Name: confocal laser scanning microscopy of calcium dynamics in acute mouse pancreatic tissue slices
Uploaded: 2021-04-13T13:30:00
Duration: 10 min 49 s
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Die in dieser Studie vorgestellte Arbeit wurde von der slowenischen Forschungsagentur finanziell unterstützt (Forschungskernfinanzierung Nr. P3-0396 und I0-0029, sowie Forschungsprojekte Nr. J3-9289, N3-0048 und N3-0133) und vom Fonds zur Förderung der Wissenschaftlichen Forschung (bilaterale Zuschüsse I3562--B27 und I4319--B30). Wir danken Maruša Rošer, Maša Čater und Rudi Mlakar für die hervorragende technische Unterstützung.

Die Autoren erklären, dass die Forschung ohne kommerzielles oder finanzielles Interesse durchgeführt wurde.

Die Bauchspeicheldrüse von Säugetieren ist eine große exokrine und endokrine Drüse. Der exokrine Teil macht 96-99% des gesamten Pankreasvolumens aus und besteht aus Acini und Kanälen. Der endokrine Teil besteht aus einer großen Anzahl von Langerhans-Inseln, die die restlichen 1-4% des gesamten Bauchspeicheldrüsenvolumensausmachen 1. Der exokrine Teil sondert wichtige Verdauungsenzyme ab, die energiereiche Polymere in Lebensmitteln abbauen, sowie eine bicarbonatreiche Flüssigkeit, die sich mit anderen gastrointestinalen Sekreten verbindet, um eine Umgebung zu schaffen, die für die Wirkung von Enzymen geeignet ist. Der endokrine Teil sondert Hormone ab, die die postprandiale Verteilung, Speicherung und interprandiale Freisetzung von energiereichen Nährstoffen regulieren. Obwohl das exokrine Gewebe bei der Geburt relativ unterentwickelt und das endokrine relativ gut entwickelt ist, überwuchert das erstere beim Absetzen schnell das letztere 2,3,4. Frühe Studien der Pankreasfunktion markierten die Geburt der modernen Physiologie, und auf große methodische Fortschritte auf diesem Gebiet folgten große wissenschaftliche Breaktroughs5. Die Arbeit mit der Bauchspeicheldrüse ist aufgrund der komplizierten Struktur der Drüse technisch anspruchsvoll, aber auch eine große Motivation aufgrund von Krankheiten wie Bauchspeicheldrüsenkrebs, Pankreatitis und Diabetes, die eine große Bedrohung für die öffentliche Gesundheit darstellen und für die neuartige therapeutische Ansätze erforderlich sind.
Isolierte Inseln6, Acini 7,8 und duktale Fragmente wurden aufgrund ihrer Vorteile gegenüber Zelllinien und primär dispergierten endokrinen, acinaren und duktalen Zellen jahrzehntelang als Goldstandardmethoden entwickelt und verwendet 9,10. Trotz der deutlich verbesserten Funktion isolierter Zellkollektive sind diese Methoden immer noch mit erheblichem mechanischem und enzymatischem Stress verbunden, isolieren Zellen aus dem umgebenden Gewebe und damit ohne parakrine Interaktionen und mechanische Unterstützung und gehen vor allem mit signifikanten Veränderungen der normalen Physiologie einher11,12,13 . Der akute Pankreasgewebeschnitt der Maus wurde 2001 aus der Notwendigkeit heraus entwickelt, eine experimentelle Plattform ähnlich wie Gehirn-, Hypophysen- und Nebennierenschnitte mit konservierten interzellulären Kontakten, parakrinen Interaktionen, Mesenchym und Gewebearchitektur zu entwickeln, sowie ohne einige der wichtigsten Mängel der Goldstandardmethode in der Inselforschung dieser Zeit - die isolierten Inseln12, 14. Zu diesen Mängeln gehören Schäden an den äußersten Schichten, mangelnde Zugänglichkeit der Kerninselbereiche und die Notwendigkeit einer Kultivierung mit möglicherweise wichtigen Auswirkungen auf die Zellidentität und Physiologie12,15. Darüber hinaus ermöglicht die Gewebeschnittmethode Studien an Tiermodellen mit stark gestörter Inselarchitektur, bei denen es unmöglich ist, Inseln zu isolieren, oder wenn die Inselausbeute durch traditionelle Isolierung extrem niedrig ist 16,17,18,19,20,21.
Darüber hinaus eignet sich die Scheibe besser für die Untersuchung morphologischer Veränderungen während der Entwicklung von Diabetes und Pankreatitis, da sie einen besseren Überblick über das gesamte Gewebe ermöglicht und auch mit der Untersuchung regionaler Unterschiede kompatibel ist. Wichtig ist, dass die Gewebeschnittmethode trotz des frühen Fokus auf den endokrinen Teil von Natur aus die Untersuchung der exokrinen Komponentenermöglicht 9,22,23. Im ersten Jahrzehnt nach ihrer Einführung wurde die Methode für elektrophysiologische Untersuchungen von Beta-14,24,25,26,27,28,29- und Alpha-30,31-Zellen sowie zur Untersuchung der morphologischen und funktionellen Reifung der Bauchspeicheldrüse eingesetzt 2,3 . Ein Jahrzehnt später, im Jahr2013, wurde die Methode erfolgreich für die Lebendzell-Kalziumbildgebung von Inselzellen unter Verwendung von CLSM angepasst, um ihre Reaktionen auf Glukose32, ihre funktionellen Konnektivitätsmuster 33 und die Beziehung zwischen Membranpotential und intrazellulärem Kalzium zu charakterisieren, indem ein fluoreszierender Kalziumfarbstoff mit einem Membranpotentialfarbstoff34 kombiniert wurde. Später im selben Jahr wurde die Methode auch zur Beurteilung der Kalziumdynamik in Acinarzellen 22,35 angewendet. In den folgenden Jahren wurden Pankreasgewebeschnitte in einer Reihe von verschiedenen Studien verwendet und erfolgreich an Schweine- und menschliches Gewebe angepasst 9,36,37,38,39,40,41. Zusammengenommen wird die Kalziumbildgebung - in Mäuse-Pankreasgewebeschnitten im Allgemeinen und in Inseln im Besonderen - jedoch immer noch hauptsächlich von dieser Gruppe durchgeführt. Einer der Hauptgründe dafür könnte in der Kombination aus einer technisch anspruchsvollen Gewebeschnittpräparation, der Notwendigkeit eines konfokalen Mikroskops und einer recht komplexen Datenanalyse liegen. Das Hauptziel des vorliegenden Papiers ist es, diese leistungsstarke Methode für andere potenzielle Benutzer zugänglicher zu machen.
Es gibt bereits einige ausgezeichnete methodische Artikel, die sich ausführlich mit der Vorbereitung von Gewebeschnitten und der Verwendung von Scheiben für Struktur- und Sekretionsstudien befassen, jedoch nicht für die konfokale Kalziumbildgebung 9,42,43. Daher konzentriert sich dieses Papier auf einige zusätzliche Tipps und Tricks bei der Herstellung von Scheiben, auf Schritte, die für eine erfolgreiche Farbstoffladung, Bildaufnahme sowie auf die Hauptschritte der grundlegenden Kalziumdatenanalyse entscheidend sind. Daher sollte dieser Beitrag als Ergänzung und nicht als Alternative zu der oben genannten Methode betrachtet werden. In ähnlicher Weise ist die Kalziumbildgebung in Gewebeschnitten der Maus als experimenteller Ansatz zur Beantwortung spezifischer Fragen zu betrachten und ist daher eher komplementär als eine absolute Alternative zu anderen Calcium-Bildgebungsansätzen in der Pankreasphysiologie wie isolierte Kanäle oder Acini, isolierte Inseln, Organoide, in die Vorderkammer des Auges transplantierte Inseln, und Aufnahmen in vivo 11,44,45,46,47,48. Das Versprechen der Kalziumbildgebung in Pankreasgewebeschnitten der Maus wird wahrscheinlich am besten durch jüngste erfolgreiche Aufzeichnungen der Kalziumdynamik in mesenchymalen Inselzellen wie Perizyten49 undMakrophagen 50 sowie in duktalen Zellen23 veranschaulicht.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance KERN ALJ 120-4</td>
			<td>KERN &#38; SOHN GmbH</td>
			<td>ALJ 160-4A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope Leica TCS SP5 II Upright setup</td>
			<td>Leica</td>
