Name: confocal laser scanning microscopy of calcium dynamics in acute mouse pancreatic tissue slices
Uploaded: 2021-04-13T13:30:00
Duration: 10 min 49 s
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Il lavoro presentato in questo studio è stato sostenuto finanziariamente dall'Agenzia slovena per la ricerca (finanziamenti di base per la ricerca. P3-0396 e I0-0029, nonché progetti di ricerca n. J3-9289, N3-0048 e N3-0133) e dal Fondo austriaco per la scienza / Fonds zur Förderung der Wissenschaftlichen Forschung (sovvenzioni bilaterali I3562--B27 e I4319--B30). Ringraziamo Maruša Rošer, Maša Čater e Rudi Mlakar per l'eccellente assistenza tecnica.

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di qualsiasi interesse commerciale o finanziario.

Il pancreas dei mammiferi è una grande ghiandola esocrina ed endocrina. La parte esocrina costituisce il 96-99% del volume totale del pancreas ed è costituita da acini e dotti. La parte endocrina è costituita da un gran numero di isole di Langerhans che rappresentano il restante 1-4% del volume totale del pancreas1. La parte esocrina secerne importanti enzimi digestivi che abbattono i polimeri ricchi di energia negli alimenti, così come un fluido ricco di bicarbonato, che si combina con altre secrezioni gastrointestinali per fornire un ambiente adatto all'azione degli enzimi. La parte endocrina secerne ormoni che regolano la distribuzione postprandiale, lo stoccaggio e il rilascio interprandiale di nutrienti ricchi di energia. Sebbene il tessuto esocrino sia relativamente sottosviluppato e l'endocrino relativamente ben sviluppato alla nascita, il primo cresce rapidamente il secondo allo svezzamento 2,3,4. I primi studi sulla funzione pancreatica hanno segnato la nascita della fisiologia moderna e importanti progressi metodologici nel campo sono stati seguiti da importanti interruzioni scientifiche5. Lavorare con il pancreas è tecnicamente impegnativo a causa dell'intricata struttura della ghiandola, ma è anche una grande motivazione a causa di malattie come il cancro al pancreas, la pancreatite e il diabete che presentano gravi minacce per la salute pubblica e per le quali sono necessari nuovi approcci terapeutici.
Le isole isolate6, acini 7,8 e frammenti duttali erano state sviluppate e utilizzate per decenni come metodi gold standard a causa dei loro vantaggi rispetto alle linee cellulari e alle cellule endocrine, acinore e duttali disperse primarie 9,10. Nonostante la funzione marcatamente migliorata dei collettivi cellulari isolati, questi metodi comportano ancora un notevole stress meccanico ed enzimatico, isolano le cellule dal tessuto circostante e quindi mancano di interazioni paracrine e supporto meccanico e, soprattutto, sono accompagnati da cambiamenti significativi nella fisiologia normale 11,12,13 . La fetta di tessuto pancreatico acuto del topo è stata sviluppata nel 2001 per una necessità percepita di sviluppare una piattaforma sperimentale simile a fette cerebrali, ipofisarie e surrenali con contatti intercellulari conservati, interazioni paracrine, mesenchima e architettura tissutale, nonché senza alcune delle più importanti carenze del metodo gold standard nella ricerca sulle isole di quel tempo - le isole isolate12, 14. Tra queste carenze ci sono i danni agli strati più esterni, la mancanza di accessibilità delle aree degli isolotti centrali e la necessità di coltivazione con effetti potenzialmente importanti sull'identità e la fisiologia cellulare12,15. Inoltre, il metodo della fetta di tessuto consente studi su modelli animali con architettura isolotta grossolanamente squilibrata in cui è impossibile isolare le isole, o quando la resa delle isole è estremamente bassa con l'isolamento tradizionale 16,17,18,19,20,21.
