Name: confocal laser scanning microscopy of calcium dynamics in acute mouse pancreatic tissue slices
Uploaded: 2021-04-13T13:30:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices at JoVE.com

העבודה שהוצגה במחקר זה נתמכה כספית על ידי סוכנות המחקר הסלובנית (מס' מימון ליבה למחקר). P3-0396 ו- I0-0029, כמו גם פרויקטים מחקריים. J3-9289, N3-0048 ו- N3-0133) ועל ידי קרן המדע האוסטרית / Fonds zur Förderung der Wissenschaftlichen Forschung (מענקים דו-צדדיים I3562--B27 ו- I4319--B30). אנו מודים למרושה רושר, למאשה צ'טר ולרודי מלקאר על סיוע טכני מצוין.

המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר כל אינטרס מסחרי או כספי.

הלבלב של היונקים הוא בלוטה אקסוקרינית ואנדוקרינית גדולה. החלק האקסוקריני מהווה 96-99% מנפח הלבלב הכולל ומורכב מאצ'יני ותעלות. החלק האנדוקריני מורכב ממספר רב של איים של לנגרהנים המהווים את 1-4% הנותרים של נפח הלבלב הכולל1. החלק האקסוקריני מפריש אנזימי עיכול עיקריים המפרקים פולימרים עשירים באנרגיה במזון, כמו גם נוזל עשיר בביקרבונט, המשלב הפרשות אחרות במערכת העיכול כדי לספק סביבה המתאימה לפעולה של אנזימים. החלק האנדוקריני מפריש הורמונים המווסתים את ההתפלגות, האחסון והשחרור הבין-פרינדיאלי של חומרים מזינים עשירים באנרגיה. אף על פי שהרקמה האקסוקרינית אינה מפותחת יחסית והאנדוקרינית מפותחת יחסית בלידה, הראשונה מתגברת במהירות על האחרונה עם גמילהשל 2,3,4. מחקרים מוקדמים על תפקוד הלבלב סימנו את לידתה של הפיזיולוגיה המודרנית, וההתקדמות המתודולוגית העיקרית בתחום לוותה בשברים מדעיים גדולים5. העבודה עם הלבלב היא מאתגרת מבחינה טכנית בשל המבנה המורכב של הבלוטה, אך היא גם מוטיבציה גדולה בגלל מחלות כמו סרטן הלבלב, דלקת הלבלב וסוכרת המהוות איומים גדולים על בריאות הציבור, ואשר עבורן יש צורך בגישות טיפוליות חדשניות.
איים מבודדים6, אצ'יני 7,8 ושברי צינורות פותחו ושימשו במשך עשרות שנים כשיטות תקן זהב בשל יתרונותיהם בהשוואה לקווי תאים ותאים אנדוקריניים, אצינריים ותאים דוקטליים מפוזרים ראשוניים 9,10. למרות התפקוד המשופר במידה ניכרת של קולקטיבים של תאים מבודדים, שיטות אלה עדיין כרוכות בלחץ מכני ואנזימטי ניכר, מבודדות תאים מהרקמה הסובבת ולכן חסרות אינטראקציות פאראקריניות ותמיכה מכנית, והכי חשוב, מלוות בשינויים משמעותיים בפיזיולוגיה הרגילה 11,12,13 . פרוסת רקמת הלבלב החריפה של העכבר פותחה בשנת 2001 מתוך צורך נתפס לפתח פלטפורמה ניסיונית הדומה לפרוסות מוח, יותרת המוח ואדרנל עם מגעים בין-תאיים משומרים, אינטראקציות פאראקרין, מזנכים וארכיטקטורת רקמות, כמו גם ללא כמה מהחסרונות החשובים ביותר של שיטת תקן הזהב במחקר האיים של אותה תקופה - האיים המבודדים12, 14. בין החסרונות הללו ניתן למנות את הפגיעה בשכבות החיצוניות ביותר, היעדר נגישות לאזורי הליבה של האיים, והצורך בטיפוח עם השפעות חשובות על זהות התא ועל הפיזיולוגיה12,15. יתר על כן, שיטת פרוסת הרקמה מאפשרת מחקרים על מודלים של בעלי חיים עם ארכיטקטורת איים מעוותת באופן גס, שבהם לא ניתן לבודד איים, או כאשר תפוקת האיים נמוכה ביותר על ידי בידוד מסורתי 16,17,18,19,20,21.
בנוסף, הפרוסה מתאימה יותר לחקר שינויים מורפולוגיים במהלך התפתחות סוכרת ודלקת הלבלב, למשל, מכיוון שהיא מאפשרת סקירה טובה יותר של הרקמה כולה ותואמת גם את חקר ההבדלים האזוריים. חשוב לציין שלמרות ההתמקדות המוקדמת בחלק האנדוקריני, שיטת פרוסת הרקמה מאפשרת מטבעה לחקור את הרכיבים האקסוקריניים 9,22,23. במהלך העשור הראשון לאחר הצגתה, נעשה שימוש בשיטה למחקרים אלקטרופיזיולוגיים של תאי בטא 14,24,25,26,27,28,29 ואלפא30,31 וכן לבחינת ההבשלה המורפולוגית והתפקודית של הלבלב 2,3 . עשור לאחר מכן, בשנת 2013, השיטה הותאמה בהצלחה להדמיית סידן בתאים חיים של תאי איון באמצעות CLSM כדי לאפיין את תגובותיהם לגלוקוז32, את דפוסי הקישוריות התפקודיים שלהם33, ואת הקשר בין פוטנציאל הממברנה לסידן תוך-תאי על ידי שילוב צבע סידן פלואורסצנטי עם צבע פוטנציאלי של קרום34. מאוחר יותר באותה שנה, השיטה שימשה גם להערכת דינמיקת הסידן בתאים אצינריים22,35. במהלך השנים הבאות, פרוסות רקמת הלבלב שימשו במספר מחקרים שונים והותאמו בהצלחה לרקמת חזירים ובני אדם 9,36,37,38,39,40,41. עם זאת, יחד, הדמיית סידן - בפרוסות רקמת הלבלב של העכבר בכלל ובאיים בפרט - עדיין מבוצעת בעיקר על ידי קבוצה זו. אחת הסיבות העיקריות לכך עשויה להיות טמונה בשילוב של הכנת פרוסת רקמה מאתגרת מבחינה טכנית, הצורך במיקרוסקופ קונפוקלי וניתוח נתונים מורכב למדי. המטרה העיקרית של המאמר הנוכחי היא להפוך את השיטה החזקה הזו לנגישה יותר למשתמשים פוטנציאליים אחרים.
ישנם כבר כמה מאמרים מתודולוגיים מצוינים העוסקים בפירוט בהכנת פרוסות טישו ושימוש בפרוסות למחקרים מבניים והפרשתיים, אך לא להדמיית סידן קונפוקלית 9,42,43. לכן, מאמר זה מתמקד בכמה טיפים וטריקים נוספים במהלך הכנת פרוסות, בשלבים קריטיים לטעינת צבע מוצלחת, רכישת תמונה, כמו גם על השלבים העיקריים של ניתוח נתוני סידן בסיסי. לפיכך, יש לראות בתרומה זו משלימה ולא כחלופה לשיטה הנ"ל ולא כחלופה לשיטה הנ"ל. באופן דומה, הדמיית סידן בפרוסות רקמת לבלב של עכברים תיתפס כגישה ניסיונית שיש להשתמש בה כדי לענות על שאלות ספציפיות ולכן היא משלימה ולא חלופה מוחלטת לגישות הדמיית סידן אחרות בפיזיולוגיה של הלבלב כגון צינורות מבודדים או אצ'יני, איונים מבודדים, אורגנואידים, איונים המושתלים בתא הקדמי של העין, והקלטות in vivo 11,44,45,46,47,48. ההבטחה להדמיית סידן בפרוסות רקמת הלבלב של עכברים מומחשת כנראה בצורה הטובה ביותר על ידי הקלטות מוצלחות אחרונות של דינמיקת סידן בתאים מזנכימליים באיים כגון פריסיטים49 ומקרופאגים50, כמו גם בתאי צינור23.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance KERN ALJ 120-4</td>
			<td>KERN &#38; SOHN GmbH</td>
			<td>ALJ 160-4A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope Leica TCS SP5 II Upright setup</td>
			<td>Leica</td>
			<td>5100001578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope Leica TCS SP5 AOBS Tandem II setup</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork pad 15 cm x 15 cm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>CLS430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Round Ice Bucket with Lid, 4 L</td>
			<td>Fischer Scientific, Leicestershire, UK</td>
			<td>432124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge razor blade</td>
			<td>Personna, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes 0.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 121.023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask 200 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>027.01.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - ToughCut</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat orbital shaker&#160; IKA KS 260 basic</td>
			<td>IKA</td>
