Name: confocal laser scanning microscopy of calcium dynamics in acute mouse pancreatic tissue slices
Uploaded: 2021-04-13T13:30:00
Duration: 10 min 49 s
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Les travaux présentés dans cette étude ont été soutenus financièrement par l’Agence slovène de la recherche (financement de base de la recherche no. P3-0396 et I0-0029, ainsi que des projets de recherche nos. J3-9289, N3-0048 et N3-0133) et par le Fonds autrichien pour la science / Fonds zur Förderung der Wissenschaftlichen Forschung (subventions bilatérales I3562--B27 et I4319--B30). Nous remercions Maruša Rošer, Maša Čater et Rudi Mlakar pour leur excellente assistance technique.

Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de tout intérêt commercial ou financier.

Le pancréas des mammifères est une grande glande exocrine et endocrine. La partie exocrine représente 96 à 99% du volume total du pancréas et se compose d’acini et de conduits. La partie endocrinienne est composée d’un grand nombre d’îlots de Langerhans représentant les 1 à 4% restants du volume total du pancréas1. La partie exocrine sécrète des enzymes digestives majeures qui décomposent les polymères riches en énergie dans les aliments, ainsi qu’un liquide riche en bicarbonate, qui se combine avec d’autres sécrétions gastro-intestinales pour fournir un environnement propice à l’action des enzymes. La partie endocrinienne sécrète des hormones qui régulent la distribution postprandiale, le stockage et la libération interprandiale de nutriments riches en énergie. Bien que le tissu exocrine soit relativement sous-développé et que le système endocrinien soit relativement bien développé à la naissance, le premier dépasse rapidement le second au sevrage 2,3,4. Les premières études de la fonction pancréatique ont marqué la naissance de la physiologie moderne, et les avancées méthodologiques majeures dans le domaine ont été suivies par des ruptures scientifiques majeures5. Travailler avec le pancréas est techniquement difficile en raison de la structure complexe de la glande, mais c’est aussi une grande motivation en raison de maladies telles que le cancer du pancréas, la pancréatite et le diabète qui présentent des menaces majeures pour la santé publique et pour lesquelles de nouvelles approches thérapeutiques sont nécessaires.
Les îlotsisolés 6, acini 7,8 et les fragments canalaires avaient été développés et utilisés pendant des décennies comme méthodes de référence en raison de leurs avantages par rapport aux lignées cellulaires et aux cellules endocriniennes, acineuses et canalaires primaires dispersées 9,10. Malgré la fonction nettement améliorée des collectifs de cellules isolées, ces méthodes impliquent toujours un stress mécanique et enzymatique considérable, isolent les cellules du tissu environnant et manquent donc d’interactions paracrines et de soutien mécanique, et surtout, s’accompagnent de modifications significatives de la physiologie normale 11,12,13 . La tranche aiguë de tissu pancréatique de souris a été développée en 2001 à partir d’un besoin perçu de développer une plate-forme expérimentale similaire aux tranches cérébrales, hypophysaires et surrénales avec des contacts intercellulaires préservés, des interactions paracrines, du mésenchyme et de l’architecture tissulaire, ainsi que sans certaines des lacunes les plus importantes de la méthode de référence dans la recherche sur les îlots de cette époque - les îlots isolés12, 14. Parmi ces lacunes figurent les dommages aux couches les plus externes, le manque d’accessibilité des zones centrales des îlots et la nécessité d’une culture ayant des effets potentiellement importants sur l’identité et la physiologie cellulaires12,15. De plus, la méthode des tranches de tissu permet des études sur des modèles animaux avec une architecture d’îlots grossièrement dérangée où il est impossible d’isoler les îlots, ou lorsque le rendement des îlots est extrêmement faible par isolement traditionnel 16,17,18,19,20,21.
De plus, la tranche est plus adaptée à l’étude des changements morphologiques au cours du développement du diabète et de la pancréatite, par exemple, car elle permet une meilleure vue d’ensemble de l’ensemble du tissu et est également compatible avec l’étude des différences régionales. Il est important de noter que, malgré l’accent mis au début sur la partie endocrinienne, la méthode des tranches de tissu permet intrinsèquement l’étude des composants exocrines 9,22,23. Au cours de la première décennie après son introduction, la méthode a été utilisée pour des études électrophysiologiques de cellules bêta 14,24,25,26,27,28,29 et alpha 30,31 ainsi que pour examiner la maturation morphologique et fonctionnelle du pancréas 2,3 . Une décennie plus tard, en 2013, la méthode a été adaptée avec succès pour l’imagerie calcique des cellules calciques des cellules des îlots vivants à l’aide du CLSM pour caractériser leurs réponses au glucose32, leurs modèles de connectivité fonctionnelle33 et la relation entre le potentiel membranaire et le calcium intracellulaire en combinant un colorant de calcium