Inoltre, la fetta è più adatta per studiare i cambiamenti morfologici durante lo sviluppo del diabete e della pancreatite, ad esempio, in quanto consente una migliore panoramica dell'intero tessuto ed è anche compatibile con lo studio delle differenze regionali. È importante sottolineare che, nonostante l'attenzione iniziale sulla parte endocrina, il metodo della fetta di tessuto consente intrinsecamente lo studio dei componenti esocrini 9,22,23. Durante il primo decennio dopo la sua introduzione, il metodo è stato impiegato per studi elettrofisiologici di cellule beta 14,24,25,26,27,28,29 e alfa 30,31, nonché per esaminare la maturazione morfologica e funzionale del pancreas 2,3 . Un decennio dopo, nel 2013, il metodo è stato adattato con successo per l'imaging del calcio a cellule vive di cellule insulari utilizzando CLSM per caratterizzare le loro risposte al glucosio32, i loro modelli di connettività funzionale33 e la relazione tra potenziale di membrana e calcio intracellulare combinando un colorante di calcio fluorescente con un colorante a potenziale di membrana34. Più tardi nello stesso anno, il metodo è stato utilizzato anche per valutare la dinamica del calcio nelle cellule acinari22,35. Negli anni successivi, le fette di tessuto pancreatico sono state utilizzate in una serie di studi diversi e adattate con successo al tessuto suino e umano 9,36,37,38,39,40,41. Tuttavia, nel loro insieme, l'imaging del calcio nelle fette di tessuto pancreatico del topo in generale e nelle isole in particolare, è ancora per lo più eseguito da questo gruppo. Una delle ragioni principali di ciò potrebbe risiedere nella combinazione di una preparazione di fette di tessuto tecnicamente impegnativa, la necessità di un microscopio confocale e un'analisi dei dati piuttosto complessa. L'obiettivo principale del presente documento è quello di rendere questo potente metodo più accessibile ad altri potenziali utenti.
Esistono già alcuni eccellenti articoli metodologici che trattano in dettaglio la preparazione delle fette di tessuto e l'uso delle fette per studi strutturali e di secrezione, ma non per l'imaging confocale del calcio 9,42,43. Pertanto, questo documento si concentra su alcuni suggerimenti e trucchi aggiuntivi durante la preparazione delle fette, sui passaggi critici per il corretto caricamento del colorante, l'acquisizione delle immagini e sulle fasi principali dell'analisi dei dati di calcio di base. Pertanto, tale contributo dovrebbe essere considerato come complementare piuttosto che alternativo al metodo summenzionato. Analogamente, l'imaging del calcio nelle fette di tessuto pancreatico di topo deve essere considerato come un approccio sperimentale da utilizzare per rispondere a domande specifiche ed è quindi complementare piuttosto che un'alternativa assoluta per altri approcci di imaging del calcio nella fisiologia pancreatica come dotti isolati o acini, isole isolate, organoidi, isole trapiantate nella camera anteriore dell'occhio, e registrazioni in vivo 11,44,45,46,47,48. La promessa dell'imaging del calcio nelle fette di tessuto pancreatico del topo è probabilmente meglio illustrata dalle recenti registrazioni di successo della dinamica del calcio nelle cellule mesenchimali insulari come i periciti49 e i macrofagi50, così come nelle cellule duttali23.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance KERN ALJ 120-4</td>
			<td>KERN &#38; SOHN GmbH</td>
			<td>ALJ 160-4A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope Leica TCS SP5 II Upright setup</td>
			<td>Leica</td>
			<td>5100001578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope Leica TCS SP5 AOBS Tandem II setup</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork pad 15 cm x 15 cm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>CLS430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Round Ice Bucket with Lid, 4 L</td>
			<td>Fischer Scientific, Leicestershire, UK</td>
			<td>432124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge razor blade</td>
			<td>Personna, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes 0.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 121.023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask 200 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>027.01.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - ToughCut</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat orbital shaker&#160; IKA KS 260 basic</td>
			<td>IKA</td>
			<td>Ident. No.: 0002980200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass lab bottle 1000 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>091.01.901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hartman Hemostat, curved</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>13003-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX APO L 20x/1.00 W HCX APO L (water immersion objective, 20x, NA 1.0)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15507701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring cylinder 25 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>015.01.025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator Control box SM-7, Keypad SM-7</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>&#160;200-100 900 7311, 200-100 900 9050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave owen</td>
			<td>Gorenje, Slovenia</td>
			<td>MO20MW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer Gonotec 010</td>
			<td>Gonotec, Berlin, Germany</td>
			<td>OSMOMAT 010 Nr. 01-02-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush</td>
			<td>Faber-Castell, No.2</td>
			<td></td>
			<td>Any thin soft round paint brush No.2, preferably black</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perifusion pumps</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>ISM 827</td>
			<td>Reglo Analog MS - 4/8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100/20 mm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35/10 mm</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>627102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35 x 10 mm Nunclon Delta</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA</td>