			<td>5100001578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope Leica TCS SP5 AOBS Tandem II setup</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork pad 15 cm x 15 cm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>CLS430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Round Ice Bucket with Lid, 4 L</td>
			<td>Fischer Scientific, Leicestershire, UK</td>
			<td>432124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge razor blade</td>
			<td>Personna, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes 0.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 121.023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask 200 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>027.01.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - ToughCut</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat orbital shaker&#160; IKA KS 260 basic</td>
			<td>IKA</td>
			<td>Ident. No.: 0002980200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass lab bottle 1000 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>091.01.901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hartman Hemostat, curved</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>13003-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX APO L 20x/1.00 W HCX APO L (water immersion objective, 20x, NA 1.0)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15507701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring cylinder 25 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>015.01.025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator Control box SM-7, Keypad SM-7</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>&#160;200-100 900 7311, 200-100 900 9050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave owen</td>
			<td>Gorenje, Slovenia</td>
			<td>MO20MW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer Gonotec 010</td>
			<td>Gonotec, Berlin, Germany</td>
			<td>OSMOMAT 010 Nr. 01-02-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush</td>
			<td>Faber-Castell, No.2</td>
			<td></td>
			<td>Any thin soft round paint brush No.2, preferably black</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perifusion pumps</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>ISM 827</td>
			<td>Reglo Analog MS - 4/8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100/20 mm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35/10 mm</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>627102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35 x 10 mm Nunclon Delta</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA</td>
			<td>153066</td>
			<td>NON-STICKY for agarose blocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter inoLab pH Level 1</td>
			<td>WTW, Weilheim, Germany</td>
			<td>E163694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 1000 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3121 000.120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 50 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3121 000.066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Push pins 23 mm</td>
			<td>Deli, Ningbo, China</td>
			<td>E0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tube, 15 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semken Forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>11008-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stabilizing ring for Erlenmeyer flask</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>027.11.048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope Nikon SMZ 745</td>
			<td>Nikon, Melville, NY USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Injekt Solo 5 mL</td>
			<td>Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>4606051V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle 0.30 x 12 mm (30 G x 1/2&#34;)</td>
			<td>Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>4656300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>200-100 500 0150, 200-150-500-145</td>
			<td>Slice mini chamber, Temperature controller TC 07</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubings for perifusion system</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>SC0310</td>
			<td>Ismatec Pharmed 1.14 mm(ID) + silicone tubing 1.0 (ID) x 1.8 mm(OD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath Studio GT-7810A</td>
			<td>Globaltronics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrotome Leica VT 1000 S</td>
			<td>Leica, Nussloch, Germany</td>
			<td>14047235613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetric flask 1000 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>013.01.910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer Neolab 7-2020</td>
			<td>Neolab</td>
			<td>&#160;7-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath Thermo Haake open-bath circulator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Z527912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material/Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate - CaCl2.2H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4540-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-lactic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>L1250-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas mixture containing 95% O2 and 5% CO2 at barometric pressure</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue Wekem sekundenkleber WK-110</td>
			<td>Wekem GmbH, Bergkamen, Germany</td>
			<td>WK 110-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>H3375-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(+)-ascorbic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>A9,290-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate - MgCl2.2H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>M2670-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myo-inositol</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>I5125-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon Green 488 BAPTA-1, AM</td>
			<td>Invitrogen (Thermo FisherScientific)</td>
			<td>O6807</td>
			<td>cell-permeable Ca2+ indicator (excitation/emission: 495/523 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO)</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td>polaxamer: nonionic triblock copolymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride - KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>31248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaPlaque GTG agarose</td>
			<td>Lonza, Rockland, USA</td>
			<td>50111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate - NaHCO3</td>
			<td>Honeywell, Germany</td>
			<td>31437-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride - NaCl</td>
			<td>Honeywell, Germany</td>
			<td>31434-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide - NaOH</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>30620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic- NaH2PO4</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>S0751-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>15990-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>FIJI is an open source project</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LASAF</td>
			<td>Leica microsystems, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python</td>
			<td>Python Software Foundation</td>
			<td></td>
			<td>Python is an open source project</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal laser scanning microscopy of calcium dynamics in acute mouse pancreatic tissue slices