fluorescent avec un colorant potentiel membranaire34. Plus tard dans la même année, la méthode a également été utilisée pour évaluer la dynamique du calcium dans les cellules acineuses22,35. Au cours des années suivantes, les tranches de tissu pancréatique ont été utilisées dans un certain nombre d’études différentes et adaptées avec succès aux tissus porcins et humains 9,36,37,38,39,40,41. Cependant, prises ensemble, l’imagerie calcique - dans les tranches de tissu pancréatique de souris en général et dans les îlots en particulier - est encore principalement effectuée par ce groupe. L’une des principales raisons à cela peut résider dans la combinaison d’une préparation de tranches de tissu techniquement difficile, de la nécessité d’un microscope confocal et d’une analyse de données plutôt complexe. L’objectif principal du présent document est de rendre cette méthode puissante plus accessible aux autres utilisateurs potentiels.
Il existe déjà d’excellents articles méthodologiques traitant en détail de la préparation des tranches de tissu et de l’utilisation des tranches pour les études structurelles et de sécrétion, mais pas pour l’imagerie confocaledu calcium 9,42,43. Par conséquent, cet article se concentre sur quelques conseils et astuces supplémentaires lors de la préparation des tranches, sur les étapes essentielles pour un chargement réussi de colorant, l’acquisition d’images, ainsi que sur les principales étapes de l’analyse de base des données calciques. Par conséquent, cette contribution devrait être considérée comme complémentaire à la méthode susmentionnée plutôt que comme une alternative à celle-ci. De même, l’imagerie calcique dans les tranches de tissu pancréatique de souris doit être considérée comme une approche expérimentale à utiliser pour répondre à des questions spécifiques et est donc complémentaire plutôt qu’une alternative absolue à d’autres approches d’imagerie calcique en physiologie pancréatique telles que les canaux isolés ou acini, les îlots isolés, les organoïdes, les îlots transplantés dans la chambre antérieure de l’œil, et enregistrements in vivo 11,44,45,46,47,48. La promesse de l’imagerie calcique dans les tranches de tissu pancréatique de souris est probablement mieux illustrée par les récents enregistrements réussis de la dynamique du calcium dans les cellules mésenchymateuses des îlots tels que les péricytes49 et les macrophages50, ainsi que dans les cellules canalaires23.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance KERN ALJ 120-4</td>
			<td>KERN &#38; SOHN GmbH</td>
			<td>ALJ 160-4A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope Leica TCS SP5 II Upright setup</td>
			<td>Leica</td>
			<td>5100001578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope Leica TCS SP5 AOBS Tandem II setup</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork pad 15 cm x 15 cm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>CLS430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Round Ice Bucket with Lid, 4 L</td>
			<td>Fischer Scientific, Leicestershire, UK</td>
			<td>432124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge razor blade</td>
			<td>Personna, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes 0.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 121.023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask 200 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>027.01.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - ToughCut</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat orbital shaker&#160; IKA KS 260 basic</td>
			<td>IKA</td>
			<td>Ident. No.: 0002980200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass lab bottle 1000 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>091.01.901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hartman Hemostat, curved</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>13003-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX APO L 20x/1.00 W HCX APO L (water immersion objective, 20x, NA 1.0)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15507701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring cylinder 25 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>015.01.025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator Control box SM-7, Keypad SM-7</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>&#160;200-100 900 7311, 200-100 900 9050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave owen</td>
			<td>Gorenje, Slovenia</td>
			<td>MO20MW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer Gonotec 010</td>
			<td>Gonotec, Berlin, Germany</td>
			<td>OSMOMAT 010 Nr. 01-02-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush</td>
			<td>Faber-Castell, No.2</td>
			<td></td>
			<td>Any thin soft round paint brush No.2, preferably black</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perifusion pumps</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>ISM 827</td>
