorbic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>A9,290-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate - MgCl2.2H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>M2670-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myo-inositol</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>I5125-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon Green 488 BAPTA-1, AM</td>
			<td>Invitrogen (Thermo FisherScientific)</td>
			<td>O6807</td>
			<td>cell-permeable Ca2+ indicator (excitation/emission: 495/523 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO)</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td>polaxamer: nonionic triblock copolymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride - KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>31248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaPlaque GTG agarose</td>
			<td>Lonza, Rockland, USA</td>
			<td>50111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate - NaHCO3</td>
			<td>Honeywell, Germany</td>
			<td>31437-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride - NaCl</td>
			<td>Honeywell, Germany</td>
			<td>31434-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide - NaOH</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>30620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic- NaH2PO4</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>S0751-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>15990-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>FIJI is an open source project</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LASAF</td>
			<td>Leica microsystems, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python</td>
			<td>Python Software Foundation</td>
			<td></td>
			<td>Python is an open source project</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal laser scanning microscopy of calcium dynamics in acute mouse pancreatic tissue slices

Den akutte skive af bugspytkirtelvæv er et unikt in situ-præparat med bevaret intercellulær kommunikation og vævsarkitektur, der medfører signifikant færre forberedelsesinducerede ændringer end isolerede øer, acini, kanaler eller dispergerede celler beskrevet i typiske in vitro-undersøgelser. Ved at kombinere den akutte bugspytkirtelvævsskive med levende celle calciumbilleddannelse i konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM) kan calciumsignaler studeres i et stort antal endokrine og eksokrine celler samtidigt med en enkeltcellet eller endda subcellulær opløsning. Følsomheden tillader påvisning af ændringer og muliggør undersøgelse af intercellulære bølger og funktionel forbindelse samt undersøgelse af afhængigheden af fysiologiske reaktioner af celler på deres lokalisering inden for øen og parakrinforholdet med andre celler. Endelig, set ud fra et dyrevelfærdsperspektiv, sænker registrering af signaler fra et stort antal celler ad gangen antallet af dyr, der kræves i forsøg, hvilket bidrager til 3R-erstatnings-, reduktions- og raffinementsprincippet.