			<td>Ident. No.: 0002980200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass lab bottle 1000 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>091.01.901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hartman Hemostat, curved</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>13003-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX APO L 20x/1.00 W HCX APO L (water immersion objective, 20x, NA 1.0)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15507701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring cylinder 25 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>015.01.025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator Control box SM-7, Keypad SM-7</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>&#160;200-100 900 7311, 200-100 900 9050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave owen</td>
			<td>Gorenje, Slovenia</td>
			<td>MO20MW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer Gonotec 010</td>
			<td>Gonotec, Berlin, Germany</td>
			<td>OSMOMAT 010 Nr. 01-02-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush</td>
			<td>Faber-Castell, No.2</td>
			<td></td>
			<td>Any thin soft round paint brush No.2, preferably black</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perifusion pumps</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>ISM 827</td>
			<td>Reglo Analog MS - 4/8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100/20 mm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35/10 mm</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>627102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35 x 10 mm Nunclon Delta</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA</td>
			<td>153066</td>
			<td>NON-STICKY for agarose blocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter inoLab pH Level 1</td>
			<td>WTW, Weilheim, Germany</td>
			<td>E163694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 1000 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3121 000.120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 50 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3121 000.066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Push pins 23 mm</td>
			<td>Deli, Ningbo, China</td>
			<td>E0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tube, 15 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semken Forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>11008-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stabilizing ring for Erlenmeyer flask</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>027.11.048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope Nikon SMZ 745</td>
			<td>Nikon, Melville, NY USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Injekt Solo 5 mL</td>
			<td>Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>4606051V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle 0.30 x 12 mm (30 G x 1/2&#34;)</td>
			<td>Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>4656300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>200-100 500 0150, 200-150-500-145</td>
			<td>Slice mini chamber, Temperature controller TC 07</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubings for perifusion system</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>SC0310</td>
			<td>Ismatec Pharmed 1.14 mm(ID) + silicone tubing 1.0 (ID) x 1.8 mm(OD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath Studio GT-7810A</td>
			<td>Globaltronics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrotome Leica VT 1000 S</td>
			<td>Leica, Nussloch, Germany</td>
			<td>14047235613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetric flask 1000 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>013.01.910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer Neolab 7-2020</td>
			<td>Neolab</td>
			<td>&#160;7-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath Thermo Haake open-bath circulator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Z527912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material/Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate - CaCl2.2H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4540-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-lactic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>L1250-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas mixture containing 95% O2 and 5% CO2 at barometric pressure</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue Wekem sekundenkleber WK-110</td>
			<td>Wekem GmbH, Bergkamen, Germany</td>
			<td>WK 110-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>H3375-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(+)-ascorbic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>A9,290-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate - MgCl2.2H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>M2670-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myo-inositol</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>I5125-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon Green 488 BAPTA-1, AM</td>
			<td>Invitrogen (Thermo FisherScientific)</td>
			<td>O6807</td>
			<td>cell-permeable Ca2+ indicator (excitation/emission: 495/523 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO)</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td>polaxamer: nonionic triblock copolymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride - KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>31248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaPlaque GTG agarose</td>
			<td>Lonza, Rockland, USA</td>
			<td>50111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate - NaHCO3</td>
			<td>Honeywell, Germany</td>
			<td>31437-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride - NaCl</td>
			<td>Honeywell, Germany</td>
			<td>31434-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide - NaOH</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>30620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic- NaH2PO4</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>S0751-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>15990-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>FIJI is an open source project</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LASAF</td>
			<td>Leica microsystems, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python</td>
			<td>Python Software Foundation</td>
			<td></td>
			<td>Python is an open source project</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal laser scanning microscopy of calcium dynamics in acute mouse pancreatic tissue slices