			<td>153066</td>
			<td>NON-STICKY for agarose blocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter inoLab pH Level 1</td>
			<td>WTW, Weilheim, Germany</td>
			<td>E163694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 1000 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3121 000.120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 50 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3121 000.066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Push pins 23 mm</td>
			<td>Deli, Ningbo, China</td>
			<td>E0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tube, 15 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semken Forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>11008-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stabilizing ring for Erlenmeyer flask</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>027.11.048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope Nikon SMZ 745</td>
			<td>Nikon, Melville, NY USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Injekt Solo 5 mL</td>
			<td>Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>4606051V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle 0.30 x 12 mm (30 G x 1/2&#34;)</td>
			<td>Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>4656300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>200-100 500 0150, 200-150-500-145</td>
			<td>Slice mini chamber, Temperature controller TC 07</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubings for perifusion system</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>SC0310</td>
			<td>Ismatec Pharmed 1.14 mm(ID) + silicone tubing 1.0 (ID) x 1.8 mm(OD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath Studio GT-7810A</td>
			<td>Globaltronics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrotome Leica VT 1000 S</td>
			<td>Leica, Nussloch, Germany</td>
			<td>14047235613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetric flask 1000 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>013.01.910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer Neolab 7-2020</td>
			<td>Neolab</td>
			<td>&#160;7-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath Thermo Haake open-bath circulator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Z527912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material/Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate - CaCl2.2H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4540-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-lactic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>L1250-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas mixture containing 95% O2 and 5% CO2 at barometric pressure</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue Wekem sekundenkleber WK-110</td>
			<td>Wekem GmbH, Bergkamen, Germany</td>
			<td>WK 110-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>H3375-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(+)-ascorbic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>A9,290-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate - MgCl2.2H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>M2670-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myo-inositol</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>I5125-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon Green 488 BAPTA-1, AM</td>
			<td>Invitrogen (Thermo FisherScientific)</td>
			<td>O6807</td>
			<td>cell-permeable Ca2+ indicator (excitation/emission: 495/523 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO)</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td>polaxamer: nonionic triblock copolymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride - KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>31248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaPlaque GTG agarose</td>
			<td>Lonza, Rockland, USA</td>
			<td>50111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate - NaHCO3</td>
			<td>Honeywell, Germany</td>
			<td>31437-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride - NaCl</td>
			<td>Honeywell, Germany</td>
			<td>31434-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide - NaOH</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>30620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic- NaH2PO4</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>S0751-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>15990-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>FIJI is an open source project</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LASAF</td>
			<td>Leica microsystems, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python</td>
			<td>Python Software Foundation</td>
			<td></td>
			<td>Python is an open source project</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal laser scanning microscopy of calcium dynamics in acute mouse pancreatic tissue slices

La fetta di tessuto pancreatico acuto del topo è una preparazione unica in situ con comunicazione intercellulare preservata e architettura tissutale che comporta un numero significativamente inferiore di cambiamenti indotti dalla preparazione rispetto alle isole isolate, agli acini, ai dotti o alle cellule disperse descritte in tipici studi in vitro. Combinando la fetta di tessuto pancreatico acuto con l'imaging del calcio a cellule vive nella microscopia a scansione laser confocale (CLSM), i segnali di calcio possono essere studiati in un gran numero di cellule endocrine ed esocrine contemporaneamente, con una risoluzione a singola cellula o addirittura subcellulare. La sensibilità consente l'individuazione dei cambiamenti e consente lo studio delle onde intercellulari e della connettività funzionale, nonché lo studio della dipendenza delle risposte fisiologiche delle cellule dalla loro localizzazione all'interno dell'isolotto e la relazione paracrina con altre cellule. Infine, dal punto di vista del benessere degli animali, la registrazione dei segnali provenienti da un gran numero di cellule alla volta riduce il numero di animali richiesti negli esperimenti, contribuendo al principio di sostituzione, riduzione e raffinamento delle 3R.