Injektionen af agaroseopløsningen i bugspytkirtelkanalen er det mest kritiske trin i bugspytkirtelvævsskiveforberedelse. En vellykket injektion kan genkendes ved en blegning af bugspytkirtelvævet, som det ses på venstre side af figur 3A, mens en ufuldstændigt injiceret del af bugspytkirtlen er præsenteret på højre side af figur 3A. Øerne i Langerhans kan genkendes med det blotte øje eller under et stereomikroskop, og dette hjælper med at skære de relevante dele af bugspytkirtlen til efterfølgende indlejring i agaroseblokke (figur 3B). I en friskskåret skive af musespytkirtelvæv kan holme af Langerhans let skelnes fra det omgivende eksokrine væv og mesenchym som hvide pletter under stereomikroskopet (figur 3C) eller som brunlige strukturer under lysmikroskopet (figur 3D). Bugspytkirtelvævsskiverne kan bruges til forskellige typer eksperimenter i mindst 12 timer efter udskæring. Ud over den bruttomorfologiske vurdering under stereomikroskopet, lysmikroskopet og cellernes funktionelle reaktioner under calciumbilleddannelse kan levedygtigheden af bugspytkirtelvævsskiverne vurderes (figur 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig04.jpg"> Figur 4: Levedygtighed af celler i vævsskiven. Levedygtigheden af celler blev bestemt med Live / Dead-analysen. Levende celler farves af Calcein AM (vist i grønt), mens døde celler er farvet med ethidium homodimer-1 (vist med rødt). Gule linjer angiver placeringen af X-Y-tværsnittet af Z-stakken, der vises nederst og til højre. Den fulde dybde af Z-stakken er 88 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Til calciumbilleddannelsesforsøg skal den fluorescerende calciumindikator trænge gennem et par lag celler. Figur 5A viser vellykket indlæsning af det cellegennemtrængelige Ca2+ indikatorfarvestof i bugspytkirtelvævsskiven, hvor individuelle ø- og acinarceller kan genkendes. I modsætning hertil er skiver i figur 5B-D ikke optimale på grund af mislykket penetration af farvestoffet (figur 5B), mangel på øceller (figur 5C) og meget nekrotisk væv på overfladen (figur 5D). Sådanne skiver kan kasseres, kontrolleres for tilstedeværelsen af yderligere holme, der er skåret eller farvet bedre (se tabel 1 for fejlfinding) eller bruges til registrering af eksokrine cellers reaktioner.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig05.jpg"> Figur 5: Eksempler på brugbare og ubrugelige præparater. (A) Et eksempel på en vellykket forberedelse af bugspytkirtelvævsskiven med velfarvede celler i øerne Langerhans samt duktale celler og omgivende acinarvæv. (B) Et eksempel på en dårligt farvet vævsskive. (C) Eksempel på en ø Langerhans med strukturelle afbrydelser. (D) Et eksempel på en ø Langerhans, der indeholder mange døde celler og meget affald. Opslagstabellen "glow-over, glow-under" til højre viser 0 intensitet i grønt og mætning i blåt. Skalabjælke = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Repræsentative resultater fra calciumbilleddannelse ved hjælp af det cellegennemtrængelige Ca2+ indikatorfarvestof er vist i figur 6. I figur 6A præsenteres et billede i høj opløsning af en bugspytkirtelvævsskive, der indeholder en ø af Langerhans, acinarvæv og en bugspytkirtelkanal. For bedre sondring er den endokrine, eksokrine og duktale del af bugspytkirtelvævsskiven, der er vist i figur 6A , farvet i figur 6B. Brug af passende stimuli kan funktionelt skelne mellem forskellige øceller eller ø- og ikke-øceller51. Betaceller vil typisk reagere på en kvadratpulsstimulering af glukose med en forbigående stigning i [Ca2+] IC efterfulgt af hurtige calciumoscillationer på et vedvarende plateau (figur 6C, øverste panel).
Da alle betaceller er koblet til et enkelt, stort, funktionelt syncytium, synkroniseres disse svingninger også meget godt mellem forskellige celler ved at sprede [Ca2+]IC-bølger 32,34,52,53,54 (figur 7C). Langsommere [Ca2+]IC-svingninger med en periode på 5-15 minutter kan ligge til grund for de hurtige svingninger eller endda være den dominerende type reponse55,56. Den samme enkle protokol kan afsløre andre typer svar, især i periferien af holme (figur 6C, nederste panel). Da disse celler ikke synkroniseres med betaceller og reagerer med hurtigere og mere uregelmæssige svingninger, der allerede er til stede under lave glukoseforhold eller med et fald i aktivitet, er sådanne reaktioner stærkt suggestive for ikke-beta-celler 21,32,57,58. Imidlertid kræver deres endelige funktionelle karakterisering mere komplekse protokoller med yderligere stimuleringstrin eller alternative tilgange, som diskuteres nedenfor. Typiske reaktioner fra acinar- og duktale celler er vist i henholdsvis figur 6D og figur 6E. Se litteraturen for flere detaljer om acinar- og duktale celler 22,23,35.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig06.jpg"> Figur 6: Repræsentative resultater af calciumdynamik i forskellige typer bugspytkirtelceller. (A) Et billede i høj opløsning af en ø langerhans med omgivende væv. Skalabjælke = 100 μm. (B) Afgrænsning af forskellige dele af bugspytkirtelvæv med acinarvæv vist med gult, en ø langerhans vist med rødt og et segment af duktaltræet i blåt. Skalabjælke = 100 μm. (C) Typiske spor af calciumdynamik i beta- og formodede ikke-beta-celler under stimulering med 12 mM glucose; 3 mM glucose blev anvendt til ikke-stimulerende forhold. Protokoller, der kan bruges til mere specifik diskrimination af ikke-beta-celler, er beskrevet i diskussionsafsnittet. (D) Et typisk spor af calciumdynamik af acinarceller stimuleret af 25 nM acetylcholin. (E) Et typisk spor af calciumdynamik i duktale celler stimuleret af 1 mM chenodeoxycholsyre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Efter vellykket calciumbilleddannelse eksporteres dataene først og korrigeres til blegning ved en kombination af en eksponentiel og lineær pasform, som beskrevet i protokolafsnittet. En tidsserie før og efter blegningskorrektion er vist i figur 7A. Derefter kan flere parametre i aktiverings- og deaktiveringsfasen af responset samt plateaufasen analyseres. En forsinkelse i begyndelsen af [Ca2+] IC-stigning efter stimulering kan måles som repræsenteret ved forsinkelseA i figur 7B og heterogeniteten i forsinkelser blandt individuelle celler (forsinkelseA1). De samme parametre (forsinkelseD og forsinkelseD1) kan bruges til at beskrive deaktiveringsfasen. Efter den indledende transiente [Ca2+]IC-stigning er plateaufasen i de fleste pancreas betaceller på en ø karakteriseret ved relativt regelmæssige højfrekvente [Ca2+]IC-svingninger. Plateaufasen kan beskrives ved at analysere de klassiske funktionelle parametre. Den skematiske præsentation af [Ca2+]IC oscillationer varighed, frekvens og procentdel af aktiv tid er vist i figur 7C. I calciumbilleddannelse med erhvervelseshastigheder højere end 10 Hz kan calciumbølger, der gentagne gange spredes over øen, også genkendes tydeligt (figur 7C).
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig07.jpg"> Figur 7: Analyse af tidsseriedata. (A) Korrektion af tidsseriedata til fotobleaching. (B) Analyse af forsinkelser i aktivering efter stimulering og deaktivering efter ophør af stimulering med 12 mM glucose. Stimuleringens varighed er angivet med den lysegrå, skraverede bjælke i billedet. (C) Analyse af flere parametre i plateaufasen: I) Svingningens varighed bestemt i halv højde, II) oscillationsfrekvens bestemt ved inter-oscillationsintervaller. III) aktiv tid som et produkt af frekvens og varighed af svingninger. I-IV) Forsinkelser mellem svingninger i en given bølge af svingninger, der spredes over øen Langerhans bestemt af forsinkelserne (Δt) i det tidspunkt, hvor en enkelt celle når halv højde af svingningen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig07large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Tabel 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/Table%201%20(3).xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices at JoVE.com

Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices

Vi præsenterer fremstillingen af akutte bugspytkirtelvævsskiver og deres anvendelse i konfokal laserscanningsmikroskopi til at studere calciumdynamik samtidigt i et stort antal levende celler over lange tidsperioder og med høj spatiotemporal opløsning.

Konfokal laserscanning Mikroskopi af calciumdynamik i akutte musespytkirtelvævsskiver

The acute mouse pancreatic tissue slice is a unique in situ preparation with preserved intercellular communication and tissue architecture that entails ...

I kombination med levende celle calciumbilleddannelse muliggør den akutte bugspytkirtelvævsskiveteknik undersøgelsen af intercellulære bølger og flercellet funktionel forbindelse med høj opløsning over lange tidsperioder. De vigtigste fordele ved denne teknik er, at den er hurtig, bevarer vævsarkitektur og reducerer begrænset enzymatisk og mekanisk belastning, samtidig med at der opretholdes et højt udbytte af væv. Ved at detektere funktionelle og morfologiske ændringer under sygdomsprogression hjælper denne teknik vores forståelse af de bugspytkirtelrelaterede sygdomme, såsom diabetes.Denne vævsskiveteknik kan anvendes på hjerne-, hypofyse- og binyrevæv med vægt på bevarelse af intercellulær kontakt, parakrine interaktioner og vævsarkitektur. For at forberede injektion af agarose i musens bugspytkirtel skal du fylde en fem milliliter sprøjte med 40 grader Celsius flydende agarose og udstyre sprøjten med en 30 gauge nål. Efter forsigtigt at have dækket nålen med en hætte, skal du placere sprøjtenålens ende ned med hele volumenet af agarose under vandoverfladen i et 40 grader Celsius vandbad.Boble en flaske ekstracellulær opløsning med carbogen, kontinuerligt på is, ved 1,5 milliliter i minuttet ved barometertryk og stuetemperatur for at sikre iltning og en pH på 7,4. For at udføre agaroseinjektionen skal du placere en aflivet voksen mus under et stereomikroskop og få adgang til musens mave via laparotomi. Flyt forsigtigt tarmen til venstre side for at udsætte den fælles galdekanal og brug pincet til let at løfte den duodenale ende af kanalen for at lokalisere Vaters papilla.Brug en hæmostat til at klemme galdekanalen ved duodenalpapillen for at forhindre lækage af agarosen fra kanalen ind i tolvfingertarmen og brug en lille skarp tang til at nå under den fælles galdekanal for at bryde membranen, der fastgør kanalen til bugspytkirtelvævet. Efter at have ryddet så meget fedt og bindevæv fra kanalen som muligt, skal du placere kanalen vinkelret på spidserne af et par større tang og trykke fast på sprøjtestemplet, injicere den viskøse flydende agarose i den proksimale ende af den fælles galdekanal i 20 til 30 sekunder. Når vævet bliver hvidligt og let udspilet, fjern sprøjten og hæld langsomt 20 ml af den boblede iskolde ekstracellulære opløsning på bugspytkirtlen for at afkøle vævet og hærde agarosen.For at erhverve skiver i bugspytkirtlen skal du bruge tang og fine hårde snit saks til forsigtigt at overføre den agaroseindsprøjtede bugspytkirtel til en 100 millimeter petriskål indeholdende 40 ml iskold ekstracellulær opløsning. Hvirvl skålen for at skylle vævet og overfør bugspytkirtlen til en anden skål med iskold ekstracellulær opløsning. Brug tangen og saksen til at skære den hvidlige, godt injicerede bugspytkirtelsektion i op til seks stykker på 0,1 til 0,2 kubikcentimeter og fjern eventuelt resterende bindevæv og fedtvæv fra vævsstykkerne.Læg de rensede blokke i en 35 millimeter ikke-klæbrig bund petriskål indeholdende cirka fem milliliter 40 grader Celsius flydende agarose, og læg straks petriskålen på is. Når agarosen er hærdet, skal du holde petriskålen på hovedet over låget på et 100 millimeter petriskål og bruge halvdelen af et barberblad til forsigtigt at skære i kanten mellem petriskålens sidevæg og agarosen for at fjerne agarosen fra fadet. Brug barberbladet til at skære individuelle terninger, der hver indeholder en vævsblok af agarose, fra den frigjorte agarose og brug cyanoacrylatlim til at fastgøre blokkene til prøvepladen på en vibratom.Fyld vibratomets skærekammer med 150 ml iskold ekstracellulær opløsning, der kontinuerligt bobles med carbogen. Skru fastgør prøvepladen på vibratomen, og monter et nyt barberblad. Omgiv kammeret med is og tilsæt to 10 ml volumen isterninger lavet med ekstracellulær opløsning suppleret med seks millimolar glucose.Indstil skiveværktøjet til 0,05 til 1 millimeter i sekundet og 70 hertz, og begynd derefter at skære for at erhverve 140 mikron tykke agaroseskiver med et overfladeareal på 