Der akute Pankreasgewebeschnitt der Maus ist ein einzigartiges In-situ-Präparat mit erhaltener interzellulärer Kommunikation und Gewebearchitektur, das deutlich weniger präparationsinduzierte Veränderungen mit sich bringt als isolierte Inseln, Acini, Kanäle oder dispergierte Zellen, die in typischen In-vitro-Studien beschrieben werden. Durch die Kombination des akuten Pankreasgewebeschnitts mit der Lebendzell-Kalziumbildgebung in der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) können Calciumsignale in einer großen Anzahl von endokrinen und exokrinen Zellen gleichzeitig mit einer Einzelzell- oder sogar subzellulären Auflösung untersucht werden. Die Empfindlichkeit ermöglicht die Detektion von Veränderungen und ermöglicht die Untersuchung von interzellulären Wellen und funktioneller Konnektivität sowie die Untersuchung der Abhängigkeit physiologischer Reaktionen von Zellen von ihrer Lokalisation innerhalb der Insel- und parakrinen Beziehung zu anderen Zellen. Aus Sicht des Tierschutzes senkt die Aufzeichnung von Signalen von einer großen Anzahl von Zellen gleichzeitig die Anzahl der Tiere, die in Versuchen benötigt werden, und trägt zum 3R-Ersatz-, Reduktions- und Verfeinerungsprinzip bei.