פרוסת רקמת הלבלב החריפה של העכבר היא תכשיר ייחודי באתרו עם תקשורת בין-תאית משומרת וארכיטקטורת רקמות הכוללת הרבה פחות שינויים המושרים על ידי הכנה מאשר איים מבודדים, אצ'יני, תעלות או תאים מפוזרים המתוארים במחקרים טיפוסיים במבחנה. על ידי שילוב פרוסת רקמת הלבלב החריפה עם הדמיית סידן בתאים חיים במיקרוסקופיה לסריקת לייזר קונפוקלית (CLSM), ניתן לחקור אותות סידן במספר רב של תאים אנדוקריניים ואקסוקריניים בו זמנית, עם רזולוציה חד-תאית או אפילו תת-תאית. הרגישות מאפשרת זיהוי של שינויים ומאפשרת לחקור גלים בין-תאיים וקישוריות תפקודית, כמו גם לחקור את התלות של תגובות פיזיולוגיות של תאים על לוקליזציה שלהם בתוך האיים והיחסים הפאראקריניים עם תאים אחרים. לבסוף, מנקודת המבט של רווחת בעלי החיים, רישום אותות ממספר רב של תאים בכל פעם מקטין את מספר בעלי החיים הנדרשים בניסויים, ותורם לעקרון ההחלפה, ההפחתה והעידון של 3R.