			<td>Reglo Analog MS - 4/8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100/20 mm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35/10 mm</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>627102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35 x 10 mm Nunclon Delta</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA</td>
			<td>153066</td>
			<td>NON-STICKY for agarose blocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter inoLab pH Level 1</td>
			<td>WTW, Weilheim, Germany</td>
			<td>E163694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 1000 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3121 000.120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 50 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3121 000.066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Push pins 23 mm</td>
			<td>Deli, Ningbo, China</td>
			<td>E0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tube, 15 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semken Forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>11008-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stabilizing ring for Erlenmeyer flask</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>027.11.048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope Nikon SMZ 745</td>
			<td>Nikon, Melville, NY USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Injekt Solo 5 mL</td>
			<td>Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>4606051V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle 0.30 x 12 mm (30 G x 1/2&#34;)</td>
			<td>Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>4656300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>200-100 500 0150, 200-150-500-145</td>
			<td>Slice mini chamber, Temperature controller TC 07</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubings for perifusion system</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>SC0310</td>
			<td>Ismatec Pharmed 1.14 mm(ID) + silicone tubing 1.0 (ID) x 1.8 mm(OD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath Studio GT-7810A</td>
			<td>Globaltronics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrotome Leica VT 1000 S</td>
			<td>Leica, Nussloch, Germany</td>
			<td>14047235613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetric flask 1000 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>013.01.910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer Neolab 7-2020</td>
			<td>Neolab</td>
			<td>&#160;7-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath Thermo Haake open-bath circulator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Z527912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material/Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate - CaCl2.2H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4540-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-lactic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>L1250-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas mixture containing 95% O2 and 5% CO2 at barometric pressure</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue Wekem sekundenkleber WK-110</td>
			<td>Wekem GmbH, Bergkamen, Germany</td>
			<td>WK 110-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>H3375-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(+)-ascorbic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>A9,290-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate - MgCl2.2H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>M2670-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myo-inositol</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>I5125-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon Green 488 BAPTA-1, AM</td>
			<td>Invitrogen (Thermo FisherScientific)</td>
			<td>O6807</td>
			<td>cell-permeable Ca2+ indicator (excitation/emission: 495/523 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO)</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td>polaxamer: nonionic triblock copolymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride - KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>31248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaPlaque GTG agarose</td>
			<td>Lonza, Rockland, USA</td>
			<td>50111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate - NaHCO3</td>
			<td>Honeywell, Germany</td>
			<td>31437-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride - NaCl</td>
			<td>Honeywell, Germany</td>
			<td>31434-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide - NaOH</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>30620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic- NaH2PO4</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>S0751-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>15990-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>FIJI is an open source project</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LASAF</td>
			<td>Leica microsystems, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python</td>
			<td>Python Software Foundation</td>
			<td></td>
			<td>Python is an open source project</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal laser scanning microscopy of calcium dynamics in acute mouse pancreatic tissue slices