L'iniezione della soluzione di agarosio nel dotto pancreatico è la fase più critica nella preparazione della fetta di tessuto pancreatico. Un'iniezione riuscita può essere riconosciuta da uno sbiancamento del tessuto pancreatico, come si vede sul lato sinistro della Figura 3A, mentre una parte del pancreas iniettata in modo incompleto è presentata sul lato destro della Figura 3A. Le isole di Langerhans possono essere riconosciute ad occhio nudo o sotto uno stereomicroscopio, e questo aiuta a tagliare le parti appropriate del pancreas per il successivo incorporamento in blocchi di agarosio (Figura 3B). In una fetta di tessuto pancreatico di topo appena tagliata, le isole di Langerhans possono essere facilmente distinte dal tessuto esocrino circostante e dal mesenchima come macchie bianche sotto lo stereomicroscopio (Figura 3C) o come strutture brunastre al microscopio ottico (Figura 3D). Le fette di tessuto pancreatico possono essere utilizzate per diversi tipi di esperimenti per almeno 12 ore dopo l'affettamento. Oltre alla valutazione morfologica grossolana sotto lo stereomicroscopio, il microscopio ottico e le risposte funzionali delle cellule durante l'imaging del calcio, è possibile valutare la vitalità delle fette di tessuto pancreatico (Figura 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig04.jpg"> Figura 4: Vitalità delle cellule all'interno della fetta di tessuto. La vitalità delle cellule è stata determinata con il test Live/Dead. Le cellule vive sono colorate da Calcein AM (mostrato in verde), mentre le cellule morte sono colorate con ethidium homodimer-1 (mostrato in rosso). Le linee gialle indicano la posizione della sezione trasversale X-Y dello stack Z visualizzata in basso e a destra. La profondità completa dello Z-stack è di 88 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Per gli esperimenti di imaging del calcio, l'indicatore fluorescente del calcio deve penetrare attraverso alcuni strati di cellule. La Figura 5A presenta il successo del carico del colorante indicatore Ca2+ permeabile alle cellule nella fetta di tessuto pancreatico in cui possono essere riconosciute le singole isole e le cellule acinari. Al contrario, le fette nella Figura 5B-D non sono ottimali a causa della penetrazione infruttuosa del colorante (Figura 5B), della mancanza di cellule insulari (Figura 5C) e di molto tessuto necrotico sulla superficie (Figura 5D). Tali fette possono essere scartate, controllate per la presenza di isole aggiuntive che vengono tagliate o macchiate meglio (vedere la Tabella 1 per la risoluzione dei problemi) o utilizzate per registrare le risposte delle cellule esocrine.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig05.jpg"> Figura 5: Esempi di preparati utilizzabili e inutilizzabili. (A) Un esempio di preparazione riuscita della fetta di tessuto pancreatico con cellule ben macchiate nelle isole di Langerhans, nonché cellule duttali e tessuto acinare circostante. (B) Un esempio di fetta di tessuto scarsamente macchiata. (C) Esempio di isolotto di Langerhans con discontinuità strutturali. (D) Un esempio di un isolotto di Langerhans contenente molte cellule morte e molti detriti. La tabella di ricerca "glow-over, glow-under" sulla destra visualizza l'intensità 0 in verde e la saturazione in blu. Barra della scala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
I risultati rappresentativi dell'imaging del calcio utilizzando il colorante indicatore Ca2+ permeabile alle cellule sono mostrati nella Figura 6. Nella Figura 6A, viene presentata un'immagine ad alta risoluzione di una fetta di tessuto pancreatico, contenente un'isolotto di Langerhans, tessuto acinare e un dotto pancreatico. Per una migliore distinzione, la parte endocrina, esocrina e duttale della fetta di tessuto pancreatico presentata nella Figura 6A sono colorate nella Figura 6B. L'uso di stimoli appropriati può discriminare funzionalmente tra diverse cellule insulari o cellule insulari e non insulari51. Le cellule beta risponderanno tipicamente a una stimolazione a impulsi quadrati da parte del glucosio con un aumento transitorio di [Ca2+]IC seguito da oscillazioni veloci del calcio su un plateau sostenuto (Figura 6C, pannello superiore).