הזרקת תמיסת האגרוס לתוך צינור הלבלב היא השלב הקריטי ביותר בהכנת פרוסת רקמות הלבלב. ניתן לזהות הזרקה מוצלחת על ידי הלבנה של רקמת הלבלב, כפי שניתן לראות בצד שמאל של איור 3A, בעוד שחלק מוזרק חלקית של הלבלב מוצג בצד ימין של איור 3A. ניתן לזהות את האיים של לנגרהאן בעין בלתי או תחת סטריאומיקרוסקופ, וזה מסייע בחיתוך החלקים המתאימים של הלבלב להטבעה לאחר מכן בבלוקים אגרוזים (איור 3B). בפרוסת רקמת לבלב של עכבר שזה עתה נחתכה, ניתן להבחין בקלות בין איים של לנגרהנים לבין הרקמה האקסוקרינית שמסביב ומזנכים ככתמים לבנים מתחת לסטריאומיקרוסקופ (איור 3C) או כמבנים חומים מתחת למיקרוסקופ האור (איור 3D). פרוסות רקמת הלבלב יכולות לשמש לסוגים שונים של ניסויים במשך 12 שעות לפחות לאחר החיתוך. בנוסף להערכה המורפולוגית הגסה תחת הסטריאומיקרוסקופ, מיקרוסקופ האור והתגובות התפקודיות של תאים במהלך הדמיית סידן, ניתן להעריך את הכדאיות של פרוסות רקמת הלבלב (איור 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig04.jpg"> איור 4: כדאיות התאים בתוך פרוסת הרקמה. הכדאיות של התאים נקבעה באמצעות בדיקת Live/Dead. תאים חיים מוכתמים על ידי Calcein AM (מוצג בירוק), בעוד שתאים מתים מוכתמים באתידיום הומודימר-1 (מוצג באדום). קווים צהובים מציינים את המיקום של חתך X-Y של מחסנית Z המוצגת בתחתית ובימין. העומק המלא של מחסנית Z הוא 88 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
עבור ניסויי הדמיית סידן, מחוון הסידן הפלואורסצנטי צריך לחדור דרך כמה שכבות של תאים. איור 5A מציג טעינה מוצלחת של צבע האינדיקטור Ca2+ החדיר לתאים לתוך פרוסת רקמת הלבלב שבה ניתן לזהות תאי איון ואצינר בודדים. לעומת זאת, פרוסות באיור 5B-D אינן אופטימליות בשל חדירה לא מוצלחת של הצבע (איור 5B), היעדר תאי איון (איור 5C) והרבה רקמה נמקית על פני השטח (איור 5D). ניתן להשליך פרוסות כאלה, לבדוק את נוכחותם של איונים נוספים שנחתכים או מוכתמים טוב יותר (ראה טבלה 1 לפתרון בעיות), או להשתמש בהם לתיעוד התגובות של תאים אקסוקריניים.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig05.jpg"> איור 5: דוגמאות לתכשירים שמישים ובלתי שמישים. (A) דוגמה להכנה מוצלחת של פרוסת רקמת הלבלב עם תאים מוכתמים היטב באיים של לנגרהנס, כמו גם תאי צינור ורקמה אסינארית מסביב. (B) דוגמה לפרוסת טישו מוכתמת בצורה גרועה. (C) דוגמה של איון של לנגרהנים עם הפסקות מבניות. (D) דוגמה לאי של לנגרהנים המכיל תאים מתים רבים והרבה פסולת. טבלת בדיקת המידע "זוהר-מעל, זוהר-תחת" בצד ימין מציגה עוצמה 0 בירוק ורוויה בכחול. סרגל קנה מידה = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
תוצאות מייצגות מהדמיית סידן באמצעות צבע האינדיקטור Ca2+ החדיר לתאים מוצגות באיור 6. באיור 6A מוצגת תמונה ברזולוציה גבוהה של פרוסת רקמת לבלב, המכילה איון של לנגרהנים, רקמה סינרית וצינור לבלב. להבחנה טובה יותר, החלק האנדוקריני, האקסוקריני והצינורי של פרוסת רקמת הלבלב המוצג באיור 6A צבועים באיור 6B. שימוש בגירויים מתאימים יכול להבחין באופן פונקציונלי בין תאי איון שונים, או תאי איון ולא תאי איון51. תאי בטא יגיבו בדרך כלל לגירוי של דופק ריבועי על ידי גלוקוז עם עלייה חולפת ב-[Ca2+] IC ואחריה תנודות סידן מהירות על מישור מתמשך (איור 6C, פאנל עליון).