La tranche aiguë de tissu pancréatique de souris est une préparation in situ unique avec une communication intercellulaire préservée et une architecture tissulaire qui implique beaucoup moins de changements induits par la préparation que les îlots isolés, les acini, les canaux ou les cellules dispersées décrits dans des études in vitro typiques. En combinant la tranche de tissu pancréatique aigu avec l’imagerie calcique à cellules vivantes en microscopie confocale à balayage laser (CLSM), les signaux calciques peuvent être étudiés simultanément dans un grand nombre de cellules endocriniennes et exocrines, avec une résolution unicellulaire ou même subcellulaire. La sensibilité permet la détection des changements et permet l’étude des ondes intercellulaires et de la connectivité fonctionnelle ainsi que l’étude de la dépendance des réponses physiologiques des cellules sur leur localisation dans l’îlot et la relation paracrine avec d’autres cellules. Enfin, du point de vue du bien-être animal, l’enregistrement des signaux provenant d’un grand nombre de cellules à la fois réduit le nombre d’animaux requis dans les expériences, contribuant ainsi au principe de remplacement, de réduction et de raffinement des 3R.

L’injection de la solution d’agarose dans le canal pancréatique est l’étape la plus critique de la préparation des tranches de tissu pancréatique. Une injection réussie peut être reconnue par un blanchiment du tissu pancréatique, comme on le voit sur le côté gauche de la figure 3A, tandis qu’une partie incomplètement injectée du pancréas est présentée sur le côté droit de la figure 3A. Les îlots de Langerhans peuvent être reconnus à l’œil nu ou sous un stéréomicroscope, ce qui aide à couper les parties appropriées du pancréas pour une intégration ultérieure dans des blocs d’agarose (Figure 3B). Dans une tranche de tissu pancréatique de souris fraîchement coupée, les îlots de Langerhans peuvent être facilement distingués du tissu exocrine et du mésenchyme environnants sous forme de taches blanches sous le stéréomicroscope (Figure 3C) ou de structures brunâtres sous le microscope optique (Figure 3D). Les tranches de tissu pancréatique peuvent être utilisées pour des types d’expériences distincts pendant au moins 12 heures après le tranchage. En plus de l’évaluation morphologique globale sous stéréomicroscope, au microscope optique et des réponses fonctionnelles des cellules lors de l’imagerie calcique, la viabilité des tranches de tissu pancréatique peut être évaluée (figure 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig04.jpg"> Figure 4 : Viabilité des cellules à l’intérieur de la tranche de tissu. La viabilité des cellules a été déterminée à l’aide du test Vivant/Mort. Les cellules vivantes sont colorées par Calcein AM (en vert), tandis que les cellules mortes sont colorées avec de l’homodimère-1 à l’éthidium (en rouge). Les lignes jaunes indiquent la position de la section X-Y de la pile Z affichée en bas et à droite. La profondeur totale de la pile Z est de 88 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
Pour les expériences d’imagerie calcique, l’indicateur de calcium fluorescent doit pénétrer à travers quelques couches de cellules. La figure 5A présente le chargement réussi du colorant indicateur Ca2+ perméable aux cellules dans la tranche de tissu pancréatique dans laquelle des îlots individuels et des cellules acineuses peuvent être reconnus. En revanche, les tranches de la figure 5B-D ne sont pas optimales en raison de la pénétration infructueuse du colorant (figure 5B), de l’absence de cellules d’îlots (figure 5C) et de beaucoup de tissu nécrotique à la surface (figure 5D). Ces tranches peuvent être jetées, vérifiées pour la présence d’îlots supplémentaires qui sont mieux coupés ou colorés (voir le tableau 1 pour le dépannage), ou utilisées pour enregistrer les réponses des cellules exocrines.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig05.jpg"> Figure 5: Exemples de préparations utilisables et inutilisables. (A) Exemple d’une préparation réussie de la tranche de tissu pancréatique avec des cellules bien colorées dans les îlots de Langerhans, ainsi que des cellules canalaires et du tissu acineux environnant. (B) Un exemple de tranche de tissu mal colorée. (C) Exemple d’îlot de Langerhans avec des arrêts structurels. (D) Un exemple d’îlot de Langerhans contenant de nombreuses cellules mortes et beaucoup de débris. La table de recherche « glow-over, glow-under » à droite affiche l’intensité 0 en vert et la saturation en bleu. Barre d’échelle = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.</a>
Les résultats représentatifs de l’imagerie calcique à l’aide du colorant indicateur Ca2+ perméable aux cellules sont présentés à la figure 6. Dans la figure 6A, une image à haute résolution d’une tranche de tissu pancréatique est présentée, contenant un îlot de Langerhans, un tissu acineux et un canal pancréatique. Pour une meilleure distinction, les parties endocrinienne, exocrine et canalaire de la tranche de tissu pancréatique présentée à la figure 6A sont colorées à la figure 6B. L’utilisation de stimuli appropriés peut discriminer fonctionnellement entre différentes cellules d’îlots, ou cellules d’îlots et non-îlots51. Les cellules bêta répondent généralement à une stimulation de l’impulsion carrée par le glucose avec une augmentation transitoire de [Ca2+]IC suivie d’oscillations rapides du calcium sur un plateau soutenu (Figure 6C, panneau supérieur).