Die Injektion der Agaroselösung in den Pankreasgang ist der kritischste Schritt bei der Herstellung von Pankreasgewebeschnitten. Eine erfolgreiche Injektion kann an einer Aufhellung des Pankreasgewebes erkannt werden, wie auf der linken Seite von Abbildung 3A zu sehen ist, während ein unvollständig injizierter Teil der Bauchspeicheldrüse auf der rechten Seite von Abbildung 3A dargestellt ist. Die Langerhans-Inseln sind mit bloßem Auge oder unter einem Stereomikroskop zu erkennen, was dazu beiträgt, die entsprechenden Teile der Bauchspeicheldrüse für die anschließende Einbettung in Agaroseblöcke zu schneiden (Abbildung 3B). In einer frisch geschnittenen Mäuse-Pankreasgewebescheibe lassen sich Langerhans-Inseln leicht vom umgebenden exokrinen Gewebe und Mesenchym als weiße Flecken unter dem Stereomikroskop (Bild 3C) oder als bräunliche Strukturen unter dem Lichtmikroskop unterscheiden (Abbildung 3D). Die Pankreasgewebeschnitte können für verschiedene Arten von Experimenten für mindestens 12 h nach dem Schneiden verwendet werden. Neben der grobmorphologischen Beurteilung unter dem Stereomikroskop, dem Lichtmikroskop und den funktionellen Reaktionen der Zellen während der Kalziumbildgebung kann die Lebensfähigkeit der Pankreasgewebeschnitte beurteilt werden (Abbildung 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig04.jpg"> Abbildung 4: Lebensfähigkeit von Zellen innerhalb des Gewebeschnitts. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit dem Lebend-/Toten-Assay bestimmt. Lebende Zellen werden durch Calcein AM gefärbt (grün dargestellt), während tote Zellen mit Ethidium homodimer-1 (rot dargestellt) gefärbt sind. Gelbe Linien kennzeichnen die Position des X-Y-Querschnitts des unten und rechts angezeigten Z-Stacks. Die volle Tiefe des Z-Stacks beträgt 88 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Für Calcium-Imaging-Experimente muss der fluoreszierende Kalzium-Indikator durch einige Zellschichten eindringen. Abbildung 5A zeigt das erfolgreiche Laden des zelldurchlässigen Ca2+ Indikatorfarbstoffs in den Pankreasgewebeschnitt, in dem einzelne Insel- und Azinuszellen erkannt werden können. Im Gegensatz dazu sind die Scheiben in Abbildung 5B-D aufgrund des erfolglosen Eindringens des Farbstoffs (Abbildung 5B), des Fehlens von Inselzellen (Abbildung 5C) und einer Menge nekrotischem Gewebes auf der Oberfläche (Abbildung 5D) nicht optimal. Solche Scheiben können verworfen, auf das Vorhandensein zusätzlicher Inseln, die besser geschnitten oder gefärbt sind, überprüft werden (siehe Tabelle 1 zur Fehlerbehebung) oder zur Aufzeichnung der Reaktionen exokriner Zellen verwendet werden.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig05.jpg"> Abbildung 5: Beispiele für verwendbare und unbrauchbare Präparate . (A) Ein Beispiel für eine erfolgreiche Präparation des Pankreasgewebeschnitts mit gut gefärbten Zellen auf den Langerhans-Inseln sowie duktalen Zellen und umgebendem Acinargewebe. (B) Ein Beispiel für eine schlecht gefärbte Gewebescheibe. (C) Beispiel einer Langerhans-Insel mit strukturellen Abbrüchen. (D) Ein Beispiel für eine Langerhans-Insel, die viele abgestorbene Zellen und viele Trümmer enthält. Die Nachschlagetabelle "glow-over, glow-under" auf der rechten Seite zeigt 0 Intensität in Grün und Sättigung in Blau. Maßstabsleiste = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Repräsentative Ergebnisse der Kalziumbildgebung unter Verwendung des zelldurchlässigen Indikatorfarbstoffs Ca2+ sind in Abbildung 6 dargestellt. In Abbildung 6A ist ein hochauflösendes Bild einer Pankreasgewebescheibe dargestellt, die eine Langerhans-Insel, Acin-Gewebe und einen Pankreasgang enthält. Zur besseren Unterscheidung sind der in Abbildung 6A dargestellte endokrine, exokrine und duktale Teil der Pankreasgewebescheibe in Abbildung 6B eingefärbt. Die Verwendung geeigneter Reize kann funktionell zwischen verschiedenen Inselzellen oder Insel- und Nicht-Inselzellenunterscheiden 51. Betazellen reagieren typischerweise auf eine quadratische Pulsstimulation durch Glukose mit einem vorübergehenden Anstieg des [Ca2+]IC, gefolgt von schnellen Kalziumschwingungen auf einem anhaltenden Plateau (Abbildung 6C, oberes Panel).