מכיוון שכל תאי הבטא מצומדים לסינסיטיום יחיד, גדול ומתפקד, תנודות אלה גם מסונכרנות היטב בין תאים שונים באמצעות התפשטות גלי IC [Ca2+] 32,34,52,53,54 (איור 7C). תנודות IC איטיות יותר [Ca2+] עם פרק זמן של 5-15 דקות עשויות לעמוד בבסיס התנודות המהירות או אפילו להיות הסוג השולט של תגובה55,56. אותו פרוטוקול פשוט עשוי לחשוף סוגים אחרים של תגובות, במיוחד בשולי האיים (איור 6C, פאנל תחתון). מכיוון שתאים אלה אינם מסונכרנים עם תאי בטא ומגיבים עם תנודות מהירות ולא סדירות יותר שכבר קיימות בתנאי גלוקוז נמוכים או עם ירידה בפעילות, תגובות כאלה מרמזות מאוד על תאים שאינם בטא 21,32,57,58. עם זאת, האפיון התפקודי הסופי שלהם דורש פרוטוקולים מורכבים יותר עם שלבי גירוי נוספים או גישות חלופיות, שיידונו להלן. תגובות אופייניות של תאים אצינריים ותאים דוקטליים מוצגות באיור 6D ובאיור 6E, בהתאמה. עיין בספרות לקבלת פרטים נוספים על תאים אצינריים ותאים צינוריים 22,23,35.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig06.jpg"> איור 6: תוצאות מייצגות של דינמיקת סידן בסוגים שונים של תאי לבלב. סרגל קנה מידה = 100 μm. (B) תיחום של חלקים שונים של רקמת הלבלב עם רקמה אסינארית המוצגת בצהוב, איון של לנגרהנים המוצג באדום, וקטע של עץ הצינור בכחול. סרגל קנה מידה = 100 μm. (C) עקבות אופייניים של דינמיקת סידן בתאי בטא ותאי פוטטיביים שאינם בטא במהלך גירוי עם גלוקוז של 12 mM; 3 mM גלוקוז שימש למצבים שאינם מעוררים. פרוטוקולים שניתן להשתמש בהם לאפליה ספציפית יותר של תאים שאינם בטא מתוארים בסעיף הדיון. (D) עקבות אופייניים של דינמיקת סידן של תאים אצינריים מגורה על ידי אצטילכולין של 25 ננומטר. (E) עקבות אופייניים של דינמיקת סידן של תאים צינוריים המעוררים על ידי חומצה כנודאוקסיכולית של 1 mM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
לאחר הדמיית סידן מוצלחת, הנתונים מיוצאים ומתוקנים תחילה להלבנה על ידי שילוב של התאמה מעריכית וליניארית, כמתואר בסעיף הפרוטוקול. סדרת זמן לפני ואחרי תיקון הלבנה מוצגת באיור 7A. לאחר מכן, ניתן לנתח מספר פרמטרים בשלב ההפעלה וההשבתה של התגובה, כמו גם את שלב המישור. ניתן למדוד עיכוב בהתפרצות של [Ca2+]IC עלייה לאחר גירוי כפי שהוא מיוצג על ידי עיכובA באיור 7B וההטרוגניות בעיכובים בין תאים בודדים (עיכובA1). ניתן להשתמש באותם פרמטרים (השהיהD ו- delayD1) כדי לתאר את שלב ההשבתה. בעקבות העלייה הארעית הראשונית [Ca2+] IC , שלב הרמה ברוב תאי הבטא של הלבלב באי מתאפיין בתדר גבוה יחסית [Ca2+]IC תנודות IC בתדירות גבוהה. ניתן לתאר את שלב המישור על ידי ניתוח הפרמטרים הפונקציונליים הקלאסיים. ההצגה הסכמטית של משך הזמן, התדירות ואחוז הזמן הפעיל של [Ca2+]IC מוצגת באיור 7C. בהדמיית סידן עם קצבי רכישה גבוהים מ-10 הרץ, ניתן לזהות בבירור גם גלי סידן המתפשטים שוב ושוב על פני האי (איור 7C).
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig07.jpg"> איור 7: ניתוח של נתוני סדרות זמן. (B) ניתוח עיכובים בהפעלה לאחר גירוי ולהשבתה לאחר הפסקת גירוי עם גלוקוז של 12 מ"מ. משך הגירוי מסומן על ידי הפס האפור הבהיר, המוצלל בתמונה. (C) ניתוח של מספר פרמטרים של שלב המישור: I) משך התנודה שנקבע בחצי גובה, II) תדירות התנודות הנקבעות על ידי מרווחי בין תנודות. III) זמן פעיל כתוצר של תדירות ומשך של תנודות. I-IV) עיכובים בין תנודות בכל גל נתון של תנודות המתפשטות על פני האי לנגרהנס שנקבעו על ידי העיכובים (Δt) בזמן שבו תא יחיד מגיע לחצי גובה של התנודה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig07large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
טבלה 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/Table%201%20(3).xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices at JoVE.com

Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices

אנו מציגים את ההכנה של פרוסות רקמת לבלב חריפה ואת השימוש בהן במיקרוסקופיה לסריקת לייזר קונפוקלית לחקר דינמיקת סידן בו זמנית במספר רב של תאים חיים, לאורך תקופות זמן ארוכות, ועם רזולוציה מרחבית-טמפורלית גבוהה.

מיקרוסקופיה לסריקת לייזר קונפוקלית של דינמיקת סידן בפרוסות רקמת לבלב חריפה של עכבר

The acute mouse pancreatic tissue slice is a unique in situ preparation with preserved intercellular communication and tissue architecture that entails ...

בשילוב עם הדמיית סידן של תאים חיים, טכניקת פרוסת רקמת הלבלב החריפה מאפשרת לחקור גלים בין-תאיים וקישוריות תפקודית רב-תאית ברזולוציה גבוהה לאורך תקופות זמן ארוכות. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא מהירה, משמרת את ארכיטקטורת הרקמות ומפחיתה מתח אנזימטי ומכני מוגבל תוך שמירה על תפוקה גבוהה של רקמה. על ידי זיהוי שינויים תפקודיים ומורפולוגיים במהלך התקדמות המחלה, טכניקה זו מסייעת להבנתנו את המחלות הקשורות ללבלב, כגון סוכרת.ניתן ליישם טכניקה זו של פרוסת רקמות על רקמות המוח, יותרת המוח ואדרנל, תוך שימת דגש על שימור מגע בין-תאי, אינטראקציות של פרקרין וארכיטקטורת רקמות. כדי להתכונן להזרקת אגרוז ללבלב העכבר, מלאו מזרק של חמישה מיליליטר באגרוז נוזלי של 40 מעלות צלזיוס וציידו את המזרק במחט של 30 מעלות צלזיוס. לאחר כיסוי קפדני של המחט בכובע, מניחים את קצה מחט המזרק כלפי מטה, עם כל נפח האגרוז מתחת לפני המים, באמבט מים של 40 מעלות צלזיוס.מבעבעים בקבוק של תמיסה חוץ-תאית עם קרבוגן, ברציפות על קרח, במהירות של 1.5 מיליליטר לדקה בלחץ ברומטרי ובטמפרטורת החדר כדי להבטיח חמצון ו-pH של 7.4. כדי לבצע את הזרקת האגרוס מניחים עכבר בוגר מורדם תחת מיקרוסקופ סטריאופוני וניגשים לבטן העכבר באמצעות לפרוטומיה. הזיזו בעדינות את המעיים לצד שמאל כדי לחשוף את צינור המרה הנפוץ והשתמשו במלקחיים כדי להרים מעט את קצה התריסריון של הצינור כדי לאתר את הפפילה של ואטר.השתמש hemostat כדי להדק את צינור המרה בפפילה התריסריון כדי למנוע דליפה של האגרוז מן הצינור לתוך התריסריון ולהשתמש מלקחיים חדים קטנים כדי להגיע מתחת לצינור המרה המשותף כדי לשבור את הקרום המחבר את הצינור לרקמת הלבלב. לאחר ניקוי כמות השומן ורקמת החיבור מהצינור ככל האפשר, מניחים את הצינור בניצב על קצות זוג מלקחיים גדולים יותר, ולוחצים בחוזקה על בוכנת המזרק, הזריקו את האגרוז הנוזלי הצמיג לקצה הפרוקסימלי של צינור המרה הנפוץ למשך 20 עד 30 שניות. כאשר הרקמה הופכת לבנבנה ומנוכרת מעט מסירים את המזרק ושופכים באיטיות 20 מיליליטרים של התמיסה החוץ-תאית הקרה כקרח על הלבלב כדי לקרר את הרקמה ולהקשיח את האגרוז.כדי לרכוש פרוסות רקמת לבלב יש להשתמש במלקחיים ובמספריים חתוכים דקים וקשים כדי להעביר בעדינות את הלבלב המוזרק לאגרוזה לתוך צלחת פטרי של 100 מילימטר המכילה 40 מיליליטר של תמיסה חוץ-תאית קרה כקרח. סובבו את התבשיל כדי לשטוף את הרקמה ולהעביר את הלבלב למנה שנייה של תמיסה חוץ-תאית קרה כקרח. השתמשו במלקחיים ובמספריים כדי לחתוך את חתך הלבלב הלבן והמוזרק היטב לעד שש חתיכות של 0.1 עד 0.2 סנטימטר מעוקב ולהסיר את כל רקמות החיבור והשומנים שנותרו מחתיכות הרקמה.מכניסים את הבלוקים המנוקים לתוך צלחת פטרי תחתונה לא דביקה בקוטר 35 מילימטרים המכילה כחמישה מיליליטרים של אגרוז נוזלי 40 מעלות צלזיוס ומניחים מיד את צלחת הפטרי על הקרח. כאשר האגרוז מתקשה, החזיקו את צלחת הפטרי הפוכה מעל המכסה של צלחת פטרי באורך 100 מילימטר והשתמשו בחצי אחד של סכין גילוח כדי לחתוך בזהירות את השוליים שבין הקיר הצדדי של צלחת הפטרי לבין האגרוז כדי להסיר את האגרוז מהמנה. השתמשו בסכין הגילוח כדי לחתוך קוביות בודדות, שכל אחת מהן מכילה גוש רקמה אחד של אגרוז, מהאגרוז המשוחרר והשתמשו בדבק ציאנואקרילט כדי לחבר את הבלוקים לצלחת הדגימה של ויברטום.מלאו את תא החיתוך של הוויברטום ב-150 מיליליטרים של תמיסה חוץ-תאית קרה כקרח המבעבעת ברציפות בקרבוגן. בורג לתקן את לוחית הדגימה על vibratome ולהרכיב סכין גילוח חדש. הקיפו את התא בקרח והוסיפו שתי קוביות קרח בנפח 10 מיליליטר העשויות מתמיסה חוץ-תאית בתוספת גלוקוז של שישה מילימולרים.