Comme toutes les cellules bêta sont couplées en un seul grand syncytium fonctionnel, ces oscillations sont également très bien synchronisées entre différentes cellules au moyen de la propagation des ondes [Ca2+]IC 32,34,52,53,54 (Figure 7C). Des oscillations plus lentes [Ca2+]IC avec une période de 5 à 15 minutes peuvent sous-tendre les oscillations rapides ou même être le type prédominant de réponse55,56. Le même protocole simple peut révéler d’autres types de réponses, en particulier à la périphérie des îlots (Figure 6C, panneau inférieur). Comme ces cellules ne sont pas synchronisées avec les cellules bêta et répondent avec des oscillations plus rapides et plus irrégulières qui sont déjà présentes dans des conditions de faible glycémie ou avec une diminution de l’activité, de telles réponses sont très suggestives des cellules non bêta 21,32,57,58. Cependant, leur caractérisation fonctionnelle définitive nécessite des protocoles plus complexes avec des étapes de stimulation supplémentaires ou des approches alternatives, qui sont discutées ci-dessous. Les réponses typiques des cellules acineuses et canalaires sont présentées dans les figures 6D et 6E, respectivement. Reportez-vous à la littérature pour plus de détails sur les cellules acineuses et canalaires 22,23,35.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig06.jpg"> Figure 6: Résultats représentatifs de la dynamique du calcium dans des types distincts de cellules pancréatiques. (A) Image à haute résolution d’un îlot de Langerhans avec les tissus environnants. Barre d’échelle = 100 μm. (B) Délimitation de parties distinctes du tissu pancréatique avec un tissu acineux représenté en jaune, un îlot de Langerhans en rouge et un segment de l’arbre canalaire en bleu. Barre d’échelle = 100 μm. (C) Traces typiques de dynamique du calcium dans les cellules bêta et putatives non bêta pendant la stimulation avec 12 mM de glucose; 3 mM de glucose a été utilisé pour des conditions non stimulantes. Les protocoles qui peuvent être utilisés pour une discrimination plus spécifique des cellules non bêta sont décrits dans la section de discussion. (D) Une trace typique de la dynamique calcique des cellules acineuses stimulée par 25 nM d’acétylcholine. (E) Une trace typique de dynamique calcique des cellules canalaires stimulée par 1 mM d’acide chénodésoxycholique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Après une imagerie calcique réussie, les données sont d’abord exportées et corrigées pour le blanchiment par une combinaison d’un ajustement exponentiel et linéaire, comme décrit dans la section du protocole. Une série chronologique avant et après la correction du blanchiment est présentée à la figure 7A. Par la suite, plusieurs paramètres de la phase d’activation et de désactivation de la réponse ainsi que de la phase de plateau peuvent être analysés. Un retard dans l’apparition de l’augmentation de [Ca2+]IC après la stimulation peut être mesuré tel que représenté par le retardA dans la figure 7B et l’hétérogénéité des retards entre les cellules individuelles (retardA1). Les mêmes paramètres (délaiD et retardD1) peuvent être utilisés pour décrire la phase de désactivation. Après l’augmentation transitoire initiale [Ca2+]IC , la phase de plateau dans la plupart des cellules bêta pancréatiques d’un îlot est caractérisée par des oscillations relativement régulières à haute fréquence [Ca2+]IC . La phase de plateau peut être décrite en analysant les paramètres fonctionnels classiques. La présentation schématique de la durée, de la fréquence et du pourcentage de temps actif des oscillations [Ca2+]IC est présentée à la figure 7C. En imagerie calcique avec des taux d’acquisition supérieurs à 10 Hz, les ondes de calcium se propageant à plusieurs reprises sur l’îlot peuvent également être clairement reconnues (Figure 7C).
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig07.jpg"> Figure 7: Analyse des données des séries chronologiques. (A) Correction des données des séries chronologiques pour le photoblanchiment. (B) Analyse des retards d’activation après stimulation et de désactivation après arrêt de la stimulation avec 12 mM de glucose. La durée de la stimulation est indiquée par la barre gris clair et ombragée de l’image. (C) Analyse de plusieurs paramètres de la phase de plateau: I) Durée de l’oscillation déterminée à mi-hauteur, II) fréquence des oscillations déterminée par des intervalles d’oscillation inter-oscillation. III) le temps actif en tant que produit de la fréquence et de la durée des oscillations. I-IV) Délais entre les oscillations dans une onde donnée d’oscillations qui se propagent à travers l’îlot de Langerhans déterminés par les retards (Δt) dans le temps auquel une seule cellule atteint la moitié de la hauteur de l’oscillation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig07large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/Table%201%20(3).xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>