Da alle Betazellen zu einem einzigen, großen, funktionellen Synzytium gekoppelt sind, sind diese Schwingungen auch zwischen verschiedenen Zellen sehr gut synchronisiert, indem sie [Ca2+]IC-Wellen 32,34,52,53,54 ausbreiten (Abbildung 7C). Langsamere [Ca2+]IC-Schwingungen mit einer Periode von 5-15 Minuten können den schnellen Schwingungen zugrunde liegen oder sogar die vorherrschende Art von Reponse55,56 sein. Das gleiche einfache Protokoll kann andere Arten von Antworten aufdecken, insbesondere an der Peripherie von Inseln (Abbildung 6C, unteres Bild). Da diese Zellen nicht mit Betazellen synchronisiert sind und mit schnelleren und unregelmäßigeren Schwingungen reagieren, die bereits unter Bedingungen mit niedriger Glukose oder mit einer Abnahme der Aktivität vorhanden sind, deuten solche Reaktionen stark auf Nicht-Beta-Zellenhin 21,32,57,58. Ihre endgültige funktionelle Charakterisierung erfordert jedoch komplexere Protokolle mit zusätzlichen Stimulationsschritten oder alternativen Ansätzen, die im Folgenden erläutert werden. Typische Reaktionen von Acinaren und duktalen Zellen sind in Abbildung 6D bzw. Abbildung 6E dargestellt. Weitere Informationen zu Acinar und duktalen Zellen finden Sie in der Literatur22,23,35.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig06.jpg"> Abbildung 6: Repräsentative Ergebnisse der Calciumdynamik in verschiedenen Arten von Pankreaszellen . (A) Ein hochauflösendes Bild einer Langerhans-Insel mit umgebendem Gewebe. Maßstabsstab = 100 μm. (B) Abgrenzung verschiedener Teile des Pankreasgewebes mit Azinargewebe in Gelb, einer Langerhans-Insel in Rot und einem Segment des duktalen Baumes in Blau. Skalenbalken = 100 μm. (C) Typische Spuren der Calciumdynamik in Beta- und mutmaßlichen Nicht-Beta-Zellen während der Stimulation mit 12 mM Glukose; 3 mM Glukose wurde für nicht-stimulierende Bedingungen verwendet. Protokolle, die für eine spezifischere Unterscheidung von Nicht-Beta-Zellen verwendet werden können, werden im Diskussionsabschnitt beschrieben. (D) Eine typische Spur der Calciumdynamik von Acinarenzellen, die durch 25 nM Acetylcholin stimuliert wird. (E) Eine typische Spur der Calciumdynamik von duktalen Zellen, die durch 1 mM Chenodesoxycholsäure stimuliert wird. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Nach erfolgreicher Calciumbildgebung werden die Daten zunächst exportiert und für das Bleichen durch eine Kombination aus exponentieller und linearer Anpassung korrigiert, wie im Protokollabschnitt beschrieben. Eine Zeitreihe vor und nach der Bleichkorrektur ist in Abbildung 7A dargestellt. Danach können mehrere Parameter in der Aktivierungs- und Deaktivierungsphase der Antwort sowie der Plateauphase analysiert werden. Eine Verzögerung des Beginns des [Ca2+]IC-Anstiegs nach Stimulation kann gemessen werden, dargestellt durch VerzögerungA in Abbildung 7B und die Heterogenität der Verzögerungen zwischen einzelnen Zellen (VerzögerungA1). Die gleichen Parameter (VerzögerungD und VerzögerungD1) können verwendet werden, um die Deaktivierungsphase zu beschreiben. Nach dem anfänglichen transienten [Ca 2+]IC-Anstieg ist die Plateauphase in den meisten Betazellen der Bauchspeicheldrüse auf einer Insel durch relativ regelmäßige hochfrequente [Ca2+]IC-Schwingungen gekennzeichnet. Die Plateauphase kann durch Analyse der klassischen Funktionsparameter beschrieben werden. Die schematische Darstellung der [Ca2+]IC-Schwingungsdauer, -frequenz und des Prozentsatzes der aktiven Zeit ist in Abbildung 7C dargestellt. In der Kalziumbildgebung mit Aufnahmeraten von mehr als 10 Hz können auch Kalziumwellen, die sich wiederholt über die Insel ausbreiten, deutlich erkannt werden (Abbildung 7C).
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig07.jpg"> Abbildung 7: Analyse von Zeitreihendaten. (A) Korrektur von Zeitreihendaten für das Photobleichen. (B) Analyse von Verzögerungen bei der Aktivierung nach der Stimulation und der Deaktivierung nach Beendigung der Stimulation mit 12 mM Glukose. Die Dauer der Stimulation wird durch den hellgrauen, schattierten Balken im Bild angegeben. (C) Analyse mehrerer Parameter der Plateauphase: I) Dauer der Schwingung, bestimmt in halber Höhe, II) Frequenz der Schwingungen, bestimmt durch Interoszillationsintervalle. III) aktive Zeit als Produkt aus Häufigkeit und Dauer von Schwingungen. I-IV) Verzögerungen zwischen Schwingungen in einer gegebenen Welle von Schwingungen, die sich über die Langerhans-Insel ausbreiten, bestimmt durch die Verzögerungen (Δt) in der Zeit, in der eine einzelne Zelle die halbe Höhe der Schwingung erreicht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Tabelle 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/Table%201%20(3).xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>