20 til 100 kvadratmillimeter. Brug en fin pensel til forsigtigt at overføre hver skive til en 100 millimeter petriskål fyldt med 40 millimeter HEPES-buffer suppleret med seks millimolar glukose. Til calciumfarvestofpræparat opløses 50 mikrogram cellegennemtrængeligt calciumindikatorfarvestof, 7,5 mikroliter DMSO og 2,5 mikroliter poloxamer og 6,667 ml HBS i et 15 ml skruelågrør.Brug en pipette til grundigt at blande opløsningen i 20 sekunder, før du nedsænker røret i et ultralydsbadkammer og hvirvler, hver i 30 sekunder. Derefter aliquot 3.333 ml af den resulterende calciumindikatorfarvestofopløsning i en 5 ml petriskål pr. 10 skiver væv, der skal mærkes. Til farvestofbelastning skal du bruge en tynd blød pensel til at overføre op til 10 vævsskiver til hver skål med farvestofopløsning og placere opvasken på en orbitalryster i 50 minutter ved stuetemperatur og 40 omdrejninger i minuttet beskyttet mod lys.Ved afslutningen af inkubationen overføres op til 20 farvede skiver til individuelle 60 ml petriskåle fyldt med farvestoffri HBS. Til calciumbilleddannelse ved konfokal mikroskopi vælges en 20 eller 25 gange forstørrelse og indstilles opsamlingstilstanden til timelapsebilleddannelse, pinhole til 100 til 200 mikron og excitering og emission for fluoroforen, der anvendes i eksperimentet. Optagekammeret og perfusionssystemet anbringes på mikroskopets temperaturstyrede trin, og indløbet og udløbet anbringes på optagekammerets yderste kanter.Indstil indstrømnings- og udstrømningshastighederne til en til to milliliter pr. Minut. Indstil temperaturen på overflodssystemet til 37 grader Celsius og initier overfloden med den ikke-stimulerende opløsning. For at registrere vævets calciumdynamik placeres en enkelt vævsskive i optagekammeret og immobilisere vævet med en U-formet platinvægt med et stramt nylonnet.Brug indstillingen bright-field til at lokalisere strukturen af interesse og brug live imaging til at placere de studerede strukturer i synsfeltet. For at optimere signal-støj-forholdet skal du justere lasereffekten, detektorforstærkningen og linjegennemsnittet, mens lasereffekten holdes minimal. Juster fokusplanet til 15 mikron under skærefladen for at undgå optagelse fra potentielt beskadigede celler og få billederne.Indstilling af samplingsfrekvensen til en til to hertz for at muliggøre den indledende detektion af individuelle svingninger og optagelse af et billede i høj opløsning. Hvis det er tilgængeligt, skal du bruge et online diagram til at få øjeblikkelig feedback om forberedelsesresponsen, overbelysning, fotobleaching og mekanisk drift. Når alle billederne er erhvervet, skal du gemme dataene til senere analyse.Her kan der observeres et eksempel på en optimal vævsskive, hvor det cellegennemtrængelige calciumindikatorfarvestof med succes blev indlæst i bugspytkirtelvævsskiven. I modsætning hertil er disse vævsskiver ikke optimale til billeddannelse på grund af enten en mislykket farvestofindtrængning, mangel på øceller eller en overflod af nekrotisk væv på prøveoverfladen. Billeder i høj opløsning af en bugspytkirtelvævsskive kan bruges til at afgrænse forskellige områder af bugspytkirtelvævet, såsom øerne Langerhans, acinarvæv eller bugspytkirtelkanalen.Stimuli kan bruges til funktionelt at skelne mellem forskellige øceller eller mellem ø- og ikke-øceller. For eksempel reagerer betaceller typisk på en kvadratisk pulsglukosestimulering ved at udvise en forbigående stigning i intracellulært calcium efterfulgt af en hurtig calciumoscillation på et vedvarende plateau. I modsætning hertil reagerer ikke-beta-celler med hurtigere og mere uregelmæssige svingninger.En forsinkelse i begyndelsen af intracellulær calciumforøgelse efter stimulering samt heterogenitet og forsinkelser blandt individuelle celler kan også måles. De samme parametre kan bruges til at beskrive deaktiveringsfasen. Her kan en skematisk præsentation af den intracellulære calciumoscillationsvarighed, frekvens og procentdel af aktiv tid observeres.Ved billeddannelse ved erhvervelseshastigheder større end 10 hertz kan calciumbølger, der gentagne gange spredes over øen, tydeligt genkendes. Klem den fælles galdekanal så tæt på tolvfingertarmen som muligt for at forhindre utilsigtet okklusion af grenen, der kommer ind i bugspytkirtlen. Stop heller ikke med at trykke stemplet under injektionen, fordi agarosen straks hærder i nålen.Den akutte muse-bugspytkirtelvævsskiveteknik kan også anvendes med patch clamp-metoden til at studere ionkanalstrømme og adgangscytose samt immunohistokemiske undersøgelser og sekretærstudier.