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Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices

Nous présentons la préparation de tranches de tissu pancréatique aigu et leur utilisation en microscopie confocale à balayage laser pour étudier simultanément la dynamique du calcium dans un grand nombre de cellules vivantes, sur de longues périodes et avec une résolution spatio-temporelle élevée.

Microscopie confocale à balayage laser de la dynamique du calcium dans les tranches de tissu pancréatique aigu de souris

The acute mouse pancreatic tissue slice is a unique in situ preparation with preserved intercellular communication and tissue architecture that entails ...

En combinaison avec l’imagerie calcique des cellules vivantes, la technique de la tranche de tissu pancréatique aigu permet d’étudier les ondes intercellulaires et la connectivité fonctionnelle multicellulaire avec une haute résolution sur de longues périodes. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle est rapide, préserve l’architecture tissulaire et réduit les contraintes enzymatiques et mécaniques limitées tout en maintenant un rendement élevé de tissus. En détectant les changements fonctionnels et morphologiques au cours de la progression de la maladie, cette technique aide à comprendre les maladies liées au pancréas, telles que le diabète.Cette technique de tranche de tissu peut être appliquée aux tissus cérébraux, hypophysaires et surrénaliens en mettant l’accent sur la préservation du contact intercellulaire, des interactions paracrines et de l’architecture tissulaire. Pour vous préparer à l’injection d’agarose dans le pancréas de la souris, remplissez une seringue de cinq millilitres avec de l’agarose liquide de 40 degrés Celsius et équipez la seringue d’une aiguille de calibre 30. Après avoir soigneusement recouvert l’aiguille d’un capuchon, placez l’extrémité de l’aiguille de la seringue vers le bas, avec tout le volume d’agarose sous la surface de l’eau, dans un bain-marie de 40 degrés Celsius.Faire bouillonner une bouteille de solution extracellulaire avec du carbogène, en continu sur de la glace, à 1,5 millilitre par minute à pression barométrique et température ambiante pour assurer l’oxygénation et un pH de 7,4. Pour effectuer l’injection d’agarose, placez une souris adulte euthanasiée sous un stéréomicroscope et accédez à l’abdomen de la souris par laparotomie. Déplacez doucement l’intestin vers le côté gauche pour exposer le canal biliaire commun et utilisez une pince pour soulever légèrement l’extrémité duodénale du canal afin de localiser la papille de Vater.Utilisez un hémostat pour serrer le canal biliaire au niveau de la papille duodénale afin d’éviter les fuites de l’agarose du canal dans le duodénum et utilisez une petite pince pointue pour atteindre sous le canal biliaire commun afin de briser la membrane qui attache le canal au tissu pancréatique. Après avoir éliminé autant de graisse et de tissu conjonctif que possible du canal, placez le canal perpendiculairement sur les extrémités d’une paire de pinces plus grandes et appuyez fermement sur le piston de la seringue, injectez l’agarose liquide visqueux dans l’extrémité proximale du canal biliaire commun pendant 20 à 30 secondes. Lorsque le tissu devient blanchâtre et légèrement distendu, retirez la seringue et versez lentement 20 millilitres de la solution extracellulaire glacée bouillonnante sur le pancréas pour refroidir le tissu et durcir l’agarose.Pour acquérir des tranches de tissu pancréatique, utilisez des pinces et des ciseaux fins et durs pour transférer doucement le pancréas injecté d’agarose dans une boîte de Petri de 100 millimètres contenant 40 millilitres de solution extracellulaire glacée. Faites tourbillonner le plat pour rincer le tissu et transférer le pancréas dans un deuxième plat de solution extracellulaire glacée. Utilisez la pince et les ciseaux pour couper la section blanchâtre et bien injectée du pancréas en six morceaux de 0,1 à 0,2 centimètre cube restants et retirez tout tissu conjonctif et adipeux restant des morceaux de tissu.Placez les blocs nettoyés dans une boîte de Petri à fond non collant de 35 millimètres contenant environ cinq millilitres d’agarose liquide de 40 degrés Celsius et placez immédiatement la boîte de Petri sur de la glace. Lorsque l’agarose a durci, tenez la boîte de Petri à l’envers sur le couvercle d’une boîte de Petri de 100 millimètres et utilisez la moitié d’une lame de rasoir pour couper soigneusement dans la marge entre la paroi latérale de la boîte de Petri et l’agarose pour éliminer l’agarose du plat. Utilisez la lame de rasoir pour couper des cubes individuels, chacun contenant un bloc tissulaire d’agarose, de l’agarose libérée et utilisez de la colle cyanoacrylate pour attacher les blocs à la plaque d’échantillon d’un vibratome.Remplissez la chambre de coupe du vibratome avec 150 millilitres de solution extracellulaire glacée continuellement bouillonnée de carbogène. Fixez la plaque d’échantillon sur le vibratome et montez une nouvelle lame de rasoir. Entourez la chambre de glace et ajoutez deux glaçons de 10 millilitres de volume fabriqués avec une solution extracellulaire complétée par six millimolaires de glucose.Réglez la trancheuse sur 0,05 à 1 millimètre par seconde et 70 hertz, puis commencez à trancher pour acquérir des tranches d’agarose de 140 microns d’épaisseur avec une