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Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices

Wir präsentieren die Herstellung von akuten Pankreasgewebeschnitten und deren Verwendung in der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie, um die Calciumdynamik gleichzeitig in einer großen Anzahl lebender Zellen, über lange Zeiträume und mit hoher raumzeitlicher Auflösung zu untersuchen.

Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie der Calciumdynamik in akuten Pankreasgewebeschnitten der Maus

The acute mouse pancreatic tissue slice is a unique in situ preparation with preserved intercellular communication and tissue architecture that entails ...

In Kombination mit der Live-Cell-Calcium-Bildgebung ermöglicht die akute Pankreas-Gewebeschnitttechnik die Untersuchung von interzellulären Wellen und multizellulärer funktioneller Konnektivität mit einer hohen Auflösung über lange Zeiträume. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie schnell ist, die Gewebearchitektur bewahrt und begrenzte enzymatische und mechanische Spannungen reduziert, während sie eine hohe Gewebeausbeute beibehält. Durch die Erkennung funktioneller und morphologischer Veränderungen während des Krankheitsverlaufs hilft diese Technik unserem Verständnis der Pankreaserkrankungen wie Diabetes.Diese Gewebeschnitttechnik kann auf Gehirn-, Hypophysen- und Nebennierengewebe angewendet werden, wobei der Schwerpunkt auf der Erhaltung des interzellulären Kontakts, parakriner Interaktionen und der Gewebearchitektur liegt. Um sich auf die Injektion von Agarose in die Bauchspeicheldrüse der Maus vorzubereiten, füllen Sie eine Fünf-Milliliter-Spritze mit 40 Grad Celsius flüssiger Agarose und statten Sie die Spritze mit einer 30-Gauge-Nadel aus. Nachdem Sie die Nadel vorsichtig mit einer Kappe bedeckt haben, legen Sie das Spritzennadelende mit dem gesamten Volumen der Agarose unter der Wasseroberfläche in ein 40 Grad Celsius heißes Wasserbad.Blasen Sie eine Flasche extrazelluläre Lösung mit Carbogen, kontinuierlich auf Eis, mit 1,5 Millilitern pro Minute bei Luftdruck und Raumtemperatur, um eine Sauerstoffversorgung und einen pH-Wert von 7,4 zu gewährleisten. Um die Agarose-Injektion durchzuführen, legen Sie eine eingeschläferte erwachsene Maus unter ein Stereomikroskop und greifen Sie per Laparotomie auf den Mausbauch zu. Bewegen Sie den Darm vorsichtig auf die linke Seite, um den gemeinsamen Gallengang freizulegen, und verwenden Sie eine Pinzette, um das Zwölffingerdarmende des Kanals leicht anzuheben, um die Papille von Vater zu lokalisieren.Verwenden Sie einen Hämostat, um den Gallengang an der Zwölffingerdarmpapille zu klemmen, um ein Austreten der Agarose aus dem Kanal in den Zwölffingerdarm zu verhindern, und verwenden Sie eine kleine scharfe Pinzette, um unter den gemeinsamen Gallengang zu gelangen, um die Membran zu brechen, die den Kanal am Pankreasgewebe befestigt. Nachdem Sie so viel Fett und Bindegewebe wie möglich aus dem Kanal entfernt haben, legen Sie den Kanal senkrecht auf die Spitzen einer größeren Pinzette und drücken Sie fest auf den Spritzenkolben, injizieren Sie die viskose flüssige Agarose für 20 bis 30 Sekunden in das proximale Ende des gemeinsamen Gallengangs. Wenn das Gewebe weißlich und leicht aufgebläht wird, entfernen Sie die Spritze und gießen Sie langsam 20 Milliliter der sprudelnden eiskalten extrazellulären Lösung auf die Bauchspeicheldrüse, um das Gewebe zu kühlen und die Agarose zu härten.Um Pankreasgewebescheiben zu erhalten, verwenden Sie eine Pinzette und eine feine, zähe Schnittschere, um die injizierte Bauchspeicheldrüse mit Agarose sanft in eine 100-Millimeter-Petrischale zu übertragen, die 40 Milliliter eiskalte extrazelluläre Lösung enthält. Schwenken Sie die Schale, um das Gewebe zu spülen, und übertragen Sie die Bauchspeicheldrüse in eine zweite Schale eiskalter extrazellulärer Lösung. Schneiden Sie mit der Pinzette und der Schere den weißlichen, gut injizierten Bauchspeicheldrüsenabschnitt in bis zu sechs 0,1 bis 0,2 Kubikzentimeter große Stücke und entfernen Sie verbleibendes Binde- und Fettgewebe aus den Gewebestücken.Die gereinigten Blöcke in eine 35 Millimeter schwere, nicht klebrige Boden-Petrischale mit etwa fünf Millilitern 40 Grad Celsius flüssiger Agarose geben und die Petrischale sofort auf Eis legen. Wenn die Agarose ausgehärtet ist, halten Sie die Petrischale kopfüber über den Deckel einer 100 Millimeter großen Petrischale und schneiden Sie mit einer halben Rasierklinge vorsichtig in den Rand zwischen der Seitenwand der Petrischale und der Agarose, um die Agarose aus der Schale zu entfernen. Verwenden Sie die Rasierklinge, um einzelne Würfel, die jeweils einen Gewebeblock Agarose enthalten, aus der befreiten Agarose zu schneiden und verwenden Sie Cyanacrylatkleber, um die Blöcke an der Probenplatte eines Vibratoms zu befestigen.Füllen Sie die Schneidkammer des Vibratoms mit 150 Millilitern eiskalter extrazellulärer Lösung, die kontinuierlich mit Carbogen aufgeblasen wird. Schrauben Sie die Probenplatte auf das Vibratom und montieren Sie eine neue Rasierklinge. Umgeben Sie die Kammer mit Eis und fügen Sie zwei 10-Milliliter-Volumen-Eiswürfel hinzu, die mit extrazellulärer Lösung hergestellt werden, die mit sechs Millimolaren Glukose ergänzt wird.Stellen Sie den Slicer auf 0,05 bis 1 Millimeter pro Sekunde und 70 Hertz ein und beginnen Sie dann mit dem Schneiden, um 140 Mikron dicke Agarosescheiben mit einer Oberfläche