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluorescens-baserede Måling af Store betjente Calcium indtastning i levende celler: fra kulturperler kræftcellen til at Skeletmuskel Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Klonale Sporing af hæmatopoietisk stamcelletransplantation og progenitorceller Præget af Fem fluorescerende proteiner ved hjælp af konfokal og multiphoton mikroskopi

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Scanning Electron Microscopy af udblødt Tissue at visualisere den ekstracellulære matrix

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

Real Time In Vivo Tracking af thymocytter i det forreste kammer i øjet ved Laser Scanning mikroskopi

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

Imaging calcium dynamik i subpopulationer af mus bugspytkirtel ø-celler

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Undersøgelse af mitotisk og meiotisk fission gær nuklear dynamik ved fluorescens levende celle mikroskopi

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

Seriel blok-ansigt scanning elektron mikroskopi (SBF-SEM) af biologiske vævsprøver

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...

Imaging of Mitochondrial Peroxide in Living Yeast Cells Using mtHyper7

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Advancing Mitochondrial Research Â– mtHyper7 Biosensor for Subcellular Analysis (Video) | JoVE

Billeddannelse af mtHyPer7, en ratiometrisk biosensor for mitokondrieperoxid, i levende gærceller

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...

Intravital Imaging Using an Inverted Microscope to Track Skin Cell Dynamics

Streamlined Intravital Imaging Approach for Long-Term Monitoring of Epithelial Tissue Dynamics on an Inverted Confocal Microscope

Developing a Tool for Using Inverted Confocal Microscopes for In Vivo Intravital Imaging (Video) | JoVE

Strømlinet intravital billeddannelsesmetode til langsigtet overvågning af epitelvævsdynamik på et inverteret konfokalmikroskop

Understanding normal and aberrant in vivo cell behaviors is necessary to develop clinical interventions to thwart disease initiation and progression. It ...

Biological Samples Preparation for Confocal Microscopy, Image Acquisition Setup, and Confocal Microscopy Imaging

Biological Samples Preparation for Confocal Microscopy, Image Acquisition Setup, and Confocal Microscopy Imaging (Video) | JoVE 

Forberedelse af biologiske prøver til konfokal mikroskopi, opsætning af billedoptagelse og konfokal mikroskopibilleddannelse