Poiché tutte le cellule beta sono accoppiate in un unico, grande, sincizio funzionale, queste oscillazioni sono anche molto ben sincronizzate tra le diverse cellule mediante la diffusione di [Ca2+]IC onde 32,34,52,53,54 (Figura 7C). Le oscillazioni [Ca2+]IC più lente con un periodo di 5-15 minuti possono essere alla base delle oscillazioni veloci o addirittura essere il tipo predominante di risposta55,56. Lo stesso semplice protocollo può rivelare altri tipi di risposte, specialmente alla periferia delle isole (Figura 6C, pannello inferiore). Poiché queste cellule non sono sincronizzate con le cellule beta e rispondono con oscillazioni più veloci e irregolari che sono già presenti in condizioni di basso glucosio o con una diminuzione dell'attività, tali risposte sono altamente suggestive delle cellule non beta 21,32,57,58. Tuttavia, la loro caratterizzazione funzionale definitiva richiede protocolli più complessi con ulteriori passaggi di stimolazione o approcci alternativi, che sono discussi di seguito. Le risposte tipiche delle cellule acinari e duttali sono presentate rispettivamente nella Figura 6D e nella Figura 6E. Fare riferimento alla letteratura per maggiori dettagli sulle cellule acinari e duttali 22,23,35.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig06.jpg"> Figura 6: Risultati rappresentativi della dinamica del calcio in diversi tipi di cellule pancreatiche. (A) Un'immagine ad alta risoluzione di un'isolotto di Langerhans con tessuto circostante. Barra della scala = 100 μm. (B) Delineazione di parti distinte del tessuto pancreatico con tessuto acinare mostrato in giallo, un isolotto di Langerhans mostrato in rosso e un segmento dell'albero duttale in blu. Scala bar = 100 μm. (C) Tracce tipiche di dinamica del calcio in cellule beta e putative non beta durante la stimolazione con 12 mM di glucosio; 3 mM di glucosio è stato utilizzato per condizioni non stimolanti. I protocolli che possono essere utilizzati per una discriminazione più specifica delle cellule non beta sono descritti nella sezione di discussione. (D) Una traccia tipica della dinamica del calcio delle cellule acinari stimolate da 25 nM acetilcolina. (E) Una traccia tipica della dinamica del calcio delle cellule duttali stimolate da 1 mM di acido chenodesossicolico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Dopo il successo dell'imaging del calcio, i dati vengono prima esportati e corretti per lo sbiancamento da una combinazione di un adattamento esponenziale e lineare, come descritto nella sezione del protocollo. Una serie temporale prima e dopo la correzione dello sbiancamento è presentata nella Figura 7A. Successivamente, è possibile analizzare diversi parametri nella fase di attivazione e disattivazione della risposta e nella fase di plateau. Un ritardo nell'insorgenza dell'aumento di [Ca2+]IC dopo la stimolazione può essere misurato come rappresentato dal ritardoA nella Figura 7B e dall'eterogeneità dei ritardi tra le singole cellule (ritardoA1). Gli stessi parametri (ritardoD e ritardoD1) possono essere utilizzati per descrivere la fase di disattivazione. Dopo l'iniziale aumento transitorio [Ca2+]IC, la fase di plateau nella maggior parte delle cellule beta pancreatiche in un'isoletta è caratterizzata da oscillazioni IC ad alta frequenza relativamente regolari [Ca2+]. La fase di plateau può essere descritta analizzando i parametri funzionali classici. La presentazione schematica delle oscillazioni [Ca2+]IC durata, frequenza e percentuale di tempo attivo sono presentate nella Figura 7C. Nell'imaging del calcio con velocità di acquisizione superiori a 10 Hz, le onde di calcio che si diffondono ripetutamente attraverso l'isolotto possono anche essere riconosciute chiaramente (Figura 7C).