von 20 bis 100 Quadratmillimetern zu erhalten. Verwenden Sie einen feinen Pinsel, um jede Scheibe vorsichtig in eine 100-Millimeter-Petrischale zu geben, die mit 40 Millimetern HEPES-Puffer gefüllt ist, ergänzt durch sechs Millimolare Glukose. Für die Herstellung von Calciumfarbstoffen werden 50 Mikrogramm zelldurchlässiger Calciumindikatorfarbstoff, 7,5 Mikroliter DMSO und 2,5 Mikroliter Poloxamer sowie 6,667 Milliliter HBS in einem 15-Milliliter-Schraubverschlussrohr gelöst.Verwenden Sie eine Pipette, um die Lösung 20 Sekunden lang gründlich zu mischen, bevor Sie das Rohr in eine Ultraschallbadkammer tauchen und jeweils 30 Sekunden lang wirbeln. Dann aliquot 3,333 Milliliter der resultierenden Calciumindikator-Farbstofflösung in eine 5 Milliliter Petrischale pro 10 Scheiben Gewebe zu etikettieren. Verwenden Sie zum Aufladen des Farbstoffs einen dünnen weichen Pinsel, um bis zu 10 Gewebescheiben auf jede Schale mit Farbstofflösung zu übertragen, und legen Sie die Schalen für 50 Minuten bei Raumtemperatur und 40 Umdrehungen pro Minute vor Licht geschützt auf einen Orbitalschüttler.Am Ende der Inkubation bis zu 20 gefärbte Scheiben in einzelne 60-Milliliter-Petrischalen geben, die mit farbstofffreiem HBS gefüllt sind. Für die Kalziumbildgebung durch konfokale Mikroskopie wählen Sie eine 20- oder 25-fache Vergrößerung und stellen Sie den Erfassungsmodus auf Zeitraffer-Bildgebung, das Loch auf 100 bis 200 Mikrometer und die Anregung und Emission für das im Experiment verwendete Fluorophor ein. Montieren Sie die Aufnahmekammer und das Perfusionssystem auf dem temperaturgesteuerten Tisch des Mikroskops und positionieren Sie den Ein- und Auslass an den äußersten Rändern der Aufnahmekammer.Stellen Sie die Zu- und Abflussraten auf ein bis zwei Milliliter pro Minute ein. Stellen Sie die Temperatur des Füllkörpersystems auf 37 Grad Celsius ein und initiieren Sie die Fülle mit der nicht-stimulierenden Lösung. Um die Kalziumdynamik des Gewebes aufzuzeichnen, legen Sie eine einzelne Gewebescheibe in die Aufnahmekammer und immobilisieren Sie das Gewebe mit einem U-förmigen Platingewicht mit einem straffen Nylonnetz.Verwenden Sie die Hellfeldoption, um die gewünschte Struktur zu lokalisieren, und verwenden Sie Live-Bildgebung, um die untersuchten Strukturen im Sichtfeld zu positionieren. Um das Signal-Rausch-Verhältnis zu optimieren, passen Sie die Laserleistung, die Detektorverstärkung und das Line-Averaging Binning an, während die Laserleistung minimal gehalten wird. Stellen Sie die Brennebene auf 15 Mikrometer unter der Schnittfläche ein, um die Aufnahme von potenziell beschädigten Zellen zu vermeiden, und erfassen Sie die Bilder.Einstellung der Abtastfrequenz auf ein bis zwei Hertz, um die anfängliche Erkennung einzelner Schwingungen und die Aufnahme eines hochauflösenden Bildes zu ermöglichen. Falls verfügbar, verwenden Sie ein Online-Diagramm, um sofortiges Feedback zur Vorbereitungsreaktion, zur Überbeleuchtung, zum Fotobleichen und zur mechanischen Drift zu erhalten. Wenn alle Bilder aufgenommen wurden, speichern Sie die Daten für eine spätere Analyse.Hier kann ein Beispiel für eine optimale Gewebescheibe beobachtet werden, bei der der zelldurchlässige Calciumindikatorfarbstoff erfolgreich in die Pankreasgewebescheibe geladen wurde. Im Gegensatz dazu sind diese Gewebeschnitte aufgrund einer erfolglosen Farbstoffpenetration, eines Mangels an Inselzellen oder einer Fülle von nekrotischem Gewebe auf der Probenoberfläche nicht optimal für die Bildgebung. Hochauflösende Bilder einer Pankreasgewebescheibe können verwendet werden, um verschiedene Regionen des Pankreasgewebes abzugrenzen, wie die Langerhans-Inseln, das Acin-Gewebe oder den Pankreasgang.Reize können verwendet werden, um funktionell zwischen verschiedenen Inselzellen oder zwischen Insel- und Nicht-Inselzellen zu unterscheiden. Zum Beispiel reagieren Betazellen typischerweise auf eine Glukosestimulation mit quadratischem Puls, indem sie einen vorübergehenden Anstieg des intrazellulären Kalziums aufweisen, gefolgt von einer schnellen Kalziumschwingung auf einem anhaltenden Plateau. Im Gegensatz dazu reagieren Nicht-Beta-Zellen mit schnelleren und unregelmäßigeren Schwingungen.Eine Verzögerung des Beginns des intrazellulären Kalziumanstiegs nach Stimulation sowie die Heterogenität und Verzögerungen zwischen einzelnen Zellen können ebenfalls gemessen werden. Die gleichen Parameter können verwendet werden, um die Deaktivierungsphase zu beschreiben. Hier kann eine schematische Darstellung der intrazellulären Calciumoszillationsdauer, -frequenz und des Prozentsatzes der aktiven Zeit beobachtet werden.Bei der Bildgebung mit Aufnahmeraten von mehr als 10 Hertz können Kalziumwellen, die sich wiederholt über die Insel ausbreiten, deutlich erkannt werden. Klemmen Sie den gemeinsamen Gallengang so nah wie möglich an den Zwölffingerdarm, um zu verhindern, dass der Ast, der in die Bauchspeicheldrüse eintritt, versehentlich verschlossen wird. Hören Sie auch nicht auf, den Kolben während der Injektion zu drücken, da die Agarose sofort in der Nadel aushärtet.Die Akute Pankreasgewebeschnitttechnik der Maus kann auch mit der Patch-Clamp-Methode verwendet werden, um Ionenkanalströme und Zugangszytose sowie immunhistochemische Studien und Sekretärinnenstudien zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluoreszenz-basierte Messung von Calcium-Shop-Eintrag in lebenden Zellen: aus kultivierten Krebszelle zu Skelettmuskelfaser