הגדר את החתך ל-0.05 עד 1 מילימטר לשנייה ו-70 הרץ, ואז התחל לחתוך כדי לרכוש פרוסות אגרוז בעובי 140 מיקרון עם שטח פנים של 20 עד 100 מילימטר מרובע. השתמשו במברשת צבע עדינה כדי להעביר בזהירות כל פרוסה לתוך צלחת פטרי של 100 מילימטרים במילוי 40 מילימטרים של חיץ HEPES בתוספת גלוקוז של שישה מילימולרים. להכנת צבע סידן, ממיסים 50 מיקרוגרם של צבע מחוון סידן חדיר לתא, 7.5 מיקרוליטרים של DMSO, ו-2.5 מיקרוליטרים של הפולו-קסאמר, ו-6.667 מיליליטר של HBS בצינור מכסה בורג של 15 מיליליטר.השתמש בפיפטה כדי לערבב ביסודיות את התמיסה במשך 20 שניות לפני טבילת הצינור בתא אמבטיה על-קולי ומערבולת, כל אחד למשך 30 שניות. לאחר מכן aliquot 3.333 מיליליטרים של תמיסת צבע מחוון סידן וכתוצאה מכך לתוך אחד 5 מיליליטר פטרי צלחת לכל 10 פרוסות של רקמה להיות מסומן. להעמסת צבע, השתמשו במכחול דק ורך כדי להעביר עד 10 פרוסות טישו לכל מנה של תמיסת צבע והניחו את הכלים על שייקר מסלולי למשך 50 דקות בטמפרטורת החדר ו-40 סיבובים לדקה מוגנים מאור.בסוף הדגירה, מעבירים עד 20 פרוסות מוכתמות לתוך כלי פטרי 60 מיליליטר בודדים במילוי HBS ללא צבע. להדמיית סידן על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית בחרו הגדלה של פי 20 או 25 והגדירו את מצב הרכישה להדמיית קיטועי זמן, חור הסיכה ל-100 עד 200 מיקרון, והעירור והפליטה של הפלואורופור ששימשו בניסוי. הרכיבו את תא ההקלטה ואת מערכת הזלוף על הבמה מבוקרת הטמפרטורה של המיקרוסקופ והניחו את הכניסה והשקע בקצוות הרחוקים של תא ההקלטה.הגדר את קצבי הזרימה והיציאה ל-1 עד 2 מיליליטר לדקה. הגדר את הטמפרטורה של מערכת השפע ל -37 מעלות צלזיוס והתחל את השפע עם הפתרון שאינו ממריץ. כדי לתעד את דינמיקת הסידן של הרקמה מניחים פרוסת רקמה אחת לתוך תא ההקלטה ומשתקים את הרקמה עם משקל פלטינה בצורת U עם רשת ניילון מתוחה.השתמש באפשרות השדה הבהיר כדי לאתר את מבנה העניין ולהשתמש בהדמיה חיה כדי למקם את המבנים הנחקרים בשדה הראייה. כדי למטב את יחס האות לרעש, התאם את הספק הלייזר, הגברת הגלאי והחיבור הממוצע של הקו תוך שמירה על הספק הלייזר מינימלי. התאם את מישור המוקד ל-15 מיקרון מתחת למשטח החיתוך כדי להימנע מהקלטה של תאים שעלולים להיפגע ולרכוש את התמונות.הגדרת תדירות הדגימה לאחד עד שני הרץ כדי לאפשר זיהוי ראשוני של תנודות בודדות ורישום תמונה ברזולוציה גבוהה. אם זמין, השתמש בתרשים מקוון כדי לקבל משוב מיידי על תגובת ההכנה, תאורת יתר, הלבנת תמונות וסחף מכני. לאחר שכל התמונות נרכשו, שמור את הנתונים לניתוח מאוחר יותר.כאן ניתן לראות דוגמה לפרוסת רקמה אופטימלית שבה צבע מחוון הסידן החדיר של התא הועמס בהצלחה לפרוסת רקמת הלבלב. לעומת זאת, פרוסות רקמה אלה אינן אופטימליות להדמיה בשל חדירת צבע לא מוצלחת, מחסור בתאי איון או שפע של רקמה נמקית על פני השטח של הדגימות. תמונות ברזולוציה גבוהה של פרוסת רקמת לבלב יכולות לשמש לתיחום אזורים שונים של רקמת הלבלב, כגון האיים של לנגרהנס, רקמת אסינאר או צינור הלבלב.ניתן להשתמש בגירויים כדי להבחין באופן פונקציונלי בין תאי איון שונים או בין תאי איון לתאים שאינם איון. לדוגמה, תאי בטא מגיבים בדרך כלל לגירוי גלוקוז בפולס מרובע על ידי הצגת עלייה חולפת בסידן תוך תאי ואחריה תנודות סידן מהירות על מישור מתמשך. לעומת זאת, תאים שאינם בטא מגיבים בתנודות מהירות ולא סדירות יותר.ניתן למדוד גם עיכוב בהתפרצות הסידן התוך-תאי לאחר הגירוי, כמו גם את ההטרוגניות והעיכובים בקרב תאים בודדים. ניתן להשתמש באותם פרמטרים כדי לתאר את שלב ההשבתה. כאן ניתן לראות הצגה סכמטית של משך תנודת הסידן התוך-תאית, התדירות ואחוז הזמן הפעיל.כאשר הדמיה בקצבי רכישה העולים על 10 הרץ, ניתן לזהות בבירור גלי סידן המתפשטים שוב ושוב על פני האיון. מהדק את צינור המרה הנפוץ קרוב ככל האפשר לתריסריון כדי למנוע חסימה בטעות של הענף הנכנס ללבלב. כמו כן, אל תפסיק לדכא את הבוכנה במהלך ההזרקה כי האגרוז יתקשה מיד במחט.ניתן להשתמש בטכניקת פרוסת רקמות הלבלב של עכבר חריף גם בשיטת הידוק המדבקה כדי לחקור זרמי תעלות יונים ולגשת לציטוזיס, כמו גם מחקרים אימונוהיסטוכימיה ומחקרי מזכירה.