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig07.jpg"> Figura 7: Analisi dei dati delle serie temporali. (A) Correzione dei dati delle serie temporali per il fotosbiancamento. (B) Analisi dei ritardi nell'attivazione dopo stimolazione e nella disattivazione dopo la cessazione della stimolazione con 12 mM di glucosio. La durata della stimolazione è indicata dalla barra grigia chiara e ombreggiata nell'immagine. (C) Analisi di diversi parametri della fase di plateau: I) Durata dell'oscillazione determinata a mezza altezza, II) frequenza delle oscillazioni determinata da intervalli di inter-oscillazione. III) tempo attivo come prodotto della frequenza e della durata delle oscillazioni. I-IV) Ritardi tra oscillazioni in una data onda di oscillazioni che si diffondono attraverso l'isolotto di Langerhans determinati dai ritardi (Δt) nel tempo in cui una singola cella raggiunge la mezza altezza dell'oscillazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig07large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/Table%201%20(3).xlsx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questa tabella.</a>

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Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices

Presentiamo la preparazione di fette di tessuto pancreatico acuto e il loro utilizzo nella microscopia a scansione laser confocale per studiare la dinamica del calcio contemporaneamente in un gran numero di cellule vive, per lunghi periodi di tempo e con alta risoluzione spaziotemporale.

Microscopia a scansione laser confocale della dinamica del calcio in fette di tessuto pancreatico di topo acuto

The acute mouse pancreatic tissue slice is a unique in situ preparation with preserved intercellular communication and tissue architecture that entails ...

In combinazione con l'imaging del calcio a cellule vive, la tecnica della fetta di tessuto pancreatico acuto consente lo studio delle onde intercellulari e della connettività funzionale multicellulare con un'alta risoluzione per lunghi periodi di tempo. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è veloce, preserva l'architettura tissutale e riduce le limitate sollecitazioni enzimatiche e meccaniche mantenendo un'elevata resa di tessuto. Rilevando i cambiamenti funzionali e morfologici durante la progressione della malattia, questa tecnica aiuta la nostra comprensione delle malattie legate al pancreas, come il diabete.Questa tecnica di fetta di tessuto può essere applicata ai tessuti cerebrali, ipofisari e surrenali con particolare attenzione alla conservazione del contatto intercellulare, delle interazioni paracrine e dell'architettura tissutale. Per prepararsi all'iniezione di agarosio nel pancreas del topo, riempire una siringa da cinque millilitri con agarosio liquido a 40 gradi Celsius e dotare la siringa di un ago da 30 gauge. Dopo aver accuratamente coperto l'ago con un cappuccio, posizionare l'estremità dell'ago della siringa verso il basso, con l'intero volume di agarosio sotto la superficie dell'acqua, a bagnomaria di 40 gradi Celsius.Bolle una bottiglia di soluzione extracellulare con carbogeno, continuamente su ghiaccio, a 1,5 millilitri al minuto a pressione barometrica e temperatura ambiente per garantire ossigenazione e un pH di 7,4. Per eseguire l'iniezione di agarosio, posizionare un topo adulto eutanasizzato sotto uno stereomicroscopio e accedere all'addome del topo tramite laparotomia. Spostare delicatamente l'intestino sul lato sinistro per esporre il dotto biliare comune e utilizzare una pinza per sollevare leggermente l'estremità duodenale del dotto per individuare la papilla di Vater.Utilizzare un emostato per bloccare il dotto biliare alla papilla duodenale per prevenire la fuoriuscita dell'agarosio dal dotto nel duodeno e utilizzare una piccola pinza affilata per raggiungere sotto il dotto biliare comune per rompere la membrana che attacca il dotto al tessuto pancreatico. Dopo aver eliminato il più