surface de 20 à 100 millimètres carrés. Utilisez un pinceau fin pour transférer soigneusement chaque tranche dans une boîte de Petri de 100 millimètres remplie de 40 millimètres de tampon HEPES complété par six millimolaires de glucose. Pour la préparation du colorant calcique, dissoudre 50 microgrammes de colorant indicateur de calcium perméable aux cellules, 7,5 microlitres de DMSO, 2,5 microlitres du poloxamère et 6,667 millilitres de HBS dans un tube à bouchon à vis de 15 millilitres.Utilisez une pipette pour bien mélanger la solution pendant 20 secondes avant d’immerger le tube dans une chambre de bain à ultrasons et de le vortexer, chacun pendant 30 secondes. Ensuite, aliquote 3,333 millilitres de la solution de colorant indicateur de calcium résultante dans une boîte de Petri de 5 millilitres pour 10 tranches de tissu à étiqueter. Pour le chargement de colorant, utilisez un pinceau doux et fin pour transférer jusqu’à 10 tranches de tissu à chaque plat de solution de colorant et placez les plats sur un agitateur orbital pendant 50 minutes à température ambiante et 40 tours par minute à l’abri de la lumière.À la fin de l’incubation, transférer jusqu’à 20 tranches colorées dans des boîtes de Petri individuelles de 60 millilitres remplies de HBS sans colorant. Pour l’imagerie calcique par microscopie confocale, sélectionnez un grossissement de 20 ou 25 fois et réglez le mode d’acquisition sur l’imagerie time-lapse, le sténopé à 100 à 200 microns, ainsi que l’excitation et l’émission pour le fluorophore utilisé dans l’expérience. Montez la chambre d’enregistrement et le système de perfusion sur l’étage à température contrôlée du microscope et positionnez l’entrée et la sortie sur les bords éloignés de la chambre d’enregistrement.Réglez les débits d’entrée et de sortie à un à deux millilitres par minute. Réglez la température du système de profusion à 37 degrés Celsius et initiez la profusion avec la solution non stimulante. Pour enregistrer la dynamique du calcium du tissu, placez une seule tranche de tissu dans la chambre d’enregistrement et immobilisez le tissu avec un poids en platine en forme de U avec une maille de nylon tendue.Utilisez l’option de champ lumineux pour localiser la structure d’intérêt et utilisez l’imagerie en direct pour positionner les structures étudiées dans le champ de vision. Pour optimiser le rapport signal/bruit, ajustez la puissance du laser, l’amplification du détecteur et la moyenne des lignes tout en maintenant la puissance laser minimale. Ajustez le plan focal à 15 microns sous la surface coupée pour éviter l’enregistrement à partir de cellules potentiellement endommagées et acquérir les images.Réglage de la fréquence d’échantillonnage à un à deux hertz pour permettre la détection initiale des oscillations individuelles et l’enregistrement d’une image haute résolution. Si disponible, utilisez un tableau en ligne pour obtenir un retour instantané sur la réponse de préparation, le suréclairage, le photoblanchiment et la dérive mécanique. Lorsque toutes les images ont été acquises, enregistrez les données pour une analyse ultérieure.Ici, un exemple de tranche de tissu optimale peut être observé dans lequel le colorant indicateur de calcium perméable à la cellule a été chargé avec succès dans la tranche de tissu pancréatique. En revanche, ces tranches de tissu ne sont pas optimales pour l’imagerie en raison d’une pénétration infructueuse du colorant, d’un manque de cellules d’îlots ou d’une abondance de tissu nécrotique à la surface des échantillons. Les images à haute résolution d’une tranche de tissu pancréatique peuvent être utilisées pour délimiter des régions distinctes du tissu pancréatique, telles que les îlots de Langerhans, le tissu acineux ou le canal pancréatique.Les stimuli peuvent être utilisés pour discriminer fonctionnellement entre différentes cellules d’îlots ou entre les cellules d’îlots et non-îlots. Par exemple, les cellules bêta répondent généralement à une stimulation du glucose à impulsion carrée en présentant une augmentation transitoire du calcium intracellulaire suivie d’oscillations rapides du calcium sur un plateau soutenu. En revanche, les cellules non bêta répondent avec des oscillations plus rapides et plus irrégulières.Un retard dans l’apparition de l’augmentation du calcium intracellulaire après la stimulation, ainsi que l’hétérogénéité et les retards entre les cellules individuelles peuvent également être mesurés. Les mêmes paramètres peuvent être utilisés pour décrire la phase de désactivation. Ici, une présentation schématique de la durée, de la fréquence et du pourcentage de temps actif de l’oscillation calcique intracellulaire peut être observée.Lors de l’imagerie à des taux d’acquisition supérieurs à 10 hertz, les ondes de calcium qui se propagent à plusieurs reprises sur l’îlot peuvent être clairement reconnues. Serrez le canal biliaire commun aussi près que possible du duodénum pour éviter d’obstruer accidentellement la branche qui pénètre dans le pancréas. De plus, n’arrêtez pas d’enfoncer le piston pendant l’injection, car l’agarose durcira immédiatement dans l’aiguille.La technique de la tranche aiguë de tissu pancréatique de souris peut également être utilisée avec la méthode de la pince à patch pour étudier les courants de canaux ioniques et accéder à la cytose, ainsi que des études d’immunohistochimie et des études de secrétaire.