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Forschung

Biologie

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine ​​mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Rasterelektronenmikroskopie von Mazerierte Gewebe zu visualisieren die extrazelluläre Matrix

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

Echtzeit- In Vivo Verfolgung von Thymozyten in die Vorderkammer des Auges durch Laser-Scanning-Mikroskopie

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

Bildgebende Calciumdynamik in Subpopulationen von Maus-Pankreas-Islet-Zellen

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Untersuchung der Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics durch Fluoreszenz-Livezellmikroskopie

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

Serielle Block-Face-Rasterelektronenmikroskopie (SBF-REM) biologischer Gewebeproben

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...

Imaging of Mitochondrial Peroxide in Living Yeast Cells Using mtHyper7

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Advancing Mitochondrial Research Â– mtHyper7 Biosensor for Subcellular Analysis (Video) | JoVE

Bildgebung von mtHyPer7, einem ratiometrischen Biosensor für mitochondriales Peroxid, in lebenden Hefezellen

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...

Intravital Imaging Using an Inverted Microscope to Track Skin Cell Dynamics

Streamlined Intravital Imaging Approach for Long-Term Monitoring of Epithelial Tissue Dynamics on an Inverted Confocal Microscope

Developing a Tool for Using Inverted Confocal Microscopes for In Vivo Intravital Imaging (Video) | JoVE

Optimierter intravitaler Bildgebungsansatz für die Langzeitüberwachung der Dynamik des Epithelgewebes auf einem inversen konfokalen Mikroskop

Understanding normal and aberrant in vivo cell behaviors is necessary to develop clinical interventions to thwart disease initiation and progression. It ...

Biological Samples Preparation for Confocal Microscopy, Image Acquisition Setup, and Confocal Microscopy Imaging

Biological Samples Preparation for Confocal Microscopy, Image Acquisition Setup, and Confocal Microscopy Imaging (Video) | JoVE 

Biologische Probenvorbereitung für konfokale Mikroskopie, Bildaufnahmeaufbau und konfokale Mikroskopie-Bildgebung