possibile grasso e tessuto connettivo dal condotto, posizionare il dotto perpendicolarmente sulle punte di una coppia di pinze più grandi e premendo saldamente sullo stantuffo della siringa, iniettare l'agarosio liquido viscoso nell'estremità prossimale del dotto biliare comune per 20-30 secondi. Quando il tessuto diventa biancastro e leggermente disteso rimuovere la siringa e versare lentamente 20 millilitri della soluzione extracellulare ghiacciata a bolle sul pancreas per raffreddare il tessuto e indurire l'agarosio.Per acquisire fette di tessuto pancreatico utilizzare pinze e forbici a taglio fine e duro per trasferire delicatamente il pancreas iniettato di agarosio in una capsula di Petri da 100 millimetri contenente 40 millilitri di soluzione extracellulare ghiacciata. Ruotare il piatto per risciacquare il tessuto e trasferire il pancreas in un secondo piatto di soluzione extracellulare ghiacciata. Utilizzare la pinza e le forbici per tagliare la sezione del pancreas biancastro e ben iniettata in un massimo di sei pezzi da 0,1 a 0,2 centimetri cubici e rimuovere qualsiasi tessuto connettivo e adiposo rimanente dai pezzi di tessuto.Posizionare i blocchi puliti in una capsula di Petri inferiore non appiccicosa da 35 millimetri contenente circa cinque millilitri di agarosio liquido a 40 gradi Celsius e posizionare immediatamente la capsula di Petri sul ghiaccio. Quando l'agarosio si è indurito, tenere la capsula di Petri a testa in giù sopra il coperchio di una capsula di Petri da 100 millimetri e utilizzare metà di una lama di rasoio per tagliare con cura il margine tra la parete laterale della capsula di Petri e l'agarosio per rimuovere l'agarosio dal piatto. Usa la lama del rasoio per tagliare singoli cubi, ciascuno contenente un blocco di tessuto di agarosio, dall'agarosio liberato e usa la colla cianoacrilata per attaccare i blocchi alla piastra campione di un vibratoma.Riempire la camera di taglio del vibratoma con 150 millilitri di soluzione extracellulare ghiacciata continuamente bollata con carbogeno. Avvitare la piastra campione sul vibratoma e montare una nuova lama di rasoio. Circondare la camera con ghiaccio e aggiungere due cubetti di ghiaccio da 10 millilitri di volume realizzati con soluzione extracellulare integrata con glucosio millimolare.Impostare l'affettatrice su 0,05-1 millimetro al secondo e 70 hertz, quindi iniziare a affettare per acquisire fette di agarosio spesse 140 micron con una superficie di 20-100 millimetri quadrati. Utilizzare un pennello fine per trasferire con cura ogni fetta in una capsula di Petri da 100 millimetri riempita con 40 millimetri di tampone HEPES integrato con sei millimolari di glucosio. Per la preparazione del colorante di calcio, sciogliere 50 microgrammi di colorante indicatore di calcio permeabile alle cellule, 7,5 microlitri di DMSO e 2,5 microlitri del poloxamer e 6,667 millilitri di HBS in un tubo con tappo a vite da 15 millilitri.Utilizzare una pipetta per miscelare accuratamente la soluzione per 20 secondi prima di immergere il tubo in una camera da bagno ad ultrasuoni e vorticare, ciascuno per 30 secondi. Quindi aliquota 3.333 millilitri della soluzione colorante indicatore di calcio risultante in una capsula di Petri da 5 millilitri per 10 fette di tessuto da etichettare. Per il caricamento del colorante, utilizzare un pennello sottile e morbido per trasferire fino a 10 fette di tessuto in ogni piatto di soluzione colorante e posizionare i piatti su uno shaker orbitale per 50 minuti a temperatura ambiente e 40 giri al minuto al riparo dalla luce.Alla fine dell'incubazione, trasferire fino a 20 fette macchiate in singole piastre di Petri da 60 millilitri riempite con HBS senza coloranti. Per l'imaging del calcio mediante microscopia confocale selezionare un ingrandimento di 20 o 25 volte e impostare la modalità di acquisizione per l'imaging time-lapse, il foro stenopeico da 100 a 200 micron e l'eccitazione e l'emissione per il fluoroforo