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

הקרינה מבוסס מדידה הכניסה חנות המופעל הסידן בתאים חיים: מתא הסרטן תרבותי כדי סיב שריר שלד

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

במשובט מעקב vivo של גזע hematopoietic ובתאים המסומנים על ידי חמישה חלבונים ניאון באמצעות Confocal וmultiphoton מיקרוסקופית

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

מיקרוסקופ אלקטרוני סורק של רקמות macerated לדמיין את תאי מטריקס

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

בזמן אמת In Vivo המעקב של Thymocytes בתא הקדמי של העין על ידי סריקת מיקרוסקופ לייזר

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

הדמיה של סידן דינמיקה באוכלוסיות משנה של תאים הלבלב איון של העכבר

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

בחינת Mitotic ומיוטיק ביקוע הדינמיקה הגרעינית על ידי הזריחה לחיות-מיקרוסקופ התא

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

סריקת בלוק-פנים טורית מיקרוסקופ אלקטרונים (SBF-SEM) של דגימות רקמה ביולוגית

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...

Imaging of Mitochondrial Peroxide in Living Yeast Cells Using mtHyper7

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Advancing Mitochondrial Research Â– mtHyper7 Biosensor for Subcellular Analysis (Video) | JoVE

הדמיה של mtHyPer7, ביוסנסור רציומטרי למי חמצן מיטוכונדריאליים, בתאי שמרים חיים

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...

Intravital Imaging Using an Inverted Microscope to Track Skin Cell Dynamics

Streamlined Intravital Imaging Approach for Long-Term Monitoring of Epithelial Tissue Dynamics on an Inverted Confocal Microscope

Developing a Tool for Using Inverted Confocal Microscopes for In Vivo Intravital Imaging (Video) | JoVE

גישת הדמיה תוך-חיונית יעילה לניטור ארוך טווח של דינמיקה של רקמת אפיתל במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך

Understanding normal and aberrant in vivo cell behaviors is necessary to develop clinical interventions to thwart disease initiation and progression. It ...

Biological Samples Preparation for Confocal Microscopy, Image Acquisition Setup, and Confocal Microscopy Imaging

Biological Samples Preparation for Confocal Microscopy, Image Acquisition Setup, and Confocal Microscopy Imaging (Video) | JoVE 

הכנת דגימות ביולוגיות למיקרוסקופ קונפוקלי, מערך רכישת תמונה והדמיית מיקרוסקופ קונפוקלי