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Basées sur la fluorescence de mesure de l&#39;entrée du calcium magasin fonctionnant dans des cellules vivantes: à partir de cellules cancéreuses en culture de fibre musculaire squelettique

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Recherche

Biologie

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo suivi clonale de cellules souches hématopoïétiques et progénitrices Marqué par cinq protéines fluorescentes confocale et multiphotonique Microscopie

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Microscopie électronique à balayage du tissu macéré pour visualiser la matrice extracellulaire

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

Real Time In Vivo suivi des Thymocytes dans la chambre antérieure de le œil par microscopie à balayage Laser

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

Imagerie de la dynamique du calcium dans les sous-populations de cellules d'islet pancréatique de souris

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Examen de la dynamique nucléaire de levure de fission mitotique et méiotique par fluorescence Microscopie à cellules vivantes

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

Microscopie électronique à balayage par blocs série (SBF-SEM) d’échantillons de tissus biologiques

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...

Imaging of Mitochondrial Peroxide in Living Yeast Cells Using mtHyper7

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Advancing Mitochondrial Research Â– mtHyper7 Biosensor for Subcellular Analysis (Video) | JoVE

Imagerie de mtHyPer7, un biocapteur ratiométrique pour le peroxyde mitochondrial, dans des cellules de levure vivantes

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...

Intravital Imaging Using an Inverted Microscope to Track Skin Cell Dynamics

Streamlined Intravital Imaging Approach for Long-Term Monitoring of Epithelial Tissue Dynamics on an Inverted Confocal Microscope

Developing a Tool for Using Inverted Confocal Microscopes for In Vivo Intravital Imaging (Video) | JoVE

Approche simplifiée de l’imagerie intravitale pour la surveillance à long terme de la dynamique du tissu épithélial sur un microscope confocal inversé

Understanding normal and aberrant in vivo cell behaviors is necessary to develop clinical interventions to thwart disease initiation and progression. It ...

Biological Samples Preparation for Confocal Microscopy, Image Acquisition Setup, and Confocal Microscopy Imaging

Biological Samples Preparation for Confocal Microscopy, Image Acquisition Setup, and Confocal Microscopy Imaging (Video) | JoVE 

Préparation d’échantillons biologiques pour la microscopie confocale, la configuration d’acquisition d’images et l’imagerie par microscopie confocale