utilizzato nell'esperimento. Montare la camera di registrazione e il sistema di perfusione sullo stadio a temperatura controllata del microscopio e posizionare l'ingresso e l'uscita sui bordi più lontani della camera di registrazione.Impostare le velocità di afflusso e deflusso su uno o due millilitri al minuto. Impostare la temperatura del sistema di profusione a 37 gradi Celsius e iniziare la profusione con la soluzione non stimolante. Per registrare la dinamica del calcio del tessuto, posizionare una singola fetta di tessuto nella camera di registrazione e immobilizzare il tessuto con un peso di platino a forma di U con una rete di nylon tesa.Utilizzare l'opzione del campo luminoso per individuare la struttura di interesse e utilizzare l'imaging dal vivo per posizionare le strutture studiate nel campo visivo. Per ottimizzare il rapporto segnale-rumore, regolare la potenza del laser, l'amplificazione del rilevatore e la media della linea mantenendo la potenza del laser minima. Regolare il piano focale a 15 micron sotto la superficie di taglio per evitare la registrazione da celle potenzialmente danneggiate e acquisire le immagini.Impostazione della frequenza di campionamento su uno o due hertz per consentire il rilevamento iniziale di singole oscillazioni e la registrazione di un'immagine ad alta risoluzione. Se disponibile, utilizzare un grafico online per ottenere un feedback immediato sulla risposta di preparazione, sull'illuminazione, sul fotosbiancamento e sulla deriva meccanica. Quando tutte le immagini sono state acquisite, salvare i dati per un'analisi successiva.Qui si può osservare un esempio di una fetta di tessuto ottimale in cui il colorante indicatore di calcio permeabile alle cellule è stato caricato con successo nella fetta di tessuto pancreatico. Al contrario, queste fette di tessuto non sono ottimali per l'imaging a causa di una penetrazione del colorante non riuscita, della mancanza di cellule insulari o di un'abbondanza di tessuto necrotico sulla superficie dei campioni. Le immagini ad alta risoluzione di una fetta di tessuto pancreatico possono essere utilizzate per delineare regioni distinte del tessuto pancreatico, come le isole di Langerhans, il tessuto acinare o il dotto pancreatico.Gli stimoli possono essere utilizzati per discriminare funzionalmente tra diverse cellule insulari o tra cellule insulari e non insulari. Ad esempio, le cellule beta in genere rispondono a una stimolazione del glucosio a impulsi quadrati esibendo un aumento transitorio del calcio intracellulare seguito da una rapida oscillazione del calcio su un plateau sostenuto. Al contrario, le cellule non beta rispondono con oscillazioni più veloci e irregolari.È inoltre possibile misurare un ritardo nell'insorgenza dell'aumento del calcio intracellulare dopo la stimolazione, nonché l'eterogeneità e i ritardi tra le singole cellule. Gli stessi parametri possono essere utilizzati per descrivere la fase di disattivazione. Qui si può osservare una presentazione schematica della durata, della frequenza e della percentuale di tempo attivo dell'oscillazione intracellulare del calcio.Quando si esegue l'imaging a velocità di acquisizione superiori a 10 hertz, le onde di calcio che si diffondono ripetutamente attraverso l'isolotto possono essere chiaramente riconosciute. Bloccare il dotto biliare comune il più vicino possibile al duodeno per evitare di occludere accidentalmente il ramo che sta entrando nel pancreas. Inoltre, non smettere di premere lo stantuffo durante l'iniezione perché l'agarosio si indurirà immediatamente nell'ago.La tecnica della fetta di tessuto pancreatico acuto del topo può anche essere utilizzata con il metodo patch clamp per studiare le correnti dei canali ionici e accedere alla citosi, nonché studi immunoistochimici e studi di segreteria.

Research

JoVE Journal

Biology

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Ricerca

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